響應(yīng)面優(yōu)化西蘭花中蘿卜硫素復(fù)合提取工藝

胡翠珍，李　勝，*，馬紹英，曹寶臣，唐　斌，趙生琴，時(shí)振振，蘇利榮，周文政（.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.張掖匯通生物科技有限公司，甘肅張掖743000；3.甘肅順意生物科技有限公司，甘肅張掖743000）

響應(yīng)面優(yōu)化西蘭花中蘿卜硫素復(fù)合提取工藝

胡翠珍1，李勝1，*，馬紹英1，曹寶臣1，唐斌1，趙生琴1，時(shí)振振1，蘇利榮1，周文政2，3
（1.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.張掖匯通生物科技有限公司，甘肅張掖743000；3.甘肅順意生物科技有限公司，甘肅張掖743000）

以西蘭花鮮食部分綠色幼嫩花莖和花蕾為實(shí)驗(yàn)材料，利用響應(yīng)面對(duì)添加劑和超聲波輔助酶解西蘭花提取蘿卜硫素工藝進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)在單因素基礎(chǔ)上選取四種添加劑抗壞血酸、EDTA、MgSO4、CaCl2，根據(jù)Central Composite中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法，確定各因素對(duì)蘿卜硫素提取率的影響程度，獲得該四因素最佳提取條件為：抗壞血酸4.659 mmol/L，EDTA 6 mmol/L，MgSO48.5 mmol/L，CaCl24.0 mmol/L，蘿卜硫素理論最大提取率達(dá)1858.20 μg/g。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證達(dá)1813.26 μg/g，其相對(duì)誤差為2.48%，表明該提取工藝參數(shù)在西蘭花中提取蘿卜硫素是可行的。

蘿卜硫素，酶解，添加劑，單因素，響應(yīng)面

西蘭花（Brassica oleracea L.ver.Italica Plenck），屬十字花科（Cruciferae）蕓薹屬（Brassica）甘藍(lán)種的一個(gè)變種［1］。其雖不是總硫代葡萄糖苷（Glucosinolates）含量最高的蔬菜，但其活性大的硫代葡萄糖苷含量較高［2］。

蘿卜硫素（1-異硫氰酸-4-甲磺酰基丁烷）（Sulforaphane），分子式為：C6H11S2NO。蘿卜硫素具有獨(dú)特的抗癌功效［3］。它可以造成癌細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞阻滯［4］，同時(shí)可以誘導(dǎo)人體內(nèi)的Ⅱ相解毒酶［5］，同時(shí)抑制Ⅰ型酶的產(chǎn)生［6］，最終通過多種酶體系排出致癌物和自由基等有害成分，同時(shí)，該成分不會(huì)在人體內(nèi)殘留，是一種新型的抗癌成分。

目前蘿卜硫素制備方法主要有化學(xué)合成法［7］和酶法［8］。因?yàn)樘}卜硫素具有旋光異構(gòu)體，并且基團(tuán)活性強(qiáng)，因此化學(xué)合成法過程雖簡(jiǎn)單卻難以控制反應(yīng)條件，并且成本高昂，實(shí)際生產(chǎn)中較少應(yīng)用。十字花科植物中均含有硫代葡萄糖苷和其水解酶［9］，但是其分布在植物的不同部位，前者一般貯存于植物細(xì)胞液中［10］，而后者則位于特定的蛋白體中［11］，當(dāng)植株受到諸如咀嚼、研磨等而引起組織破壞時(shí)，原本存在于蛋白體中的芥子酶便得以釋放［12］，水解硫代葡萄糖苷，生成蘿卜硫素的前體物質(zhì)-異硫氰酸鹽（Isothiocyanates）。黃肖欽等［13］、袁海娜等［14］和Yuan-feng Wu等［15］在蘿卜硫素的提取研究中，均是利用十字花科植物自身芥子酶水解出蘿卜硫素，但植物中芥子酶含量低，不能完全釋放，導(dǎo)致酶解時(shí)間長(zhǎng)，效率低，且實(shí)際生產(chǎn)操作中，易有微生物污染。本實(shí)驗(yàn)擬利用西蘭花為原材料，通過添加外源芥子酶，提高酶濃度，酶解時(shí)添加不同添加劑，再借助超聲波輔助有機(jī)提取法，利用響應(yīng)面法優(yōu)化酶解條件，建立高效的蘿卜硫素提取方法，以期為西蘭花中蘿卜硫素的大量提取提供技術(shù)參考和理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮采摘中青2號(hào)西蘭花鮮食部分綠色幼嫩花莖和花蕾甘肅順意公司提供；蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)品購于美國(guó)Sigma公司，純度＞98%；95%的乙醇（分析純）、乙酸乙酯（分析純）、甲醇（色譜純） 均購于天津光復(fù)精細(xì)化工所。

RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；DS-8510DTH型超聲波振蕩儀上海生析超聲儀器有限公司；高效液相色譜儀系統(tǒng)（配有可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器和島津Lcsolution 15c色譜工作站）日本島津公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1蘿卜硫素提取工藝取80℃下脫水1 h，后在60℃下脫水至恒重的西蘭花，粉碎，過60目篩，得西蘭花干粉，稱取干粉5 g置于三角瓶中待用。另取新收獲芥籽，粉碎，過60目篩，稱取0.5 g至三角瓶中，加25 mL蒸餾水，超聲波振蕩20 min，過濾除雜得粗酶液。根據(jù)李娟等［16］的方法描述改進(jìn)，測(cè)得粗酶液的活性為0.934 μmol/（min·g）。向西蘭花干粉中加入粗酶液25 mL，對(duì)照組以蒸餾水代替粗酶液，在酶解體系中加入不同濃度的添加劑（抗壞血酸、EDTA、MgSO4、CaCl2）。在不同溫度下酶解一定的時(shí)間后，加入95%乙醇100 mL超聲波輔助提取0.5 h，靜置0.5 h，過40目篩子除去西蘭花粉，65℃旋蒸濃縮至粘稠狀，按體積比1∶1加入乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，60℃旋蒸濃縮至乙酸乙酯完全揮發(fā)，最后甲醇定容至25 mL，待測(cè)。

1.2.2蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備將蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐級(jí)稀釋成濃度為100、75、50、25 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。進(jìn)行HPLC色譜分析，以測(cè)定的蘿卜硫素峰面積為橫坐標(biāo)（X），蘿卜硫素提取率為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸。

1.2.3蘿卜硫素的HPLC分析取甲醇定容后的樣液1 mL，稀釋10倍，過0.22 μm有機(jī)系濾膜，進(jìn)行高效液相色譜分析；色譜條件為：色譜柱：TP5-3260 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：V（甲醇）∶V（水）= 35∶65；流速：0.8 mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：201 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.4蘿卜硫素提取率計(jì)算公式

式中：蘿卜硫素濃度單位為μg/mL，蘿卜硫素提取率單位為μg/g，定容體積單位為mL，原料質(zhì)量單位為g。

1.2.5添加劑對(duì)蘿卜硫素提取率影響的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1抗壞血酸對(duì)蘿卜硫素提取率的影響按照

1.2.1所述方法提取蘿卜硫素，對(duì)照組以蒸餾水代替粗酶液。添加4 mmol/L的EDTA、4 mmol/L的MgSO4、4 mmol/L的CaCl2，酶解溫度30℃，酶解時(shí)間60 min，研究不同添加量（0、2.25、4.5、6.75、9 mmol/L）的抗壞血酸，對(duì)蘿卜硫素提取率的影響，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.5.2EDTA對(duì)蘿卜硫素提取率的影響按照1.2.1所述方法提取蘿卜硫素，對(duì)照組以蒸餾水代替粗酶液。添加4.5 mmol/L的抗壞血酸、4 mmol/L的MgSO4、4 mmol/L的CaCl2，酶解溫度30℃，酶解時(shí)間60 min，研究不同添加量（0、2、4、6、8 mmol/L）的EDTA，對(duì)蘿卜硫素提取率的影響，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.5.4MgSO4對(duì)蘿卜硫素提取率的影響按照1.2.1所述方法提取蘿卜硫素，對(duì)照組以蒸餾水代替粗酶液。添加4.5 mmol/L的抗壞血酸、4 mmol/L的EDTA、4 mmol/L的CaCl2，酶解溫度30℃，酶解時(shí)間60 min，研究不同添加量（0、4、8、12、16 mmol/L）的MgSO4，對(duì)蘿卜硫素提取率的影響，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.6酶解溫度對(duì)蘿卜硫素提取率的影響按照

