牛胰脂肪酶交連酶聚體的制備及性能研究

崔建東，劉容麟（河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北科技大學(xué)，河北石家莊050018）

牛胰脂肪酶交連酶聚體的制備及性能研究

崔建東，劉容麟
（河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北科技大學(xué)，河北石家莊050018）

以牛胰脂肪酶（cattle pancreatic lipase，CPL）為研究對(duì)象，采用交聯(lián)酶聚體技術(shù)，研究交聯(lián)酶聚體脂肪酶（CPLCLEAs）的制備條件、催化性能和酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明，交聯(lián)酶聚體脂肪酶制備的最優(yōu)制備條件為：硫酸銨飽和度80%，戊二醛終濃度1.5%，交聯(lián)時(shí)間1 h，在此條件下，所得CPL-CLEAs最高酶活回收率為90%。CPL-CLEAs的最適催化溫度是60℃，與游離脂肪酶相比，CPL-CLEAs的最適催化溫度提高了10℃，且溫度穩(wěn)定性、儲(chǔ)存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性均有所提高。重復(fù)使用7次后，CPL-CLEAs仍能保持初始酶活的43%。

交聯(lián)酶聚體技術(shù)，脂肪酶，固定化酶

脂肪酶作為一種天然的、綠色的生物催化劑，不僅能催化酯合成、酯交換、聚合物合成等，而且可用于催化多肽的合成以及手性化合物的拆分等反應(yīng)，如可以利用某些脂肪酶的立體專一性催化某些化學(xué)方法難以完成的旋光異構(gòu)體拆分和手性藥物合成反應(yīng)［1］。在食品領(lǐng)域，脂肪酶也有廣泛的應(yīng)用，如在食用油脂工業(yè)上，脂肪酶可以催化酯交換、酯轉(zhuǎn)移、水解等反應(yīng)；在乳品工業(yè)中脂肪酶可用于乳酯水解，包括奶酪和奶粉風(fēng)味的增強(qiáng)、奶酪的熟化、代用奶制品的生產(chǎn)、奶油及冰淇淋的酯解改性等［2］。在食品添加劑工業(yè)中主要用于酯類添加劑的合成［2］。

但游離的脂肪酶在應(yīng)用過程中，表現(xiàn)出不穩(wěn)定、易失活以及難以回收利用的問題，限制了該酶的應(yīng)用，為了提高脂肪酶的工業(yè)適用性，脂肪酶的固定化已經(jīng)受到極大的關(guān)注。例如，通過將豬胰脂肪酶固定在離子液體修飾的介孔二氧化硅上，所得的固定化脂肪酶的酶活力和穩(wěn)定性比游離酶均得到顯著提高［3］。梁靜鵑等［4］將脂肪酶固定在硅膠上，并研究了該固定化脂肪酶在離子液體中催化合成生物柴油的性能，結(jié)果表明，固定化脂肪酶的穩(wěn)定性比游離酶顯著提高，且離子液體的添加有效提高了生物柴油的轉(zhuǎn)化率。盡管將脂肪酶固定到載體上能有效改善脂肪酶的催化穩(wěn)定性。但是載體的存在不但增加了固定化的成本，而且易產(chǎn)生傳質(zhì)擴(kuò)散阻礙，降低酶的催化效率［5］。近年來，無載體固定化酶技術(shù)成為研究的熱點(diǎn)。交聯(lián)酶聚體（CLEAs）是一種研究最多的無載體固定化技術(shù)，其制備過程包括沉淀和交聯(lián)兩步，即：將酶蛋白進(jìn)行沉淀后，利用戊二醛使酶分子交聯(lián)成酶聚體形式。CLEAs具有操作簡(jiǎn)便、酶回收率高、成本低廉等特點(diǎn)，極具開發(fā)價(jià)值［6-8］。

