千斤拔藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究Δ

林錦鋒，李清明，朱玉芳，陳浩桉（.廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣州　5080；.中山市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東中山　58437）

·藥物分析與檢定·

千斤拔藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究Δ

林錦鋒1＊，李清明2，朱玉芳1，陳浩桉1（1.廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣州510180；2.中山市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東中山528437）

目的：建立千斤拔藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：觀察千斤拔藥材性狀和顯微鑒別特征；采用薄層色譜法（TLC）對(duì)藥材中染料木苷和染料木素進(jìn)行定性鑒別；檢查藥材水分、總灰分和浸出物。采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定藥材中染料木苷和染料木素的含量：色譜柱為Thermo BETASIL C18，流動(dòng)相為乙腈-0.5%冰醋酸（梯度洗脫），流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為261 nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為10 μl。結(jié)果：千斤拔和大葉千斤拔的性狀和顯微鑒別特征顯著；染料木苷和染料木素的TLC斑點(diǎn)清晰，分離良好，陰性對(duì)照無(wú)干擾；藥材水分為3.69%～8.37%，總灰分為1.72%～6.74%，浸出物為5.89%～19.65%。染料木苷和染料木素檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為0.012 9～2.588 0、0.004 6～0.923 2 μg（r均為0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜3.0%；加樣回收率分別為99.63%～101.87%（RSD=0.82%，n=6）、97.19%～100.34%（RSD=1.23%，n=6）。結(jié)論：該標(biāo)準(zhǔn)可用于千斤拔藥材的質(zhì)量控制。

千斤拔；大葉千斤拔；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層色譜法；高效液相色譜法；染料木苷；染料木素

千斤拔始載于《植物名實(shí)圖考》，具有補(bǔ)脾胃、益肝腎、強(qiáng)腰膝、舒經(jīng)絡(luò)的功效［1］。千斤撥及其制劑在民間及臨床中應(yīng)用廣泛，特別是在治療婦科炎癥方面療效確切［2］。目前文獻(xiàn)中作為藥用的千斤拔主要有4種：蔓性千斤拔Moghania philippinensis（Merr.et Rolfe）Li、大葉千斤拔 M.macrophylla （Willd.）O.Kuntze、寬葉千斤拔M.latifolia Benth.、球穗千斤拔M.strobilifera（Linn.）Ait.［2］。2015年版《中國(guó)藥典》（四部）收載其植物來源包含千斤拔M.philippinessis（Merr.et Rolfe）Li、大葉千斤拔M.macrophylla（Willd.）O.Kuntze和繡毛千斤拔M.ferruginea（Wall.ex Benth.）Li 3種（注：前兩者《中國(guó)植物志》采用的拉丁名分別為Flemingia philippinessis Merr.et Rolfe、F.macrophylla（Willd.）Prain，而后者《中國(guó)植物志》未收載，千斤拔藥材拉丁屬名的不同，是由于不同文獻(xiàn)采用的植物分類方法的不同，筆者采用《中國(guó)植物志》的拉丁名）［3］，而各省、區(qū)的地方藥材標(biāo)準(zhǔn)收載的植物來源各有不同，如廣東和海南地方藥材標(biāo)準(zhǔn)收載千斤拔（蔓性千斤拔）一個(gè)種［1，4］，廣西和湖南地方藥材標(biāo)準(zhǔn)收載千斤拔（蔓性千斤拔）和大葉千斤拔兩個(gè)種［5-6］。由于《中國(guó)藥典》收載的繡毛千斤拔國(guó)內(nèi)未見分布且目前未形成大宗商品，故筆者主要以千斤拔F.philippinessis Merr.et Rolfe和大葉千斤拔F.macrophylla（Willd.）Prain為研究對(duì)象，研究其性狀、顯微鑒別、薄層色譜（TLC）、水分、總灰分、浸出物和含量測(cè)定項(xiàng)，從而建立一個(gè)相對(duì)完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為保障千斤拔藥材質(zhì)量提供依據(jù)。

