青蒿素、黃花蒿與黃連素單獨(dú)和聯(lián)用的抗球蟲作用研究

吳陽陽*，王安源*，張醒醒，丁金鑫，焦金英，劉明江，李金貴（揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009）

青蒿素、黃花蒿與黃連素單獨(dú)和聯(lián)用的抗球蟲作用研究

吳陽陽*，王安源*，張醒醒，丁金鑫，焦金英，劉明江，李金貴
（揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009）

本文以柔嫩艾美耳球蟲（E.t enel l a）口服接種制作雛雞球蟲感染模型，在接種前1 d至接種后5 d拌料投喂青蒿素（20 m g/kg）、黃花蒿干葉片（5%）、黃連素（125 m g/kg）或藥物聯(lián)合使用，通過臨床球蟲病癥狀、盲腸病變計(jì)分、糞便卵囊計(jì)數(shù)以及抗球蟲指數(shù)的計(jì)算來評(píng)價(jià)藥物的預(yù)防球蟲感染的作用。結(jié)果表明：青蒿素、黃花蒿干燥葉片、黃連素以及青蒿素與黃連素、黃花蒿干燥葉片與黃連素的聯(lián)合用藥均能減輕E.t enel l a的致病程度，且效果類似，但藥物聯(lián)合使用未見增效作用。

球蟲；雛雞；青蒿素；黃花蒿；黃連素

球蟲病是危害家禽業(yè)最主要的寄生蟲病，由球蟲感染造成被感染動(dòng)物的生長和飼料利用率嚴(yán)重下降而造成巨大損失，加上藥物、疫苗等其它成本，估計(jì)因該病造成的損失每年超過30億美元［1］。雖然有球蟲疫苗的使用，但目前該病的控制仍主要依賴化學(xué)預(yù)防。歐盟等地區(qū)或國家推出了禁止在飼料中添加促生長添加劑和抗球蟲藥的法規(guī)，加上新藥物和活疫苗開發(fā)成本的提高以及球蟲對(duì)現(xiàn)有抗球蟲藥物耐藥性的日益嚴(yán)重，故亟需開發(fā)新的活性化合物用于球蟲病的控制策略。

青蒿素（Art em i si ni n，ART）是從菊科植物黃花蒿中的一種含有過氧橋基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯藥物，其衍生物包括二氫青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚和青蒿琥酯，因其抗瘧特效而被人們所熟知和重視［2］。青蒿素的發(fā)現(xiàn)和推廣使用挽救了無數(shù)非洲人的生命，我國藥物學(xué)家屠呦呦因此而獲得2015年生理學(xué)和醫(yī)學(xué)諾貝爾獎(jiǎng)。研究表明，青蒿干燥葉片（l eaves ofArt em i si aannua，LAA）及其有效成分ART均能明顯減少球蟲感染雞的糞便卵囊數(shù)，減輕腸道病變，且無明顯的毒副作用［3，4］，但其療效仍難以達(dá)到滿意水平［5，6］。黃連素（Berberi ne，BBR），又叫小檗堿，主要存在于小檗屬與黃連屬植物中，在臨床上具有抗菌消炎等效果［7］，因其價(jià)格便宜，服用簡單、副作用小而被用作治療腹瀉的藥物［8］。Dkhi l等（2015）的研究證明BBR能減輕小鼠艾美耳球蟲感染的程度，使球蟲卵囊減少60%，同時(shí)減輕了腸道IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性細(xì)胞因子的水平和氧化應(yīng)激反應(yīng)水平［9］，這提示BBR對(duì)球蟲感染具有一定的防治作用。

El f awal等（2014）通過鼠瘧模型證實(shí)口服青蒿干燥葉片比同等劑量的ART具有更好的抗瘧效果，而且更不易產(chǎn)生耐藥性［10］。青蒿干燥葉片的抗球蟲作用是否也好于純品ART，BBR是否也具有抗雞球蟲作用，以及兩種藥物聯(lián)合是否具有協(xié)同抗感染作用？因此，本試驗(yàn)擬開展青蒿、ART與BBR單獨(dú)使用以及聯(lián)合使用抗球蟲作用的評(píng)估，以期為臨床上球蟲病的防治提供參考。

