內蒙古馬鈴薯枯萎病病原菌鑒定及其生物學特性

陳慧，薛玉鳳，蒙美蓮，馬志偉，劉智慧，胡俊

（內蒙古農業(yè)大學農學院，內蒙古呼和浩特010019）

病蟲防治

內蒙古馬鈴薯枯萎病病原菌鑒定及其生物學特性

陳慧，薛玉鳳，蒙美蓮，馬志偉，劉智慧，胡俊*

（內蒙古農業(yè)大學農學院，內蒙古呼和浩特010019）

馬鈴薯枯萎病在內蒙古馬鈴薯種植區(qū)發(fā)生日趨嚴重。為明確其病原，2009～2014年對采自內蒙古各地的馬鈴薯枯萎病病樣進行病原菌分離和鑒定。通過形態(tài)學鑒定和rDNA-ITS測序、同源性比對，得知引起內蒙古馬鈴薯枯萎病病原菌主要為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、三線鐮刀菌（F.tricinctum）和茄病鐮刀菌（F.solani）。生物學特性研究結果表明，尖孢鐮刀菌的最適生長溫度為25℃，最適pH為7，最適合生長的培養(yǎng)基為PDA、PSA、Bilais培養(yǎng)基，最適碳源為淀粉和麥芽糖，最適氮源為蛋白胨；三線鐮刀菌的最適生長溫度為20℃，最適pH為7，最適生長的培養(yǎng)基為玉米粉和燕麥粉培養(yǎng)基，最適碳源為淀粉，最適氮源為尿素；茄病鐮刀菌的最適溫度為30℃，最適pH為7，最適合生長的培養(yǎng)基為PSA培養(yǎng)基，最適碳源為葡萄糖和蔗糖，最適氮源為硝酸鉀。

馬鈴薯枯萎?。荤牭毒?；鑒定；生物學特性

馬鈴薯是一種具有較大優(yōu)勢的作物，生育期短，適應性強，產量高，用途廣。馬鈴薯除用做日常膳食直接食用消費外，還在更為廣泛的領域被開發(fā)利用，是世界性的農業(yè)資源與多種食品加工和工業(yè)原料。進一步推動馬鈴薯產業(yè)的發(fā)展，對產區(qū)農民脫貧致富和緩解中國糧食安全壓力具有重要戰(zhàn)略意義和現實意義。

隨著馬鈴薯栽培面積的不斷增長，輪作倒茬變得困難，使得馬鈴薯病害種類不斷增加且危害也日漸加重，嚴重制約著馬鈴薯產業(yè)的健康穩(wěn)步發(fā)展。馬鈴薯枯萎病是近幾年新發(fā)現的一種由鐮刀菌侵染引起的土傳病害，在全國各地均有發(fā)生，據調查在內蒙古自治區(qū)的一些種植區(qū)嚴重地塊發(fā)病率達78.0％，導致馬鈴薯減產并影響其經濟效益。

據Rakhimov和Khakimov［1］報道，馬鈴薯枯萎病是由鐮刀菌的5個不同種引起的，即茄病鐮刀菌（Fusarium solani）、雪腐鐮刀菌（F.nivale）、尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）、串珠鐮刀菌（F.moniliforme）和接骨木鐮刀菌（F.sambucinum）。彭學文和朱杰華［2］報道，河北省馬鈴薯枯萎病是由F.solani、F.moniliforme以及F.oxysporum引起的。王玉琴等［3］報道，甘肅省馬鈴薯枯萎病是由燕麥鐮刀菌（F.avenaceum）引起的。王麗麗等［4］報道，新疆馬鈴薯枯萎病的病原菌由F.moniliforme、F.solani和F.oxysporum 3個種引起。

為明確內蒙古馬鈴薯枯萎病的病原，2009～2014年對采自內蒙古各地的馬鈴薯枯萎病病樣進行病原菌分離和鑒定，同時對其生物學特性進行研究，奠定了馬鈴薯枯萎病防治研究的基礎。