因此，本研究利用CLEAs技術(shù)制備穩(wěn)定性好、酶活回收率高、能重復(fù)使用的牛胰脂肪酶CLEAs，優(yōu)化了制備參數(shù)；并研究了脂肪酶CLEAs的催化性能。旨為脂肪酶的工業(yè)化應(yīng)用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛胰脂肪酶（CPL，15～25 U/mg）、對(duì)硝基苯酚、對(duì)硝基苯酚乙酸酯 阿拉丁試劑（上海）有限公司；50%戊二醛（v/v） 北京百靈威科技有限公司；聚乙二醇辛基苯基醚（Ttiton X-100） 天津博迪化工股份有限公司；其他試劑 均為分析純。

HZX-110型電子天平 福州華志科學(xué)儀器有限公司；恒溫多頭磁力攪拌器 金壇市榮華儀器廠；HC-2064型高速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；742型紫外分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；DK-98-II型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；S-4800-I型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡日本HITACHI。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 交聯(lián)酶聚體脂肪酶（CPL-CLEAs）的制備 取0.561 g硫酸銨加入到含有1 mL 0.1 g/mL的牛胰脂肪酶溶液的7 mL離心管中，使硫酸銨的飽和度為80%，之后加入50%戊二醛溶液，使體系戊二醛終質(zhì)量濃度為1.5%，常溫下分別交聯(lián)1 h，然后7000×g離心5 min，棄去上清，用50 mmol/L磷酸緩沖液（pH7.5）洗滌3次，7000×g下離心5 min，沉淀重新均勻懸浮在50 mmol/L磷酸緩沖液（pH7.5）中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 分別在410 nm下測(cè)定質(zhì)量濃度為1.2、2.4、3.6、4.8、6.0 mg/L的對(duì)硝基苯酚的吸光值，以吸光值為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 游離牛胰脂肪酶和CPL-CLEAs酶活測(cè)定 利用對(duì)硝基苯酚法（紫外分光光度法）測(cè)定游離牛胰脂肪酶酶活［9］。取4 mL 0.09 g/L的對(duì)硝基苯酚乙酸酯（含有50 mmol/L，pH7.5磷酸緩沖液，體積分?jǐn)?shù)0.2% Triton X-100），加入1 mL 0.1 g/L牛胰脂肪酶酶液，37℃恒溫水浴5 min，用分光光度計(jì)在410 nm測(cè)定吸光值，空白對(duì)照為含有等量滅活酶液的上述體系。根據(jù)對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活。CPL-CLEAs的酶活測(cè)定條件與游離脂肪酶相似，只是把游離酶換成CPL-CLEAs。一個(gè)酶活力單位定義為每分鐘催化對(duì)硝基苯酚乙酸酯生成1 μmol對(duì)硝基苯酚所用的酶量，酶活回收率及酶活殘留率計(jì)算公式如下［10］：

酶活回收率（%）=交聯(lián)酶聚體酶活/制備交聯(lián)酶聚體所用游離酶酶活×100

酶活殘留率（%）=處理后殘留的酶活/處理前酶活×100

相對(duì)酶活（%）是在考察最適催化溫度時(shí)，將某一溫度下測(cè)定的脂肪酶酶活最高值記為100%，其他溫度下測(cè)定的酶活與最高酶活的比值。

1.2.4 CPL-CLEAs的形態(tài)觀察 CPL-CLEAs樣品被真空冷凍干燥后，在真空條件下噴鉑金后利用電子掃描顯微鏡檢測(cè)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次，利用SAS軟件（v8.0）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6 牛胰脂肪酶交聯(lián)酶聚體制備條件的優(yōu)化CLEAs的制備包括沉淀和交聯(lián)兩步，制備工藝參數(shù)的優(yōu)化如下。

1.2.6.1 沉淀劑硫酸銨飽和濃度優(yōu)化 分別取0.313、0.390、0.472、0.561、0.662 g硫酸銨加入到5只含有1 mL 0.1 g/mL的牛胰脂肪酶溶液（用pH7.5的50 mmol/L磷酸緩沖液配制）的7 mL離心管中，使硫酸銨的飽和濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%，之后加入質(zhì)量濃度為50%的戊二醛10 μL，常溫下交聯(lián)1 h，7000×g下離心5 min，棄去上清，7000×g下離心5 min，沉淀重新均勻懸浮在50 mmol/L磷酸緩沖液（pH7.5）中，用紫外分光光度法測(cè)定酶活，計(jì)算酶活回收率。