1　材料

1.1儀器

1100型高效液相色譜儀，包括二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；Milli-Q Advantage A10型超純水處理系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；ATS4型薄層自動(dòng)點(diǎn)樣儀、Reprostar 3型薄層色譜成像儀（瑞士CAMAG公司）；LD5-10型低速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；CP225D型電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；BX51型生物顯微鏡（日本Olympus公司）；ED53型烘箱（德國(guó)Binder公司）；L9/11/B170型電阻爐（德國(guó)Nabertherm公司）。

1.2試劑

染料木苷對(duì)照品（批號(hào)：111709-200501，純度＞98%）、染料木素對(duì)照品（批號(hào)：111704-200501，純度＞98%）、千斤拔對(duì)照藥材（批號(hào)：121502-200501）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3藥材

千斤拔藥材（見表1）經(jīng)筆者鑒定為真品，其中17批為千斤拔F.philippinessis的根，5批為大葉千斤拔F.macrophylla的根。

表1　千斤撥來源Tab 1　Origin of F.philippinensis

2　方法與結(jié)果

2.1性狀

根據(jù)樣品實(shí)際情況并參照各地方標(biāo)準(zhǔn)描述，千斤拔和大葉千斤拔性狀有一定差異，故進(jìn)行了分列。

2.1.1千斤拔呈長(zhǎng)圓錐形，不分枝或少分枝，形似牛尾，長(zhǎng)10～60 cm，直徑0.5～1.5 cm。表面灰棕色或紅棕色，有細(xì)縱紋及橫長(zhǎng)皮孔樣斑痕；頂端有圓形疤痕和莖殘基，下部漸細(xì)。質(zhì)硬，斷面纖維性，皮部薄，棕紅色；木部黃白色或淺黃色，靠近根頭部或較粗者有的帶有深淺不均的灰藍(lán)色，具放射狀紋理。微具豆腥氣，味微甘、澀。

2.1.2大葉千斤拔呈長(zhǎng)圓錐形，有多數(shù)分枝，頭部常呈結(jié)節(jié)狀膨大，長(zhǎng)15～70 cm，直徑0.5～5 cm。表面灰棕色或紅棕色，有細(xì)縱紋及橫長(zhǎng)皮孔樣斑痕。質(zhì)硬，不易折斷。切面皮部薄，棕紅色；木部淡紅色或紅棕色，靠近根頭部或較粗者有的帶有深淺不均的灰藍(lán)色，具放射狀紋理。微具豆腥氣，味微甘、澀。

2.2顯微鑒別

千斤拔和大葉千斤拔的橫切面特征差異不大，故未進(jìn)行分列，其特征如下：樣品木栓層由數(shù)列至十?dāng)?shù)列切向延長(zhǎng)的類長(zhǎng)方形細(xì)胞構(gòu)成，排列整齊，壁略增厚，常含棕紅色至暗棕紅色物。皮層狹窄，由數(shù)列類橢圓形薄壁細(xì)胞構(gòu)成。韌皮部纖維成束或散在，壁厚；分泌細(xì)胞內(nèi)含黃棕色至紅棕色分泌物，單個(gè)散在或數(shù)個(gè)成群，斷續(xù)排列成數(shù)環(huán)，有時(shí)可與韌皮射線相間成“井”字形；薄壁細(xì)胞類橢圓形或類圓形，散有草酸鈣方晶。形成層明顯。木質(zhì)部導(dǎo)管單個(gè)散在或數(shù)個(gè)相連，略呈徑向排列，外側(cè)較稀疏，向內(nèi)漸密；木纖維成片，壁厚，木化；木射線寬1～10列細(xì)胞；有草酸鈣方晶散在；有的薄壁細(xì)胞或?qū)Ч軆?nèi)含黃棕色至紅棕色分泌物，詳見圖1。