1　材料與方法

1.1病原菌的分離與純化

2009～2014年對從內蒙古包頭市、烏蘭察布市、呼和浩特市和錫林郭勒盟等地采集到的具有典型馬鈴薯枯萎病癥狀的病株和病薯用組織分離法進行分離［5］。在PSA培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)純化，將純化的菌株采用瓊膠平板表面單孢子挑取法進行單孢分離［5］，進一步純化后于PSA斜面培養(yǎng)基上4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2致病性測定

將在PSA培養(yǎng)基上生長7～10 d的菌株分別制取菌餅（5～6片）接入裝有麥麩培養(yǎng)基的三角瓶（500 mL）中，25℃下培養(yǎng)7～15 d，待菌絲長滿培養(yǎng)基后，以1％（質量比）比例與滅菌土混勻制成菌土。

馬鈴薯‘夏波蒂’種薯在5‰高錳酸鉀溶液中浸泡10 min，用清水沖洗干凈后播種于盛有菌土的花盆中，置于溫室中培養(yǎng)。以無菌土為對照，3次重復，每個重復5株。植株發(fā)病后進行再次分離，將分離物的菌落形態(tài)和孢子形態(tài)等與接種菌株進行比較。

1.3病原菌鑒定

1.3.1形態(tài)學鑒定

病原菌接種于PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d后，觀察菌落形態(tài)和產生色素情況，并測量菌落大小，計算菌絲生長速率。7 d后在顯微鏡下觀測孢子及產孢細胞的形態(tài)和大小，厚垣孢子的有無等。大型分生孢子測量50個，小型分生孢子測量20～30個，厚垣孢子測量10個。不產孢的病原菌接種于Bilais培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d產孢后進行觀測。根據所得結果參照Booth［6］《鐮刀菌屬》分類系統(tǒng)進行形態(tài)學鑒定。

1.3.2分子生物學鑒定

將純化后的菌株接種到PSA平板上培養(yǎng)5～7 d，刮取菌絲，在液氮中充分研磨后，用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）提取病原菌的DNA。利用真菌通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4 （5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）對菌株進行PCR擴增。

擴增體系為:10×PCR buffer 5 μL（含Mg2+），10mmoL/LdNTP（10mmoL/Leach）0.75μL，ExTaqDNA polymerase 0.25 μL，引物對2 μL，模板DNA 1 μL，無菌ddH2O41μL，總體系50μL。

擴增條件為：94℃預變性3 min，94℃變性40 s，56℃退火40 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最終72℃延伸10 min，放置在4℃下保存。

對獲得的擴增產物利用瓊脂糖凝膠電泳檢測并進行測序，將得到的序列在GenBank中進行比對，通過同源性分析在分子水平上對病原菌的種進行鑒定。

1.4病原菌生物學特性研究

1.4.1不同溫度對病原菌生長的影響

設8個溫度梯度，分別為5，10，15，20，25，30，35和40℃。用打孔器取直徑0.7 cm菌餅接于PSA平板培養(yǎng)基上，每個處理重復5次，置于不同溫度的溫箱內培養(yǎng)，6 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.4.2不同pH對病原菌生長的影響

設10個pH值梯度，分別為3，4，5，6，7，8，9，10，11和12。用打孔器取直徑0.7 cm菌餅接于PSA平板培養(yǎng)基上，每個處理重復5次，置于25℃溫箱內培養(yǎng)，6 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.4.3不同培養(yǎng)基對病原菌生長的影響

選取7種不同的培養(yǎng)基，分別為PDA培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基、水瓊脂培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基、玉米粉培養(yǎng)基、查彼培養(yǎng)基、Bilais培養(yǎng)基。用打孔器取直徑0.7 cm菌餅接于不同平板培養(yǎng)基，每個處理重復5次，置于25℃溫箱內培養(yǎng)，6 d后用十字交叉法測量菌落直徑，并觀察菌落形態(tài)。