1　材料與方法

1.1材料中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所提供的雛雞飼料，不含抗球蟲藥和抗生素。黃花蒿：廣西南寧市南寧鎮(zhèn)中藥加工廠。青蒿素，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司生產(chǎn)，含量97%以上；黃連素，生工生物工程（上海）有限公司。

1.2試驗(yàn)動(dòng)物與球蟲卵囊120只1日齡雄性雄性綠殼蛋雞，購于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，飼養(yǎng)于揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，飼養(yǎng)環(huán)境經(jīng)氨水噴灑消毒后，再用甲醛、高錳酸鉀熏蒸消毒，確保試驗(yàn)環(huán)境無其他影響因素。飼養(yǎng)時(shí)統(tǒng)一供暖及照明，自由飲水?dāng)z食，飼養(yǎng)至13日齡時(shí)開始試驗(yàn)。E.t enel l a孢子化卵囊，為揚(yáng)州大學(xué)中獸醫(yī)教研室采集病料分離，并經(jīng)雛雞接種純化后獲得的孢子化卵囊。

1.3試驗(yàn)方法將試驗(yàn)雞平衡體重后分為7組，每組12只。即空白對(duì)照組（Cont rol）、感染對(duì)照組（E.t enel l ai nf ect i on，EI）、感染+20 m g/kg ART處理組（EI+ART）、感染+5%LAA處理組（EI+LAA）、感染+125m g/kg BBR處理組（EI+BBR）、感染+5%LAA+125m g/kgBBR處理組（EI+LAA+BBR）、感染+20m g/kg ART+125m g/kg BBR處理組（EI+ART+BBR），具體分組情況見表1。14日齡時(shí)，球蟲感染各組雞每只經(jīng)口接種8萬個(gè)孢子化卵囊。在球蟲接種前1天開始用藥至試驗(yàn)結(jié)束，所用藥物均勻拌料后給予自由采食，自由飲水，空白對(duì)照組與感染對(duì)照組的飼料中無藥物添加，其他飼養(yǎng)條件保持一致。觀察感染后各組雞群發(fā)病情況，包括精神、飲食欲以及糞便情況等。接種球蟲感染后，注意觀察雞群發(fā)病情況，在出現(xiàn)血便時(shí)開始進(jìn)行糞便卵囊計(jì)數(shù)，計(jì)算每克糞便中卵囊數(shù)（OPG），并進(jìn)行血便計(jì)分。對(duì)病死雞進(jìn)行剖檢，觀察盲腸與其他器官的病變情況。接種球蟲感染后第8天逐只稱重后撲殺試驗(yàn)雞，進(jìn)行增重、免疫器官（脾臟和法氏囊）指數(shù)、盲腸病變計(jì)分和抗球蟲指數(shù)（ant i cocci di al i ndex，ACI）的計(jì)算，來綜合評(píng)價(jià)藥物的療效。

1.4統(tǒng)計(jì)分析所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 19.0版統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單向方差分析 （One-way ANOVA），應(yīng)用GraphPad Pri sm 6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)作圖，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示，差異顯著性判斷以P＜0.05作為差異顯著，P＜0.01作為差異極顯著。

2　結(jié)果

表1　試驗(yàn)分組及處理情況

2.1各組試驗(yàn)雞球蟲感染后臨床癥狀及體重變化球蟲感染后兩天內(nèi)各組雞均無球蟲病相關(guān)癥狀，飲食欲正常。但感染后60h各組均出現(xiàn)不同程度腹瀉，其中感染對(duì)照組最為明顯。