1.2.6.2 交聯(lián)劑戊二醛質(zhì)量濃度優(yōu)化 向5只含有1 mL 0.1 g/mL牛胰脂肪酶溶液（用50 mmol/L磷酸緩沖液配制）的7 mL離心管中分別加入0.561 g硫酸銨，使硫酸銨飽和濃度為80%，然后分別加入質(zhì)量濃度為50%的戊二醛10.1、20.4、30.9、41.7、52.6 μL，使得體系中戊二醛的質(zhì)量濃度分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，常溫下交聯(lián)1 h，7000×g下離心5 min，棄去上清，沉淀用50 mmol/L磷酸緩沖液（pH7.5）洗滌3次，7000×g下離心5 min，沉淀重新均勻懸浮在50 mmol/L磷酸緩沖液（pH7.5）中，用紫外分光光度法測(cè)定酶活，計(jì)算酶活回收率。

1.2.6.3 交聯(lián)時(shí)間的優(yōu)化 將0.561 g硫酸銨分別加入到5只含有1 mL 0.1 g/mL的牛胰脂肪酶溶液（用pH7.5的50 mmol/L磷酸緩沖液配制）的7 mL離心管中，使硫酸銨的飽和濃度為80%，之后加入質(zhì)量濃度為50%的戊二醛溶液，使體系戊二醛質(zhì)量濃度為1.5%，常溫下分別交聯(lián)0.5、1、1.5、2、2.5 h，7000×g離心5 min，棄去上清，用50 mmol/L磷酸緩沖液（pH7.5）洗滌3次，7000×g下離心5 min，沉淀重新均勻懸浮在50 mmol/L磷酸緩沖液（pH7.5）中，用紫外分光光度法測(cè)定酶活，計(jì)算酶活回收率。

1.2.7 最適催化溫度的測(cè)定 分別測(cè)定游離酶和CPL-CLEAs在30、40、50、60、70℃下的酶活，酶活測(cè)定方法同1.2.3。

1.2.8 動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定 取一定量的酶樣品測(cè)定不同底物濃度（120、110、100、90、80 μmol/L對(duì)硝基苯酚乙酸酯）下的酶促反應(yīng)速率，利用雙倒數(shù)法得到Km和Vmax。

1.2.9 CPL-CLEAs穩(wěn)定性的研究 CPL-CLEAs的穩(wěn)定性研究主要包括pH穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性、儲(chǔ)藏穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性，以游離酶作為對(duì)照。

1.2.9.1 溫度穩(wěn)定性的測(cè)定 將游離酶和CPL-CLEAs 在60℃水浴處理，每隔1 h，分別取出1 mL游離酶和1 mL懸浮的CPL-CLEAs，游離酶直接測(cè)酶活，CPLCLEAs先在7000×g離心5 min，然后用1 mL磷酸緩沖液懸浮，測(cè)定酶活。計(jì)算不同處理時(shí)間的酶活殘留率［8］。

1.2.9.2 儲(chǔ)存穩(wěn)定性測(cè)定 將游離酶，CPL-CLEAs懸浮液分別儲(chǔ)存在25℃，每隔3 d測(cè)定一次酶活，計(jì)算酶活殘留率。

1.2.9.3 操作穩(wěn)定性測(cè)定 分別將游離酶、CPLCLEAs懸浮液在25℃，200 r/min振蕩條件下，每隔3 d測(cè)定一次酶活，計(jì)算酶活殘留率［11］。