1.4.4不同碳、氮源對病原菌生長的影響

以Czapek培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，用碳百分含量相當的葡萄糖、麥芽糖、乳糖、淀粉、D-果糖、D-甘露醇、D-木糖、甘露糖、半乳糖分別作為碳源代替蔗糖；用氮百分含量相當的硝酸鉀、硝酸銨、尿素、蛋白胨、碳酸銨、碳酸氫銨、氯化銨、L-精氨酸分別作為氮源代替硝酸鈉，制成固體培養(yǎng)基。用打孔器取直徑0.7 cm菌餅接于不同平板培養(yǎng)基上，每個處理重復5次，置于25℃溫箱內培養(yǎng)，6 d后用十字交叉法測菌落直徑。

1.5數據處理與分析

試驗結果采用Excel 2003與SAS 9.0軟件進行數據處理與分析。

2　結果與分析

2.1病原菌分離及致病性測定

從279個具有馬鈴薯枯萎病典型癥狀的病樣中分得43株分離物，對這些分離物進行了初步的菌絲形態(tài)和孢子形態(tài)的鑒定，將這些分離物分為3大類。第1類D有20株，所占的比例為46.5％；第2 類D1有8株，所占比例為18.6％；第3類D2有2株，所占比例為4.7％。這些分離物采用土壤接種后，馬鈴薯植株在生長中后期開始發(fā)病，發(fā)病初期，下部葉片萎蔫，隨著病情的發(fā)展，葉片由下而上逐漸萎蔫枯死（圖1a和b），剖開根莖部可見維管束變褐色或黑褐色（圖1c）；切開染病的塊莖維管束呈虛線狀褐變（圖1d）。對發(fā)病的植株進行再分離，得到的分離物與所接菌株形態(tài)相同，依據科赫氏法則，證明所接菌株為馬鈴薯枯萎病的病原菌。

2.2病原菌鑒定

2.2.1形態(tài)學鑒定

圖1　馬鈴薯枯萎病癥狀Figure 1Symptoms of potato wilt

病原菌D在PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d后菌落直徑為6.3～6.5 cm。菌落正面（圖2a）為規(guī)則的圓形，邊緣菌絲則呈放射狀，菌絲較細，菌落絨氈狀，背面（圖2b）分泌淡紫色的色素；以單出瓶梗為方式產孢。大型分生孢子（圖2c）相對小型分生孢子稀少，3～5個分隔，紡錘形，兩端尖，大小為11.5～ 28 μm×3.1～4.0 μm。小型分生孢子（圖2c）無色，橢圓形或卵形，大小為3.9～6.4 μm×2.3～2.9 μm。厚垣孢子（圖2d）單獨生長，球形，表面光滑。

圖2　病原菌D形態(tài)特征Figure 2Morphological characters of pathogen D

病原菌D1（圖3a）在PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d后的菌落平均直徑為4.2～4.5 cm，菌絲茂盛，棉絮狀，粉紅色，上有橘黃色分生孢子座產生，背面（圖3b）培養(yǎng)基變?yōu)榘导t葡萄酒色。大型分生孢子（圖3c）鐮刀狀，彎曲，頂端漸細，有明顯的足孢，3～5隔，大小為10.64～20.88 μm×2.66～4.12 μm。小型分生孢子（圖3d）最初至單生瓶狀小梗上形成，以后分生孢子梗產生茂盛的分枝，卵圓形、梨形，0～1個分隔，大小為7.2～9.31 μm×2.4～3.5 μm。厚垣孢子（圖3e）稀少，單生或串生，偶爾生于短側枝的頂端，球形，大小為6.25～13.75 μm×6.88～18.75 μm。

圖3　病原菌D1形態(tài)特征Figure 3Morphological characters of pathogen D1

病原菌D2（圖4a）在PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d后菌落直徑為3.6～4.3 cm，邊緣比較整齊，氣生菌絲較少，薄絨狀，白色至淺灰色；后期背面（圖4b）在菌落中心形成棕色的色素。分生孢子梗為瓶狀小梗。大型分生孢子（圖4c）紡錘形，稍彎，頂端細胞短，稍窄細或變鈍，壁厚，2～8個隔膜，大小為15～55 μm×3～5.1 μm。小型分生孢子（圖4c）呈卵形或腎形，大小為4.9～11 μm×2.4～4 μm。厚垣孢子（圖4d）表面粗糙，球形，對生、單生、串生或頂生。