1.2.1所述方法提取蘿卜硫素，對(duì)照組以蒸餾水代替粗酶液。添加4.5 mmol/L抗壞血酸、6 mmol/L的EDTA、8 mmol/L的MgSO4、4 mmol/L的CaCl2，酶解時(shí)間60 min，研究不同酶解溫度（20、30、40、50、60℃），對(duì)蘿卜硫素提取率的影響，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.7酶解時(shí)間對(duì)蘿卜硫素提取率的影響按照

1.2.1所述方法提取蘿卜硫素，對(duì)照組以蒸餾水代替粗酶液。添加4.5 mmol/L抗壞血酸、6 mmol/L的EDTA、8 mmol/L的MgSO4、4 mmol/L的CaCl2，酶解溫度30℃，研究不同酶時(shí)間（20、40、60、80、100 min），對(duì)蘿卜硫素提取率的影響，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.8響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Central Composite中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取四種添加劑影響最顯著的因素為自變量，設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平如表1所示。

表1　響應(yīng)面設(shè)計(jì)個(gè)因素水平Table 1　Factors and levels of RSM test

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

從歷史文化傳統(tǒng)的角度來看，我國(guó)自古就是一個(gè)刑法文化傳統(tǒng)十分發(fā)達(dá)的國(guó)家。從漢朝劉邦的“約法三章”到形成達(dá)12篇30卷502條的中華法系代表性法典《唐律疏議》的發(fā)展過程表明，我國(guó)的刑法懲罰范圍在不斷擴(kuò)張。在我國(guó)，國(guó)家早就習(xí)慣運(yùn)用刑法手段實(shí)現(xiàn)對(duì)社會(huì)生活的管理和控制。經(jīng)過數(shù)千年的積淀，國(guó)人也已經(jīng)認(rèn)同和接納了“要用刑罰來處理壞人”的思維方式，并將其內(nèi)化為中國(guó)人特有的社會(huì)心理。因此，降低起刑點(diǎn)，與我國(guó)的歷史文化傳統(tǒng)與國(guó)人的社會(huì)心理是能夠保持一致的。

數(shù)據(jù)以（Mean±SD）表示，SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析并采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（p≤0.05），用GraphPad Prism 6.0.1軟件處理數(shù)據(jù)和繪圖。

2　結(jié)果與分析

2.1蘿卜硫素回歸方程

進(jìn)行HPLC色譜分析（蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜分別見圖1、圖2，標(biāo)準(zhǔn)品在9.040 min處出現(xiàn)最高峰，樣品在8.924 min處出現(xiàn)峰值），以測(cè)定的蘿卜硫素峰面積為橫坐標(biāo)（X），蘿卜硫素提取率為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：

Y=0.00003X－0.5104，R2=0.9999

圖1　標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖Fig.1　HPLC chromatogram of standard sample

圖2　樣品色譜圖Fig.2　HPLC chromatogram of sample

2.2添加劑對(duì)蘿卜硫素提取率的影響

2.2.1抗壞血酸濃度對(duì)蘿卜硫素提率的影響添加不同濃度的抗壞血酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，蘿卜硫素的提取率隨著抗壞血酸濃度的升高而顯著提高，實(shí)驗(yàn)組抗壞血酸濃度達(dá)到4.5 mmol/L時(shí)提取率最高（1447.81 μg/g），而后隨著抗壞血酸含量的增高蘿卜硫素提取率下降。抗壞血酸是芥子酶的非競(jìng)爭(zhēng)性激化劑，抗壞血酸的添加有利于異硫氰酸鹽的生成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，添加劑抗壞血酸濃度適宜，有利于蘿卜硫素的提取，添加劑抗壞血酸濃度過高時(shí)，抑制蘿卜硫素的提取。

圖3　不同抗壞血酸濃度對(duì)蘿卜硫素提取率的影響Fig.3　Effect of different ascorbic acid concentrations on sulforaphane extraction rate