1.2.9.4 CPL-CLEAs重復(fù)使用性的測(cè)定 取1 mL CPL-CLEAs懸浮液，在37℃條件下催化底物對(duì)硝基苯酚乙酸酯生成對(duì)硝基苯酚，反應(yīng)5 min后，離心分離出固定化酶，用50 mmol/L磷酸緩沖液（pH7.5）洗滌3次后，7000×g離心5 min，在沉淀（CPL-CLEAs）中加入新的底物溶液進(jìn)行第二輪反應(yīng)，依此分批催化，每次催化反應(yīng)后分別檢測(cè)固定化酶剩余的酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 CPL-CLEAs制備條件的優(yōu)化

2.1.1 對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線 所得對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=8.7457X-0.1607，R2=0.9999。

2.1.2 硫酸銨飽和濃度對(duì)CPL-CLEAs酶活回收率的影響 從圖1中可以看出，隨著硫酸銨飽和濃度的增大酶活回收率逐漸增加，當(dāng)飽和濃度達(dá)80%時(shí)，牛胰脂肪酶的回收率達(dá)到最高，之后小幅度降低。這可能是由于隨著硫酸銨飽和濃度的增加，越來越多的鹽離子與酶蛋白競(jìng)爭(zhēng)溶液中的水分子，破壞酶蛋白表面的水化膜，降低其溶解度，使之從溶液中沉淀出來，當(dāng)大部分酶蛋白析出后，再繼續(xù)增加硫酸銨，析出的酶蛋白就越來越少，并且高濃度的硫酸銨使得溶液pH酸性增強(qiáng)，導(dǎo)致部分酶蛋白會(huì)變性失活，因而又開始出現(xiàn)下降趨勢(shì)［12］。

圖1 硫酸銨飽和濃度對(duì)CPL-CLEAs酶活回收率影響Fig.1 The effect of（NH4）2SO4concentration on activity recovery of CPL-CLEAs

2.1.3 戊二醛濃度（質(zhì)量濃度）對(duì)CPL-CLEAs酶活回收率的影響 從圖2可以看出，隨著戊二醛濃度的增加，酶活回收率逐漸升高，當(dāng)體系中的戊二醛濃度為1.5%時(shí)，酶活回收率達(dá)到最高，為90%。之后隨著戊二醛濃度的增加，酶活回收率開始下降。戊二醛一方面是蛋白的交聯(lián)劑，可以將蛋白表面的賴氨酸殘基交聯(lián)起來，但另一方面又是蛋白的變性劑；濃度低時(shí)，難以將大多數(shù)酶分子交聯(lián)固定，導(dǎo)致大多數(shù)酶分子泄漏到上清中，使固定化酶的酶活回收率降低；而過量的戊二醛可以進(jìn)入酶分子的活性中心，破壞酶的活性中心結(jié)構(gòu)，使酶失活［13］。

圖2 戊二醛濃度對(duì)CPL-CLEAs酶活回收率影響Fig.2 The effect of glutaraldehyde concentration on enzyme recovery of CPL-CLEAs

2.1.4 交聯(lián)時(shí)間對(duì)CPL-CLEAs酶活回收率的影響

從圖3可知，交聯(lián)時(shí)間在1 h時(shí)，酶活回收率達(dá)到最大，為90%，此時(shí)大部分酶都已經(jīng)交聯(lián)在一起，隨著時(shí)間的增加，酶蛋白長(zhǎng)時(shí)間的與戊二醛接觸，酶活性中心更易受到戊二醛的破壞，導(dǎo)致酶失活，酶蛋白會(huì)受到一定破壞，時(shí)間越長(zhǎng)，酶活損失越大［14］。

圖3 交聯(lián)時(shí)間對(duì)CPL-CLEAs酶活回收率的影響Fig.3 The effect of cross-linking time on activity recovery of CPL-CLEAs