帶狀皰疹是由潛伏在感覺神經(jīng)節(jié)的水痘—帶狀皰疹病毒被激活后引起的急性、病毒性皮膚病，當(dāng)機(jī)體免疫力低下、失治誤治、皮損面積過大時(shí)，帶狀皰疹愈后容易遺留PHN。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療在療程和療效方面優(yōu)勢(shì)并不顯著，同時(shí)因病程較長(zhǎng)患者可能需要長(zhǎng)期用藥，而有些藥物存在較大副作用，導(dǎo)致部分患者不能耐受而被迫停藥[4] 。

2.3TLC鑒別

取樣品粉末1 g（過2號(hào)篩），加濃氨溶液1 ml使?jié)櫇?，再加?0 ml，超聲（功率：300 W，頻率：40 kHz，下同）處理30 min，以半徑為18 cm、3 000 r/min離心5 min，取上清液，加稀HCl調(diào)pH至3～4，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次30 ml，合并乙酸乙酯提取液，水浴蒸干，加甲醇1 ml使溶解，作供試品溶液。另取染料木苷對(duì)照品和染料木素對(duì)照品適量，加甲醇制成染料木苷、染料木素質(zhì)量濃度均為0.5 mg/ml的混合對(duì)照品溶液。再取千斤拔對(duì)照藥材1 g，同供試品溶液制備方法制成對(duì)照藥材溶液。按TLC法［2015年版《中國(guó)藥典》（四部）］［7］試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇（8∶2，V/V）為展開劑，置于氨蒸氣飽和的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，于105℃加熱約3 min，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，詳見圖2。

2.4水分檢查

圖1　千斤拔顯微特征圖1.木栓層；2.皮層；3.草酸鈣方晶（位于韌皮部）；4.韌皮纖維；5.分泌細(xì)胞；6.韌皮射線；7.形成層；8.導(dǎo)管；9.木纖維；10.木射線；11.草酸鈣方晶Fig 1　Microscopic characteristics1.phellem layer；2.cortex；3.regular crystal；4.phloem fiber；5.secretory cells；6.phloem rays；7.cambium；8.catheter；9.xylom；10.xylem rays；11.regular crystal

圖2　薄層色譜圖1～22.千斤拔樣品（編號(hào)：1～22）；D.對(duì)照藥材；S.染料木素對(duì)照品（S1）和染料木苷對(duì)照品（S2）Fig 2　TLC chromatograms1-22.samples of F.philippinensis（No.1～22）；D.reference crude herb；S/reference substance of genistein（S1）and genistin（S2）

按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）水分測(cè)定法［3］項(xiàng)下方法測(cè)定樣品水分。結(jié)果表明，22批樣品水分在3.69%～8.37%范圍內(nèi)（見表2），故擬定千斤拔含水分不得過13.0%。

2.5總灰分檢查

按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）總灰分測(cè)定法［3］測(cè)定樣品灰分。結(jié)果表明，22批樣品總灰分在1.72%～6.74%范圍內(nèi)（見表2），其中3批超過5.0%的樣品明顯可見沙土未除盡，故擬定千斤拔總灰分不得過5.0%。

表2　千斤拔各項(xiàng)目測(cè)定結(jié)果Tab 2　Determination results of all items for F.philippinensis

2.6浸出物

按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）水溶性浸出物測(cè)定法項(xiàng)下的熱浸法［3］測(cè)定樣品浸出物。結(jié)果表明，21批樣品（1號(hào)樣品因樣品量不足未測(cè)）浸出物在5.89%～19.65%范圍內(nèi)（見表2），均值下浮20%為11.4%，故擬定千斤拔浸出物不得少于11.0%。

2.7含量測(cè)定

2.7.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱：Thermo BETASIL C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.5%冰醋酸（B），梯度洗脫（0～20 min，0→18%A；21～45 min，18%→30%A）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：261 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μl。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以染料木苷、染料木素峰計(jì)不少于3 000，各成分基線分離良好，分離度＞1.5，詳見圖3。