2.2.2EDTA濃度對(duì)蘿卜硫素提取率的影響研究不同濃度的EDTA對(duì)蘿卜硫素提取率的影響，由圖4可知，添加EDTA提取率顯著增高，說明添加EDTA可以提高蘿卜硫素提取率。隨添加EDTA濃度增大，蘿卜硫素的提取率明顯增加，實(shí)驗(yàn)組EDTA濃度達(dá)到6 mmol/L時(shí)提取率最高為1548.68 μg/g，而后隨著EDTA含量的增高蘿卜硫素提取率下降。

圖4　不同EDTA濃度對(duì)蘿卜硫素提取率的影響Fig.4　Effect of different EDTA concentrations sulforaphane on extraction rate

2.2.3不同濃度CaCl2對(duì)蘿卜硫素提取率的影響添加不同濃度的CaCl2實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，隨添加CaCl2濃度的增加，蘿卜硫素提取率顯著增高，說明添加CaCl2可以提高蘿卜硫素提取率。實(shí)驗(yàn)組CaCl2濃度達(dá)到4 mmol/L時(shí)提取率最高，為1447.667 μg/g，而后隨著CaCl2濃度的增高蘿卜硫素提取率下降。添加劑CaCl2濃度適宜，有利于蘿卜硫素的提取，添加CaCl2濃度過高時(shí)抑制了蘿卜硫素的提取。

圖5　不同CaCl2濃度對(duì)蘿卜硫素提取率的響Fig.5　Effect of different CaCl2concentrations on sulforaphane extraction rate

2.2.4不同濃度MgSO4對(duì)蘿卜硫素提取率的影響由圖6所示，隨著MgSO4添加量的增大，蘿卜硫素提取率顯著增高，在MgSO4濃度達(dá)到8 mmol/L時(shí)提取率最高，達(dá)1490.923 μg/g，而后隨著MgSO4濃度的增高蘿卜硫素提取率下降。說明添加適宜濃度MgSO4有利于提高蘿卜硫素的提取。

圖6　不同MgSO4對(duì)蘿卜硫素提取率的影響Fig.6　Effect of different MgSO4concentrations on sulforaphane extraction rate

2.3不同酶解時(shí)間對(duì)蘿卜硫素得率的影響

在不同的酶解時(shí)間下提取蘿卜硫素結(jié)果如圖7所示。酶解時(shí)間小于60 min時(shí)，隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，提取效率顯著提高，實(shí)驗(yàn)組可達(dá)1447.867 μg/g，而后隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，提取得率反而下降。酶解時(shí)間過短，蘿卜硫素提取不充分，提取率低，而達(dá)到適宜的酶解時(shí)間后，蘿卜硫素充分提取，提取率高。酶解時(shí)間過長(zhǎng)，可能蘿卜硫素開始降解，從而導(dǎo)致蘿卜硫素得率降低。

圖7　不同酶解時(shí)間對(duì)蘿卜硫素提取率的影響Fig.7　Effect of different enzymolysis time on sulforaphane extraction rate

2.4不同提取溫度對(duì)蘿卜硫素提取率的影響

在不同溫度下提取蘿卜硫素結(jié)果如圖8所示。隨溫度升高，蘿卜硫素提取率明顯增加，當(dāng)溫度達(dá)30℃時(shí)提取率達(dá)到最高（實(shí)驗(yàn)組可達(dá)1447.867 μg/g），而后隨著溫度的升高，蘿卜硫素提取率反而下降。在適宜的溫度下，芥子酶活性高，有利于硫代葡萄糖苷的水解；當(dāng)溫度過高時(shí)，芥子酶活性大大降低；也可能是高溫使蘿卜硫素部分分解，從而導(dǎo)致提取率下降。

圖8　不同溫度對(duì)蘿卜硫素提取率的影響Fig.8　Effect of different temperatures on sulforaphane extraction rate

2.5響應(yīng)面優(yōu)化酶解過程輔助因子的添加

2.5.1蘿卜硫素提取率預(yù)測(cè)模型方程的建立及顯著性分析各處理組合的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，用Design Expert 9.0軟件對(duì)表2中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析后得到二階響應(yīng)表面模型方程：