2.2 交聯(lián)酶聚體脂肪酶的形態(tài)觀察

圖4 CPL-CLEAs的形態(tài)Fig.4 Morphology of CPL-CLEAs

圖4是掃描電鏡觀察的固定化酶的圖片。從圖4中可以看出，制備的CPL-CLEAs的顆粒非常?。▓D4a），呈現(xiàn)疏松多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖4b）。這種疏松多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)是由于戊二醛使酶蛋白分子以共價(jià)鍵結(jié)合，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)使得制備的CPL-CLEAs具有優(yōu)良的穩(wěn)定性和一定的機(jī)械強(qiáng)度［15］。同時(shí)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)還提高了固定化酶的表面積，提高了酶與底物的接觸機(jī)會(huì)，使底物更容易進(jìn)入酶的活性中心發(fā)生酶促反應(yīng)，因而使CPL-CLEAs具有較高的催化活性。

2.3 最適催化溫度和動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.3.1 最適催化溫度 由圖5可知，游離脂肪酶的最適催化溫度為50℃，交聯(lián)酶聚體脂肪酶的最適催化溫度為60℃。且交聯(lián)酶聚體脂肪酶對(duì)高溫的適用范圍變寬；當(dāng)催化溫度由50℃升高至70℃時(shí)，游離酶的相對(duì)酶活下降至60%，而交聯(lián)酶聚體脂肪酶的相對(duì)酶活僅下降至90%。因此，交聯(lián)酶聚體脂肪酶比游離脂肪酶具有更好的溫度適用性。

圖5 游離酶和交聯(lián)酶聚體脂肪酶的最適催化溫度Fig.5 The optimal temperature of CPL and CPL-CLEAs

2.3.2 動(dòng)力學(xué)常數(shù) 由表1可知，交聯(lián)酶聚體脂肪酶的Km值比游離脂肪酶的大，表明游離脂肪酶更易與底物結(jié)合，并且與底物結(jié)合后形成的中間體結(jié)合力也相對(duì)大，不易于解離，因此游離脂肪酶的Vmax比交聯(lián)酶聚體脂肪酶的大［16］。而交聯(lián)酶聚體脂肪酶中由于酶分子各個(gè)亞基受共價(jià)鍵鏈接影響，其構(gòu)象也發(fā)生一定變化，使活性位點(diǎn)的構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致酶活性中心與底物的親和力有所下降；而且交聯(lián)酶聚體脂肪酶中酶分子以超分子狀態(tài)聚集到一起，導(dǎo)致底物難以進(jìn)入交聯(lián)酶聚體脂肪酶的活性中心，表現(xiàn)出Vmax降低。

表1 游離脂肪酶和交聯(lián)酶交聯(lián)酶聚體脂肪酶的Vmax和KmTable1 Vmaxand Kmof CPL and CPL-CLEAs

2.4 交聯(lián)酶聚體脂肪酶的穩(wěn)定性

2.4.1 溫度穩(wěn)定性 從圖6可以看出，游離脂肪酶在60℃處理5 h后酶活殘留率僅能保持75%，但是，交聯(lián)酶聚體脂肪酶在相同條件下處理5 h后酶活幾乎沒有損失。這可能是由于交聯(lián)酶聚體脂肪酶中由于共價(jià)鍵的存在阻止了酶分子的伸展變形以及分子自我變性［17］，使得酶結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。

圖6 游離脂肪酶和交聯(lián)酶聚體脂肪酶的溫度穩(wěn)定性Fig.6 Thermal stability of CPL and CPL-CLEAs

2.4.2 儲(chǔ)存穩(wěn)定性 從圖7可以看出，游離脂肪酶在25℃下儲(chǔ)存到第12 d時(shí)酶活僅剩43%，但是，交聯(lián)酶聚體脂肪酶仍能保留80%的酶活，顯示出良好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。這可能由于脂肪酶在戊二醛的作用下，脂肪酶表面的活性基團(tuán)互相鏈接后，形成了穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，這種穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)對(duì)酶的活性中心有一定的保護(hù)作用，使其經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存后，仍然可以保持較高酶活力［18］。

圖7 游離脂肪酶和交聯(lián)酶聚體脂肪酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性Fig.7 Storage stablility of CPL and CPL-CLEAs