2.7.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取染料木苷對(duì)照品12.94 mg，置于10 ml量瓶中，加60%乙醇定容，制成染料木苷對(duì)照品貯備液。精密稱取染料木素對(duì)照品11.54 mg，置于25 ml量瓶中，加60%乙醇定容，制成染料木素對(duì)照品貯備液。分別精密吸取上述兩種對(duì)照品貯備液各5.0 ml，置于25 ml量瓶中，加60%乙醇定容，即得混合對(duì)照品溶液①。精密吸取混合對(duì)照品溶液①5.0 ml，置于100 ml量瓶中，加60%乙醇定容，制成染料木苷、染料木素質(zhì)量濃度分別為12.94、4.616 μg/ml的混合對(duì)照品溶液。

2.7.3供試品溶液的制備取樣品粉末（過3號(hào)篩）0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇25 ml，稱定質(zhì)量，浸漬30 min，加熱回流1.5 h，放冷，稱定質(zhì)量，用60%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.7.4線性關(guān)系考察分別精密量取“2.7.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液①1、1、2.5、1、1、2、5、10 ml，加60%乙醇分別稀釋至200、100、100、20、10、10、10、10 ml，制成系列混合對(duì)照品溶液。精密量取上述系列混合對(duì)照品溶液各10 μl，按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以染料木苷、染料木素進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得染料木苷、染料木素回歸方程分別為y=4810.3x+14.478（r=0.999 9）、y= 6 917.6x+11.719（r=0.999 9）。結(jié)果表明，染料木苷、染料木素檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為0.012 9～2.588 0、0.004 6～0.923 2 μg。

2.7.5精密度試驗(yàn)取“2.7.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，染料木苷、染料木素峰面積的RSD分別為0.4%、1.2%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取“2.7.3”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：6）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、16、24、36、48 h時(shí)按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，染料木苷、染料木素峰面積的RSD分別為0.9%、2.1%（n=8），表明供試品溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7.7重復(fù)性試驗(yàn)取同一批樣品（編號(hào)：6）適量，按“2.7.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，染料木苷、染料木素含量平均值分別為0.495%、0.161%，RSD分別為1.2%、2.4%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.7.8加樣回收率試驗(yàn)取已知含量樣品（編號(hào)：6）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量的染料木苷、染料木素對(duì)照品，按“2.7.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品含量并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.7.9樣品含量測(cè)定取22批樣品各適量，分別按“2.7.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品含量。結(jié)果，染料木苷和染料木素的平均總含量為0.065 1%。其中22號(hào)為自采樣品，新鮮曬制后即進(jìn)行含量測(cè)定，其含量明顯大大高于其他樣品，剔除該批結(jié)果后的21批樣品平均總含量為0.058 9%，以該值下調(diào)20%則為0.047%，故擬定本品含染料木苷和染料木素的總含量不得少于0.045%，詳見表2。

圖3　高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.供試品；1.染料木苷；2.染料木素Fig 3　HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；1.genistin；2.genistein

3　討論

因染料木素和染料木苷兩個(gè)成分極性相差較大，采用硅膠G薄層板時(shí)應(yīng)用了多種展開劑均不能使上述兩個(gè)成分既有較適合的比移值又能達(dá)到較好的分離度，結(jié)果不理想，因二者是黃酮類成分，改用聚酰胺薄膜展開，以乙酸乙酯-甲醇（8∶2， V/V）為展開劑，結(jié)果比移值和分離度均較理想。故筆者采用聚酰胺薄膜作為薄層色譜鑒別用的薄層板。

表3　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab 3　Results of recovery tests（n=6）

千斤拔中的主要化學(xué)成分為黃酮類成分、蒽醌類成分、揮發(fā)性成分、香豆素類和甾醇類成分等［7-9］，其中染料木苷和染料木素兩種大豆異黃酮類成分是其中含量較高的黃酮類成分，故選定染料木苷與染料木素作為千斤拔藥材含量測(cè)定的指標(biāo)，因二者可能通過糖基化反應(yīng)或水解反應(yīng)相互轉(zhuǎn)化，故制定了二者的總量限度。