Y=1848.92－6.83A＋37.08B＋38.96C＋8.64D＋43.4AB-104AD－32.98BC－19.87BD－29.12CD－139.54A2－64.57B2－60.58C2－116.18D2

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。

從表3中可以看出，模型顯著性檢驗(yàn)p＜0.05，表明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。失擬項(xiàng)用來表示所用模型與實(shí)驗(yàn)擬合的程度，即二者差異的程度。從表3可以看出失擬項(xiàng)p=0.8468＞0.05，表明失擬不顯著。模型的校正決定系數(shù)R2adj=0.8995，說明該模型能解釋約89.95%響應(yīng)值的變化；決定系數(shù)R2=0.948，說明該模型擬和程度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小，該模型能夠較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。可以利用該回歸方程確定最佳提取工藝條件。

通過該方程，各因素之間存在著一定的交互作用，其中AD、A2、B2、C2、D2均呈極顯著影響（p＜0.01），B、C、AB呈顯著性影響（p＜0.05），A、D、AC、BC、BD、CD均呈不顯著。

從單因素水平觀察，可以得出其影響順序?yàn)椋篊（MgSO4）＞B（EDTA）＞D（CACl2）＞A（抗壞血酸）。在有交互作用存在下，對(duì)西蘭花中蘿卜硫素提取的影響順序?yàn)椋篈D＞AB＞BC＞CD＞BD＞AC。

2.5.2響應(yīng)面分析響應(yīng)面圖像曲線走勢(shì)越陡，其影響越顯著；走勢(shì)越平滑，其影響越小。由實(shí)驗(yàn)各因素之間兩兩交互作用的響應(yīng)面圖像觀察，圖9、圖11曲線走勢(shì)陡峭，影響顯著。由圖9～圖14響應(yīng)面立體圖可以看出，響應(yīng)面存在極值，即響應(yīng)面有最高點(diǎn)，進(jìn)一步通過Design-expert 9.0軟件分析計(jì)算可知，當(dāng)抗壞血酸濃度為4.577 mmol/L，EDTA為6.232 mmol/L，MgSO4為8.534 mmol/L，CaCl2為3.971 mmol/L，蘿卜硫素提取得率達(dá)到最大值為1858.20 μg/g。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，添加抗壞血酸濃度為4.659 mmol/L，EDTA為6 mmol/L，MgSO4為8.5 mmol/L，CaCl2為4.0 mmol/L，重復(fù)三次，得到蘿卜硫素平均提取率為1813.26 μg/g，相對(duì)誤差為2.48%，二者非常接近，說明該工藝穩(wěn)定可行適合蘿卜硫素的提取。

表2　響應(yīng)面設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 2　Program and results of RSM test

圖9　Y=f（A，B）的響應(yīng)面Fig.9　Responsive surface plot Y=f（A，B）

表3　提取率回歸分析Table 3　Results of extraction rate regression analysis

圖10　Y=f（A，C）的響應(yīng)面Fig.10　Responsive surface plot Y=f（A，C）

圖11　Y=f（A，D）的響應(yīng)面Fig.11　Responsive surface plot Y=f（A，D）

圖12　Y=f（B，C）的響應(yīng)面Fig.12　Responsive surface plot Y=f（B，C）

圖13　Y=f（B，D）的響應(yīng)面Fig.13　Responsive surface plot Y=f（B，D）

圖14　Y=f（B，D）的響應(yīng)面Fig.14　Responsive surface plot Y=f（B，D）

3　討論

影響蘿卜硫素提取關(guān)鍵的因素是酶解反應(yīng)。西蘭花的次生代謝產(chǎn)物硫代葡萄糖苷在芥子酶的水解下可生成一分子葡萄糖和一分子不穩(wěn)定的糖苷配基，這個(gè)不穩(wěn)定分子依賴金屬離子濃度和抗壞血酸濃度重排形成不同的產(chǎn)物［16］—異硫氰酸酯、腈［17］、惡唑烷硫酮等物質(zhì)，如圖15所示。

