八眉豬SLA-DQA基因外顯子2多態(tài)性分析

寸海霞，謝德瓊，王　龍，魏　濤，張　穩(wěn)，郭鵬輝，劉麗霞（.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730030 .西北民族大學(xué)土木工程學(xué)院，甘肅蘭州730030）

八眉豬SLA-DQA基因外顯子2多態(tài)性分析

寸海霞1，謝德瓊1，王龍2，魏濤1，張穩(wěn)1，郭鵬輝1，劉麗霞1
（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730030 2.西北民族大學(xué)土木工程學(xué)院，甘肅蘭州730030）

本研究以八眉豬為研究對(duì)象，采用PCR-SSCP和克隆測(cè)序的方法研究了SLA-DQA基因外顯子2功能區(qū)的分子遺傳特征。結(jié)果顯示，八眉豬SLA-DQA基因外顯子2共有7種等位基因（A、B、C、D、E、F、G）和7種基因型（分別是AA、AB、AC、AE、AF、BB、DG），其中A等位基因和AA基因型占優(yōu)勢(shì)，DG基因型為劣勢(shì)基因型。對(duì)不同等位基因進(jìn)行克隆測(cè)序，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)15個(gè)氨基酸發(fā)生了改變，19個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)上共有5個(gè)氨基酸發(fā)生改變。x2檢驗(yàn)結(jié)果表明，該基因偏離了H ardy-W ei nberg平衡（P＜0.01）。遺傳多態(tài)性分析結(jié)果表明，八眉豬SLA-DQA基因外顯子2，屬于中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5）。研究結(jié)果表明，八眉豬SLA-DQA基因第2外顯子屬于多態(tài)基因。

八眉豬；SLA-DQA；基因PCR-SSCP；多態(tài)性

主要組織相容性復(fù)合體（M aj or hi st ocom pat i bi l i t y com pl ex，M H C）分布于白細(xì)胞表面，又稱(chēng)白細(xì)胞抗原。是一個(gè)緊密連鎖、高度多態(tài)性基因所組成的染色體上的遺傳區(qū)域，分為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ類(lèi)分子。Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)與抗原提呈相關(guān)，其分別提呈內(nèi)源性和外源性抗原肽，Ⅲ類(lèi)則與免疫因子相關(guān)，即M H C不僅參與機(jī)體對(duì)內(nèi)外源性抗原識(shí)別、結(jié)合，與機(jī)體獲得性免疫應(yīng)答相關(guān)，還控制著機(jī)體抑制排斥反應(yīng)。不同物種的M H C不同，M H C名稱(chēng)分別為H-2（鼠）、SLA（豬）、BOLA（牛）、ELA（馬）、OLAP（綿羊）、CLA（山羊）、DLA（犬）和B（雞）。SLA位于第七號(hào)染色體的短臂上，其結(jié)構(gòu)與人的M H C非常相似［1］。SLAⅠ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)基因具有高度多態(tài)性，其中SLAⅡ類(lèi)分子是一種跨膜蛋白，由α和β鏈結(jié)合而成，在α鏈上為α1和α2，β鏈上為β1和β2與免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)域相似，α1和β1，特別是β1具有較高的可變性，故而呈現(xiàn)高度多態(tài)，有利于適應(yīng)不同的外來(lái)抗原，DQA基因就位于β1上。據(jù)報(bào)道，最早發(fā)現(xiàn)的SLA-DQA為單拷貝基因，序列約為5.5kb，編碼255個(gè)氨各種動(dòng)物基酸，包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子［2］。相關(guān)學(xué)者采用酶切或PCR-RFLP的方法探討了合作豬、東北民豬和五指山豬完整的外顯子2的多態(tài)［3-5］。八眉豬又稱(chēng)大耳豬，具有種質(zhì)資源獨(dú)特，中心產(chǎn)區(qū)為陜西徑河流域、甘肅隴東、寧夏固原和青?；ブ貐^(qū)，在高原環(huán)境下經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期自然和人工選擇而形成的地方豬種，具有適應(yīng)性強(qiáng)、性早熟、抗逆性好、產(chǎn)仔多、母性好、沉積脂肪能力強(qiáng)、肉質(zhì)好、能適應(yīng)貧瘠多變的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件、遺傳性狀穩(wěn)定、對(duì)近交有抗力等特性［6-7］。本實(shí)驗(yàn)采用PCR-SSCP和測(cè)序方法對(duì)八眉豬DQA基因外顯子2進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析，以期為今后八眉豬的抗病育種提供基礎(chǔ)與依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料選取222頭八眉豬哺乳期仔豬為采樣對(duì)象，于仔豬出生后一周內(nèi)采集耳組織并置于75%乙醇中，帶回實(shí)驗(yàn)室保存于-20℃冰箱中備用。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取采用酚/氯仿提取法［8］，從耳組織中提取DNA并溶解于TE緩沖液，在1%瓊脂糖凝膠，經(jīng)200V電泳檢測(cè)后，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物設(shè)計(jì)及 PCR擴(kuò)增根據(jù)GenBank報(bào)道AY303988序列的3898-4146bp段，采用Pri m er5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)第2外顯子的核苷酸序列，引物上游引物：5'-：AGTCAAGTTCTCTTGTCACT-3'，下游引物5'-TGTGAACGGGTAGATTCTGT-3'），擴(kuò)增目的片段約為378bp，引物由大連寶生物科技股份有限公司合成。