提取方法中筆者考察了超聲提取和加熱回流提取兩種方法，提取溶劑考察了50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇，提取時(shí)間考察了0.5、1、1.5、2 h，提取溶劑用量考察了10、25、50 ml，結(jié)果最優(yōu)提取條件為60%乙醇25 ml加熱回流提取1.5 h。

綜上所述，本研究所建標(biāo)準(zhǔn)可用于千斤拔藥材的質(zhì)量控制。

［1］廣東省食品藥品監(jiān)督管理局.廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)：第一冊(cè)［S］.廣州：廣東科學(xué)技術(shù)出版社，2004：17.

［2］任朝琴，戴先芝，劉圓.千斤拔藥材資源開發(fā)與利用的調(diào)查報(bào)告［J］.西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，37 （4）：610.

［3］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：四部［S］.2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：57、103、202、418.

［4］海南省食品藥品監(jiān)督管理局.海南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)：第一冊(cè)［S］.?？冢耗虾３霭婀?，2011：177.

［5］廣西壯族自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局.廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：第一卷［S］.南寧：廣西科學(xué)技術(shù)出版社，2008：42.

［6］湖南省食品藥品監(jiān)督管理局.湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)［S］.長(zhǎng)沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社，2009：220.

［7］李莉，秦民堅(jiān)，張麗霞，等.千斤拔屬植物的化學(xué)成分與生物活性研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2009，24（4）：203.

［8］黃艷菲，丁玲，李艷丹，等.三種千斤拔的化學(xué)成分預(yù)分析和薄層鑒定［J］.西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，37（4）：603.

［9］喬雪，卓燊，楊子明，等.千斤拔屬植物化學(xué)成分及藥理作用的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展［J］.環(huán)球中醫(yī)藥，2015，8（12）：1 546.

（編輯：張靜）

Study on the Quality Standard of Flemingia philippinensis

LIN Jinfeng1，LI Qingming2，ZHU Yufang1，CHEN Hao’an1（1.Guangdong Institute for Drug Control，Guangzhou 510180，China；2.Zhongshan Institute for Food and Drug Control，Guangdong Zhongshan 528437，China）

OBJECTIVE：To establish the quality standard of Flemingia philippinensis.METHODS：The properties and microscopic characteristics were observed；TLC was adopted for qualitative identification of genistin and genistein；the moisture，total ash and extract were detected；HPLC was adopted for contents determination of genistin and genistein：the column was Thermo BETASIL C18with mobile phase of Acetonitrile-0.5%glacial acetic acid（gradient elution）at a flow rate of 1.0 ml/min，the detection wavelength was 261 nm，column temperature was 25℃，and the injection volume was 10 μl.RESULTS：The properties and microscopic characteristics of F.philippinensis and F.macrophylla showed strong specificity.TLC spots of genistin and genistein we-re clear and well separated，with no interference in negative control.The moisture was 3.69%-8.37%，total ash was 1.72%-6.74%，and extract was 5.89%-19.65%.The linear range was 0.012 9-2.588 μg for genistin（r=0.999 9）and 0.004 6-0.923 2 μg for genistein （r=0.999 9）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 3.0%；recoveries were 99.63%-101.87% （RSD=0.82%，n=6）and 97.19%-100.34%（RSD=1.23%，n=6）.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate and specific，and can be used for the quality control of F.philippinensis.

Flemingia philippinessis；Flemingia macrophylla；Quality standard；TLC；HPLC；Genistin；Genistein

R917；927文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1001-0408（2016）24-3400-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.24.27

國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局“進(jìn)口藥材標(biāo)準(zhǔn)增修訂”專項(xiàng)課題（No.JKYC2012-2）；廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2013B04020 0029）

＊副主任中藥師，碩士。研究方向：中藥質(zhì)量分析。電話：020-81863096。E-mail：linchina@163.com

2016-01-25

2016-03-02）