圖15　硫代葡萄糖苷水解示意圖Fig.15　Hydrolysis of glucosinolates schematic

植物芥子酶的一個(gè)顯著特征是：低抗壞血酸濃度能激活酶，而高抗壞血酸濃度卻抑制酶，然而在缺乏抗壞血酸時(shí)芥子酶又完全無活性。添加4.5 mmol/L的抗壞血酸，蘿卜硫素的提取率較未添加抗壞血酸時(shí)增加了1.5倍，與Maik等［18］研究低濃度的抗壞血酸能提高芥子酶活性一致。這是由于抗壞血酸鹽的結(jié)合位點(diǎn)不同于葡萄糖結(jié)合位點(diǎn)［19］，但與糖苷配基結(jié)合位點(diǎn)重疊，在硫代葡萄糖苷水解生成糖苷配基后，抗壞血酸使酶構(gòu)像發(fā)生了輕微的改變，可能代替了芥子酶中的催化基團(tuán)起作用，提高了芥子酶活性，從而促進(jìn)了蘿卜硫素的生成。在酶解過程中，抗壞血酸和CaCl2具有交互作用，同時(shí)添加提高了蘿卜硫素的提取率，與Ludikhuyze等［20］實(shí)驗(yàn)抗壞血酸和鈣離子結(jié)合增強(qiáng)芥子酶活性的研究一致。添加適量的EDTA提高了蘿卜硫素的提取率，可能是EDTA作為金屬離子螯合劑，消除了微量重金屬導(dǎo)致的酶促化學(xué)反應(yīng)中的抑制作用，具體作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。在本實(shí)驗(yàn)中，添加抗壞血酸、EDTA、MgSO4和CaCl2均能提高蘿卜硫素的提取率，但提取率隨著組合的不同而存在明顯的差異，同時(shí)添加4.659 mmol/L的抗壞血酸，6 mmol/L的EDTA，8.5 mmol/L的MgSO4，4.0 mmol/L的CaCl2，有最高的提取率。

4　結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明添加劑抗壞血酸、EDTA、MgSO4、CaCl2各因素及其二項(xiàng)式對(duì)蘿卜硫素提取率均有顯著影響。綜合考慮各方面的因素，添加外源芥子酶提取蘿卜硫素的優(yōu)化條件為抗壞血酸添加量為4.659 mmol/L，EDTA為6 mmol/L，MgSO4為8.5 mmol/L，CaCl2為4.0 mmol/L，在30℃下酶解60 min。蘿卜硫素提取率理論得率達(dá)到最大值為1858.20 μg/g。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得1813.26 μg/g，其相對(duì)誤差為2.48%，表明該提取工藝參數(shù)在西蘭花中提取蘿卜硫素是可行的。

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Response surface optimizes the compound extraction process of sulforaphane from broccoli

HU Cui-zhen1，LI Sheng1，*，MA Shao-ying1，CAO Bao-chen1，TANG Bin1，ZHAO Sheng-qin1，SHI Zhen-zhen1，SU Li-rong1，ZHOU Wen-zheng2，3
（1.Gansu Provincial Key Lab of Arid land Crop Science，College of Life Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Lanzhou Huitong Bio-Technology Co.，Ltd.，Zhangye 743000，China；3.Gansu Shunyi Bio-Technology Co.，Ltd.，Zhangye 743000，China）

The green young stems and buds of broccoli were used as experimental material，the enzymolysis condition of sulforaphane extraction from broccoli was optimized by response surface method.According to central composite experiment design principle and using response surface analysis of four factors and three levels，four additives including ascorbic acid，EDTA，MgSO4，CaCl2were chosen on the basis of the single factor to determine the impact of various factors on the extraction rate of sulforaphane.The optimum extraction conditions were as follows：ascorbic acid 4.659 mg/g，EDTA 6 mmol/L，MgSO48.5 mmol/L，CaCl24.0 mmol/L. The theoretical maximum extraction rate of sulforaphane was 1858.20 μg/g，and the value reached 1813.26 μg/g in the experiment，the relative error was 2.48%，which indicated that the extraction process parameter above was feasible in sulforaphane extraction from broccoli.

sulforaphane；enzymolysis；additive；single factor；response surface

TS201.1

B

1002-0306（2016）04-0271-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.046

2015－06－15

胡翠珍（1989-），女，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物的提取與開發(fā)，E-mail：zhonglarkspur@163.com。

李勝（1970-），男，博士，教授，研究方向：植物細(xì)胞工程與次生代謝調(diào)控，E-mail：lish@gsau.edu.cn。

蘭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014-1-183）；教育部新教師基金（20096202120008）；國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃（201210733009）；甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)本科生科研訓(xùn)練計(jì)劃（20140824，20140825）；甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)盛彤笙科技創(chuàng)新基金（2015）。