在感染后96h左右球蟲感染的各組雞突然出現(xiàn)血便，其中感染對(duì)照組血便較多，約30%的雞出現(xiàn)血便。然后試驗(yàn)雞開始出現(xiàn)精神不振，在感染后110-120h，球蟲病癥狀加重，精神沉郁，縮頸，羽毛松亂，采食量下降明顯，其中感染對(duì)照組和ART+BBR組的血便情況最嚴(yán)重，并導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)束時(shí)雛雞體重的下降（見表2）。感染132h后，ART+BBR組雞的血便情況仍較為嚴(yán)重，其余組血便量及比例相對(duì)減少。感染144h后，各組雞基本無血便排出，但糞便比空白組稀軟。感染后第8天剖殺試驗(yàn)雞發(fā)現(xiàn)，感染對(duì)照組盲腸芯較多，內(nèi)充滿大量蟲體和脫落的粘膜組織；盲腸較粗短，腸壁增厚，而用藥的各組盲腸外觀病變均有不同程度的減輕。

2.2藥物抗球蟲感染效應(yīng)評(píng)價(jià)從球蟲感染致盲腸病變來看，LAA+BBR組的病變計(jì)分最低，但綜合評(píng)定其ACI仍較低，所有用藥組均未達(dá)到理想的抗球蟲效果。ART+BBR組在所有用藥組的總體效果最差，僅好于感染對(duì)照組，盲腸病變計(jì)分與感染對(duì)照組接近，卵囊值也較高。這表明LAA與ART具有類似的抗球蟲效果。BBR有一定的抗球蟲感染作用，但作用效果與ART類似。但總體上看來，各藥物的抗球蟲效果均未達(dá)到中效、高效抗球蟲藥的水平。

3　討論

青蒿素（ART）用于球蟲病的治療或預(yù)防在國內(nèi)外均有報(bào)道，但其抗球蟲感染效果未達(dá)到理想抗球蟲藥的水平，在本試驗(yàn)中也得到類似結(jié)果。黃連素（BBR），又稱為小檗堿，主要存在于小檗屬與黃連屬植物中，在臨床上具有抗菌消炎等效果，并因其價(jià)格便宜、服用簡單、副作用小而被用作治療腹瀉的藥物為大家所熟知。黃連素對(duì)腸道炎癥具有治療功效，在球蟲感染的同時(shí)按雛雞體重給予300 μg/g劑量的BBR，劉偉偉等認(rèn)為該劑量對(duì)球蟲病具有較好的治療效果，因?yàn)楦腥緦?duì)照組死亡率達(dá)到50%，而該劑量未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，雛雞的相對(duì)增重達(dá)到空白對(duì)照組的55.5%，BBR的抗球蟲指數(shù)達(dá)到140以上［11］，但依據(jù)雞球蟲病學(xué)對(duì)于藥物抗球蟲效果的評(píng)價(jià)來判斷仍未達(dá)到中等抗球蟲藥的效果。本試驗(yàn)拌料給予125 m g/kg劑量的BBR也得到了類似的結(jié)果，抗球蟲指數(shù)130以上。但本試驗(yàn)嘗試了ART與BBR的聯(lián)合用藥，但未發(fā)現(xiàn)增效作用。此外，還用黃花蒿干燥葉片拌料，結(jié)果表明具有與ART類似的抗球蟲效果，將之與BBR聯(lián)合使用，也未見明顯的增效作用，其原因還有待于進(jìn)一步探討。

表2　青蒿素、黃花蒿葉片、黃連素等藥物對(duì)試驗(yàn)雞增重情況的影響

表3　青蒿素、黃花蒿葉片、黃連素等藥物抗球蟲效果評(píng)價(jià)

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S853.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

1003-8655（2016）03-0004-03

2016-01-24

國家自然科學(xué)基金資助（No：31272548）.

*同為第一作者：吳陽陽（1991-），在讀碩士研究生.王安源（1991-），，在讀碩士研究生。

李金貴，教授，博導(dǎo)，主要從事中獸藥藥理與免疫活性研究，

E-m ai l：j gl i@yzu.edu.cn