根據上述形態(tài)學特征，結合Booth《鐮刀菌屬》分類系統(tǒng)進行鑒定，將D、D1、D2初步確定為尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）、三線鐮刀菌（F.tricinctum）、茄病鐮刀菌（F.solani）。

圖4　病原菌D2形態(tài)特征Figure 4Morphological characters of pathogen D2

2.2.2分子生物學鑒定

提取3種病原菌的基因組DNA，以真菌通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增，擴增產物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，以DNA Marker-DL2 000為對照，在500 bp左右有明顯的擴增條帶（圖5）。擴增產物送上海生工測序，將測序結果與GenBank中所登陸的其他同源序列進行比對，結果發(fā)現，3種菌D、D1、D2的rDNA-ITS序列分別與GenBank中的F.oxysporum、F.tricinctum、F.solani同源性達100％、99％、99％，利用MEGA 6.06軟件構建了系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現3種菌D、D1、D2分別與尖孢鐮刀菌（F.oxysporum JF807396）、三線鐮刀菌（F.tricinctum EF611092）、茄病鐮刀菌（F.solani JF912885）親緣關系最近，聚在一起（圖6）。結合形態(tài)學鑒定結果，可以確定這3種病原菌分別為尖孢鐮刀菌、三線鐮刀菌、茄病鐮刀菌。

圖5　病原菌DNA的PCR擴增產物電泳圖Figure 5Electrophoresis of PCR production with DNA extract of pathogen

2.3病原菌生物學特性研究

2.3.1不同溫度對病原菌生長的影響

圖7結果所示，3種病原菌在10～35℃均可生長，病原菌D、D1、D2分別在25，20和30℃時菌落的生長速率顯著高于其他溫度，為病原菌最適生長溫度。溫度為5℃時病原菌D與D2不長，在40℃時3種病原菌均停止生長。

圖6　基于rDNA-ITS序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 6Phylogenetic tree based on rDNA-ITS sequences

圖7　溫度對病原菌生長的影響Figure7Effects of temperature on pathogen growth

2.3.2不同pH對病原菌生長的影響

由圖8結果可知，3種病原菌在pH 3～12均可生長，pH 6～8時，適合菌絲生長，pH 7時的生長速率顯著高于其他處理；病原菌D、D1在最適pH時的菌落直徑與pH3、pH4、pH11、pH12的菌落直徑差異顯著，說明強酸、強堿不適合該菌的生長；病原菌D2，強酸可以稍抑制其生長，但在強堿環(huán)境下基本不影響其生長。在pH為3時，病原菌D培養(yǎng)基變?yōu)榧t色，不產生紫色色素；病原菌D1的菌絲與培養(yǎng)基均為黃色，不產生酒紅色的色素；病原菌D2的培養(yǎng)基變?yōu)槌赛S色，不產生綠色色素，均與其他處理的正常生長性狀不同，說明強酸環(huán)境會影響病原菌色素的形成。

2.3.3不同培養(yǎng)基對病原菌生長的影響

由圖9結果可知，3種病原菌在7種不同的培養(yǎng)基上均可生長。病原菌D的最適培養(yǎng)基為PDA、PSA、Bilais，在Bilais培養(yǎng)基上菌絲稀疏，查彼培養(yǎng)基不適合該病菌的生長；D1的最適培養(yǎng)基為玉米粉與燕麥粉培養(yǎng)基，這2種培養(yǎng)基菌落生長的直徑較大但是菌絲生長稀疏，Bilais與水瓊脂培養(yǎng)基不適合該病原菌的生長，生長速率較慢，但是Bilais培養(yǎng)基促進該病原菌產孢；D2的最適培養(yǎng)基為PSA，在燕麥粉培養(yǎng)基上該病原菌生長較慢。