PCR擴(kuò)增采用25μL的體系，各成分用量 ：10× Buf f er2.5μl，上下游引物各0.5μL，模板DNA 1.0μL，滅菌dd H 2O 19μL，Taq酶0.5μL。

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 m i n；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 m i n。

1.2.3PCR產(chǎn)物的SSCP檢測(cè)取2 μL PCR產(chǎn)物，加6 μL DNA變性緩沖液（98%去離子甲酰胺、二甲苯青、溴酚藍(lán)、混合而成）98℃變性10 m i n，然后放置于冰上冰浴10 m i n，在12%聚丙烯酰胺凝膠（Acr：Bi s=39：1），4℃、250 V，30m i n，200V 22h，結(jié)束后用銀染法顯色。

1.2.4克隆用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收不同基因型個(gè)體的PCR產(chǎn)物，回收后用PM D19-T Vect or載體連接，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌（E.col i）DH 5α菌株；篩選陽(yáng)性克隆培養(yǎng)，培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增；以原始PCR產(chǎn)物為標(biāo)準(zhǔn)物，菌液PCR產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)物同時(shí)進(jìn)行SSCP檢測(cè)。

1.2.5測(cè)序?qū)⒕篜CR產(chǎn)物后送至工生物工程（上海）股份有限公司和北京奧維森基因科技有限公司進(jìn)行SANGER法常規(guī)測(cè)序。

1.2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析利用Popgene 32軟件計(jì)算基因和基因型頻率、遺傳雜合度、有效等位基因數(shù)，并進(jìn)行群體的H ardy-W ei nberg平衡檢測(cè)［9］。根據(jù)Bot st ei n等（1980）的方法計(jì)算八眉豬的多態(tài)信息含量［10］。利用M EGA 6.01軟件進(jìn)行DNA序列比對(duì)分析，確定等位基因堿的突變位置［11］。參照SLA命名委員會(huì)的命名標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所得等位基因和單倍型進(jìn)行命名［12，13］。

2　結(jié)果

2.1PCR擴(kuò)增結(jié)選取條帶清晰明亮，無(wú)雜帶，無(wú)拖尾的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。目的條帶清晰，無(wú)雜帶，特異性良好。片段大小與預(yù)期大小相符，為378bp，包含完整的第2外顯子，部分第1內(nèi)含子和部分第2內(nèi)含子（如圖1示）。

2.2八眉豬SLA-DQA基因PCR-SSCP檢測(cè)結(jié)果八眉豬SLA-DQA基因第2外顯子引物擴(kuò)增區(qū)域檢測(cè)到7種等位基因，分別標(biāo)記為A、B、C、G、D、E、F，形成7種基因型，分別為AA、AB、AC、DG、AE、AF、BB（如圖2示）。

2.3八眉豬SLA-DQA基因外顯子2核苷酸對(duì)比分析V八眉豬DQA外顯子2中共有13個(gè)堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換，11個(gè)堿基發(fā)生顛換，導(dǎo)致15個(gè)位點(diǎn)發(fā)生錯(cuò)義突變，9個(gè)位點(diǎn)發(fā)生同義突變.（如圖3所示）。

2.4八眉豬SLA-DQA基因外顯子2氨基酸對(duì)比分析共有15個(gè)氨基酸發(fā)生了突變，其中19個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)上共有5個(gè)氨基酸發(fā)生改變（如圖4所示）。

2.5八眉豬SLA-DQA基因外顯子2基因型和等位基因頻率分布八眉豬以純合子AA型居多（0.6036），雜合子AF次之（0.1396），GH型最少（0.0225），A基因是八眉豬的優(yōu)勢(shì)基因（0.7625），G與H基因?yàn)榱觿?shì)基因（0.113），如表1所示。

八眉豬DQA第2外顯子的PIC值為0.3763，屬于中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），期望雜合度為0.3992，高于觀(guān)測(cè)雜合度（0.3423），并且該基因位點(diǎn)偏離了H ardy-W ei nberg平衡狀態(tài)（p＜0.01）。