2.4.3 操作穩(wěn)定性 從圖8中可以看出，游離脂肪酶在200 r/min振蕩條件下維持12 d時(shí)，酶活殘留率僅剩13%。而在同樣的條件下維持12 d，交聯(lián)酶聚體脂肪酶酶活殘留率能保持63%。這可能是由于在高剪切力的作用下，酶分子構(gòu)象更容易發(fā)生變化，使酶變性失活。但將酶分子間交聯(lián)固定化后，由于固定化后的酶分子構(gòu)象更趨于剛性，不易發(fā)生變化，使酶構(gòu)象更穩(wěn)定，從而可以保持較高酶活力［18-19］。

圖8 游離酶和交聯(lián)酶聚體脂肪酶的操作穩(wěn)定性Fig.8 Operation stability of CPL and CPL-CLEAs

2.4.4 重復(fù)使用性 從圖9可知，交聯(lián)酶聚體脂肪酶重復(fù)使用7次，酶活殘留率仍能保持43%。說明交聯(lián)酶聚體脂肪酶具有較好的重復(fù)使用效果。相對(duì)于游離酶而言，交聯(lián)酶聚體脂肪酶可以更容易的從反應(yīng)液中分離出來用于下一循環(huán)，從而減少回收過程中酶的損失，提高工業(yè)化應(yīng)用效果。

圖9 交聯(lián)酶聚體脂肪酶的重復(fù)使用性Fig.9 Reusability of CPL-CLEAs

3 結(jié)論

本研究制備了牛胰脂肪酶交聯(lián)酶聚體，獲得的最適制備條件是：硫酸銨飽和濃度80%，戊二醛質(zhì)量濃度1.5%，交聯(lián)時(shí)間1 h，在此條件下，獲得的最大酶活回收率達(dá)到90%。與游離脂肪酶相比，交聯(lián)酶聚體脂肪酶在60℃處理5 h后酶活幾乎沒有損失，而游離脂肪酶只能保持75%的初始酶活；交聯(lián)酶聚體脂肪酶在25℃下儲(chǔ)藏12 d后仍能保持初始酶活的80%，但游離脂肪酶只能保持43%。在持續(xù)的12 d振蕩條件下，交聯(lián)酶聚體脂肪酶能保持初始酶活的63%，而游離脂肪酶只有13%。在重復(fù)使用7次后，交聯(lián)酶聚體脂肪酶酶活殘留率仍能保持43%。上述結(jié)果表明這種固定化酶方法在工業(yè)應(yīng)用中具有較好的實(shí)用前景。

［1］許建和.生物催化工程［M］.上海：華東理工大學(xué)出版社，2008.

［2］劉海洲，吳小飛，牛佰慧，等.脂肪酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用與研究進(jìn)展［J］.糧食加工，2008，33（5）：55-57.

［3］鄒彬，初旭明，張洋，等.離子液體修飾的SBA-16材料在豬胰脂肪酶固定化中的應(yīng)用［J］.生物加工過程，2014（12）：6-11.

［4］梁靜鵑，楊立鵬，韓鈞，等.固定化脂肪酶在離子液體中催化合成生物柴油［J］.可再生能源，2012，30：72-77.

［5］Zhang W W，Yang X L，Jia J Q，et al.Surfactant-activated magnetic cross-linked enzyme aggregates（magnetic CLEAs）of Thermpmyces lanuginosus lipase for biodiesel production［J］.Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2015，115：3-89.

［6］Xu D Y，Yang Zh.Cross-linked tyrosinase aggregates for elimination of phenolic compounds from wastewater［J］.Chemosphere，2013，92（4）：391-398.

［7］Yu HW，Chen H，Wang X，et al.Cross-linked enzyme aggregates（CLEAs） with controlled particles：Application to Candida rugosa lipase［J］.Molecular Catalysis，2006，43：124-127.

［8］馬雷猛，貴莉莉，王飛，等.添加納米粒子對(duì)脂肪酶交聯(lián)酶聚集體活性及結(jié)構(gòu)的影響［J］.北京化工大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，42 （2）：83-88.