圖9　不同培養(yǎng)基對病原菌生長的影響Figure 9Effects of different media on pathogen growth

圖10　不同碳源對病原菌生長的影響Figure 10Effects of different C-source on pathogen growth

2.3.4不同碳、氮源對病原菌生長的影響

由圖10結果可知，病原菌D的最適碳源為淀粉和麥芽糖，其次為木糖、乳糖、甘露醇，且之間差異不顯著，菌絲生長速度最慢的是半乳糖、果糖、蔗糖；病原菌D1以淀粉為最適碳源，其次為甘露糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖，且之間無顯著差異，在半乳糖為碳源時病菌生長速度最慢，該碳源與其他碳源差異顯著；病原菌D2的最適碳源是葡萄糖與蔗糖，半乳糖為碳源時菌絲生長速度最慢。

由圖11可知，病原菌D的最適氮源為蛋白胨，其次為碳酸氫銨、硝酸鉀，且與最適氮源差異不顯著，病原菌以尿素為氮源時停止生長；病原菌D1的最適氮源為尿素，且與其他氮源處理差異顯著，其次適合該病原菌生長的氮源為硝酸鉀、硝酸鈉，且之間差異不顯著，氮源為硫酸銨、碳酸氫銨、氯化銨時菌絲生長速度最慢，說明該病原菌對銨態(tài)氮的利用率不高；病原菌D2的最適氮源是硝酸鉀，氮源為氯化銨時病菌菌絲生長緩慢。

圖11　不同氮源對病原菌的影響Figure 11Effects of different N-source on pathogen growth

3　討論

中國是馬鈴薯生產大國，近幾年來馬鈴薯的種植面積不斷增加，馬鈴薯病害種類逐年增多，危害也漸重。馬鈴薯枯萎病近年來已經逐漸成為制約馬鈴薯生產的一大病害，由于該病是由多種鐮刀菌侵染引起的土傳病害，而且鐮刀菌的寄主范圍較廣泛，因此對于該病的防治比較困難。

本文通過對馬鈴薯枯萎病病原菌的分離及鑒定得知，內蒙古地區(qū)引起馬鈴薯枯萎病的病原菌為尖孢鐮刀菌、三線鐮刀菌和茄病鐮刀菌3種。據報道［1，2，4］馬鈴薯枯萎病可以由尖孢鐮刀菌與茄病鐮刀菌引起，而且這2種病原菌也是引起中國新疆和河北地區(qū)馬鈴薯枯萎病的病原菌；對于三線鐮刀菌引起內蒙古地區(qū)的馬鈴薯枯萎病還是首次發(fā)現，尚不清楚該病原菌是否會導致其他馬鈴薯種植區(qū)的枯萎病發(fā)生，而且內蒙古地區(qū)是否還存在其他類型病原菌還需研究。本研究發(fā)現，在所有分離物中，尖孢鐮刀菌所占的比例最大，為46.5％，是內蒙古地區(qū)最主要優(yōu)勢的致病菌。

據王勇等［7］報道，茄病鐮刀菌的最適生長溫度為26～30℃，最適培養(yǎng)基為PSA和察氏培養(yǎng)基。楊靜美等［8］報道，番木瓜上的茄病鐮刀菌的最適生長溫度為25～30℃，最適碳源為葡萄糖，淀粉為碳源時不適合其生長，最適氮源為蛋白胨，氯化銨、硫酸銨、磷酸二氫銨抑制其生長。孔瓊等［9］報道了香莢蘭上尖孢鐮刀菌的生物學特性，報道稱該菌的最適生長溫度28℃，5℃和37℃均抑制其生長，最適的pH為7，強酸強堿對其生長有抑制作用。本試驗結果與前人的研究略有差異，可能是病原菌的地理來源及寄主不同，也可能是鐮刀菌的遺傳差異較大，幾種鐮刀菌為不同的變種。