3　討論

M H C是一類(lèi)分布于白細(xì)胞表面，表達(dá)于動(dòng)物核細(xì)胞表面的一類(lèi)緊密連鎖并具有高度多態(tài)性的基因位點(diǎn)所組成的染色體上的一個(gè)遺傳區(qū)域，其很大程度上決定了動(dòng)物識(shí)別自己、排除非己以維持機(jī)體上正常的生理和抵抗疾病的能力［14］，在大猩猩與黑猩猩的研究中表現(xiàn)M H C是現(xiàn)有物種形成前就存在的原始基因［15］，同時(shí)表現(xiàn)出高度多態(tài)性。目前諸多報(bào)道表明了SLA-DQA基因外顯子2的多態(tài)性，張冬杰［16］采用PCR-RPLP技術(shù)對(duì)黑龍江野豬與東北黑豬雜交的F1個(gè)體進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DQA基因的第2、 3、4外顯子都具有多態(tài)性并且與仔豬的體重相關(guān)；蔣岸岸等［17］在藏豬中檢測(cè)到3種基因型，而在本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到7種基因型差異性較大，與李華等［18］分別在滇南小耳豬和巴馬小型豬DQA外顯子2中發(fā)現(xiàn)9種和7種PCR-RFLP組合型基因，并表現(xiàn)出中度多態(tài)相近。劉榜等［19］對(duì)SLA-DQA外顯子2的核苷酸序列分析表明該區(qū)域具有高度多態(tài)性，同時(shí)蔣岸岸等［20］用單一的酶切獲得藏豬的多態(tài)性位點(diǎn)。本研究檢測(cè)到八眉豬SLA-DQA外顯子2檢測(cè)到的7種基因型中純合子AA型居多，雜合子GH最少，這與李華等（2006）報(bào)道的甘孜藏豬DQA外顯子2以純合子M M型居多符合，與張建明［21］西藏小型豬DQA基因外顯子2以雜合子M N居多存在差異。八眉豬在外顯子2上純合子比例高，說(shuō)明基本達(dá)較高純度，這可能與它所處的地理位置比較偏僻，受外來(lái)血緣的影響較小以及長(zhǎng)期封閉選育有關(guān)。

圖1　SLA-DQA基因外顯子2PCR產(chǎn)物電泳圖

圖2　PCR-SSCP檢測(cè)結(jié)果圖

多態(tài)信息含量（PIC）、遺傳雜合度（H e）與純合度（H o）是評(píng)價(jià)種豬遺傳變異的重要指標(biāo)。對(duì)某一群體，PIC和H e的數(shù)值越大，該群體內(nèi)基因一致性越差，基因的變異性越大，反之，基因的變異性越小，選擇潛力也就越小［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，八眉豬中為度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），并偏離了H ardy-W ei nberg平衡狀態(tài)（p＜0.01）這可能是由于長(zhǎng)期進(jìn)化中等位基因的積累和融合所致［23］，造成遺傳性之間的差異。

圖3　SLA-DQA基因第2外顯子等位基因序列比對(duì)

圖4　八眉豬SLA-DQA基因第2外顯子氨基酸序列比對(duì)

表1　八眉豬SLA-DQA基因外顯子2基因型和基因頻率

核苷酸的替換是形成M H C基因高度多態(tài)的原因。等位基因的多態(tài)性也表現(xiàn)在基于點(diǎn)突變的基因序列差異上［24］，本研究經(jīng)克隆測(cè)序后發(fā)現(xiàn)13個(gè)堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換，11個(gè)堿基發(fā)生顛換其中15個(gè)位點(diǎn)發(fā)生錯(cuò)義突變，9個(gè)位點(diǎn)發(fā)生同義突變致15個(gè)氨基酸發(fā)生改變與張冬杰等［25］在東北民豬中發(fā)現(xiàn)DQA外顯子2是整個(gè)基因的高突變區(qū)相符同時(shí)劉榜等［26］在SLA-DQA外顯子2基因新位點(diǎn)研究中發(fā)現(xiàn)4個(gè)新突變位點(diǎn)和2個(gè)新等位基因，為進(jìn)一步的抗病育種奠定了基礎(chǔ)。

4　結(jié)論

SLA-DQA基因外顯子2在八眉豬中屬于中度多態(tài)，并偏離了H ardy-W enberg平衡狀態(tài)，同時(shí)還檢測(cè)出核苷酸的變化導(dǎo)致氨基酸發(fā)生突變，為進(jìn)一步的抗病育種提供依據(jù)。

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S858．28文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

1003-8655（2016）03-0010-04

2016-03-28

西北民族大學(xué)2015年國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201510742083），西北民族大學(xué)中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（31920130047）

寸海霞（1992-），女，云南麗江人，在讀本科生，主要從事分子生物學(xué)方面的研究

劉麗霞（1983-），女，甘肅隴南人，博士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究