［9］Wilson L，F(xiàn)ern＇andez-Lorente G，F(xiàn)ern＇andez-Lafuente R.CLEAs of lipases and poly-ionic polymers：A simple way of preparing stable biocatalysts with improved properties［J］.Enzyme and Microbial Technology，2006，39：750-755.

［10］孫立梅，李連連，崔建東.牛血清白蛋白輔助交聯(lián)對(duì)苯丙氨酸解氨酶交聯(lián)酶聚體影響的研究［J］.食品工業(yè)科技，2013，13：44-47.

［11］邢肖肖，王夢(mèng)凡，齊崴，等.β-半乳糖苷酶交聯(lián)酶聚體的制備及酶學(xué)性質(zhì)研究［J］.食品工業(yè)科技，2014，35（23）：158-167.

［12］李連連，崔建東.以大孔硅膠為載體的苯丙氨酸解氨酶交聯(lián)酶聚體的制備及性質(zhì)研究［J］.食品工業(yè)科技，2014，35（11）：160-165.

［13］Cui J D，Zhang S，Sun L M.Cross-linked enzyme aggregates of phenylalanine ammonia lyase：novel biocatalysts for synthesis of L-Phenylalanine［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，2012，167（4）：835-844.

［14］Moon II Kim，Jungbae Kim，Jinwoo Lee.One-dimensional crosslinked enzyme aggregates in SBA-15：Superior catalytic behavior to conventional enzyme immobilization［J］.Microporous and Mesoporous Materials，2008，101：18-23.

［15］Mengfan Wang，Wei Qi，Qingxin Yu，et al.Cross-linking enzyme aggregates in the macropores of silica gel：A practical and efficient method for enzyme stabilization［J］.Biochemical Engineering Journal，2010，52：168-174.

［16］劉娟，楊楠楠，姜愛莉.固定化脂肪酶的制備及其酶學(xué)性質(zhì)的研究［J］.油脂化學(xué)，2013，38（1）：44-47.

［17］石蓮蓮.固載化脂肪酶交聯(lián)酶聚集體的制備及應(yīng)用［D］.天津：河北工業(yè)大學(xué)，2013.

［18］王夢(mèng)凡.新型交聯(lián)酶聚體技術(shù)及其在蛋白組學(xué)與生物催化中的應(yīng)用［D］.天津：天津大學(xué)，2011.

［19］常凱，王紅英，孫井輝.磁性殼聚糖微球固定化脂肪酶的研究［J］.大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，30（1）：31-33.

Preparation and properties of cross－linked enzyme aggregates of cattle pancreatic lipase

CUI Jian-dong，LIU Rong-lin
（Research Center for Fermentation Engineering of Hebei，College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，China）

In this study，cross-linked enzyme aggregates（CLEAs）of cattle pancreatic lipase（CPL-CLEAs）was prepared by cross-linked enzyme aggregates technology，the preparation conditions，catalysis properties，and dynamics parameters of CPL-CLEAs were investigated.The results showed that the optimum conditions of the preparation of CPL-CLEAs were as followed：final saturability of the ammonium sulfate was 80%，final concentration of glutaraldehyde was 1.5%，and corss-link time was 1 h.Under this condition，the highest activity recovery reached 90%.In addition，compared to free lipase，the optimum temperature of CPL-CLEAs was 60℃，which was increased about 10℃.The thermal stability，operational stability，and storage stablility of CPL-CLEAs were significantly enhanced compared with free lipase.Furthermore，the CPL-CLEAs still retained 43%of its initial activity after consecutive 7 cycles.

CLEAs technology；lipase；immobilized enzyme

TS202.3

A

1002-0306（2016）06-0201-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.033

2015－07－06

崔建東（1974-），男，博士，教授，主要從事生物催化與微生物資源開發(fā)，E-mail：cjd007cn@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金（21072041）；河北省自然科學(xué)基金（B2014208054）。