3種病菌適應性較廣，在溫度為15～30℃時均能正常生長，說明馬鈴薯枯萎病在整個馬鈴薯生長季節(jié)均可發(fā)生；強酸、強堿環(huán)境抑制尖孢鐮刀菌與三線鐮刀菌的生長，但是茄病鐮刀菌對pH不敏感，比較耐堿，在強堿的環(huán)境中仍然可以生長。這可能是導致各生態(tài)區(qū)馬鈴薯枯萎病都有發(fā)生的生物學基礎。

本文通過對馬鈴薯枯萎病病原菌的基本形態(tài)特征及生物學特性的研究，初步闡明了病原菌生長與環(huán)境條件的關系，為進一步研究馬鈴薯枯萎病病害發(fā)生規(guī)律及病害防治提供了一定的理論依據。

［1］Rakhimov U Kh，Khakimov A Kh.Wilt of potatoes in Uzbekistan［J］. Zashchital Karantin Rastenii，2000，3:46.

［2］彭學文，朱杰華.河北省馬鈴薯真菌病害種類及分布［J］.中國馬鈴薯，2008，22（1）:31-33.

［3］王玉琴，楊成德，陳秀蓉，等.甘肅省馬鈴薯枯萎?。‵usarium avenaceum）鑒定及其病原生物學特性［J］.植物保護，2014，40 （1）:48-53.

［4］王麗麗，日孜旺古麗，蘇皮，等.烏昌地區(qū)馬鈴薯真菌性病害種類及5種新記錄［J］.新疆農業(yè)科學，2011，48（2）:266-270.

［5］方中達.植病研究法［M］.北京:中國農業(yè)出版社，2003:124，138.

［6］Booth C.The Genus of Fusarium［M］.Kew，England：CMI，1971: 100-101.

［7］王勇，楊秀榮，楊依軍，等.茄根腐病致病病原—茄病鐮刀菌及其藍色變種的生物學特性研究［J］.天津農學院學報，2002，9 （2）:21-25.

［8］楊靜美，陳健，羅金棠，等.番木瓜茄病鐮刀菌的生物學特性研究［J］.中國熱帶農業(yè)，2011，38（1）:56-58.

［9］孔瓊，王云月，朱有勇，等.香莢蘭尖孢鐮刀菌生物學特性［J］.西南農業(yè)學報，2005，18（1）:47-49.

Pathogen Identification and Biological Characteristics of Potato Wilt in Inner Mongolia

CHEN Hui，XUE Yufeng，MENG Meilian，MA Zhiwei，LIU Zhihui，HU Jun*
（College of Agronomy，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot，Inner Mongolia 010019，China）

In recent years，the potato wilt is becoming more and more serious in Inner Mongolia.In order to identify the pathogen，some suspected samples were collected，isolated and identified in Inner Mongolia from 2009 to 2014. Morphologic characteristics，pathogenicity test and molecular method were used to identify the pathogen.The results showed that the main pathogen causing potato wilt was Fusarium oxysporum，F.tricinctum and F.solani in Inner Mongolia.For the growth of F.oxysporum，its optimal temperature was 25℃；the optimal pH was 7；the best culture medium was PDA，PSA and Bilais；the optimal carbon source was starch and maltose，and nitrogen source was peptone.For the growth of F.tricinctum，its optimal temperature was 20℃；the optimal pH was 7；the best culture medium was cornmeal agar and oatmeal media；and the optimal carbon source and nitrogen source were starch and carbamide.For the growth of F.solani，its optimal temperature was 30℃；the optimal pH was 7；the best culture medium was PSA；the optimal carbon source were glucose and sucrose，and nitrogen source was potassium nitrate.

potato wilt；Fusarium；pathogen identification；biological characteristic

S532

A

1672-3635（2016）04-0226-09

2015-03-12

國家現代馬鈴薯產業(yè)技術體系建設崗位專家專項（nycytx-15，gwzj-20）。

陳慧（1990-），女，碩士研究生，研究方向為馬鈴薯病害。

（Corresponding author）：胡俊，教授，研究方向為植物病害綜合防治，E-mail:hujun6202@126.com。