HPLC-PAD法測定不同品種核桃分心木中沒食子酸、柚皮素

買買提·吐爾遜，阿吉姑·阿布都熱西提，熱薩萊提·伊敏，賈淑平，麥麥提·艾在孜（.喀什大學化學與環(huán)境科學學院，新疆喀什844007；2.新疆特色藥食用植物資源化學重點實驗室，新疆喀什844007）

HPLC-PAD法測定不同品種核桃分心木中沒食子酸、柚皮素

買買提·吐爾遜1，2，阿吉姑·阿布都熱西提1，2，熱薩萊提·伊敏1，2，賈淑平1，2，麥麥提·艾在孜1
（1.喀什大學化學與環(huán)境科學學院，新疆喀什844007；2.新疆特色藥食用植物資源化學重點實驗室，新疆喀什844007）

目的：建立采用超聲提取，反相高效液相色譜-二極管陣列檢測法測定核桃分心木中沒食子酸和柚皮素的含量的方法。方法：色譜柱：安捷倫HC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫；檢測波長：276 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min。結果：沒食子酸和柚皮素分別在2.0～80 μg/mL（r=0.9999）和1.0～60 μg/mL（r=0.9999）濃度范圍內呈良好的線性關系，平均回收率分別為99.7%（RSD=1.84%，n=5）和101.2%（RSD=2.65%，n=5）。分心木中含有具有抗炎、抗病毒、抗菌的沒食子酸和柚皮素，平均含量分別為268.3 μg/g和102.2 μg/g。結論：HPLC-PAD測定沒食子酸和柚皮素的方法簡便、快速、有效、靈敏、準確、具有良好的重復性和回收率，可作為分心木中沒食子酸和柚皮素的定量分析方法。

反相高效液相色譜法，分心木，沒食子酸，柚皮素

核桃分心木（Juglans regia.），又稱核桃隔膜，也叫胡桃衣（《本草再新》）、胡桃夾（《現代實用中藥》），是胡桃科核桃屬植物核桃的果核內木質隔膜［1］。顏色淡肉色，味道苦澀，易折斷，可以長期保存。在維吾爾醫(yī)學中，分心木常用來治療口腔潰瘍、咽炎、牙齦出血、瀉痢等疾病。具有補腎、驅寒等功能，是南疆廣大農牧民家庭必備的民間良藥［2-3］。分心木是新疆廣大農牧民家庭必備的民間良藥，每家每戶都會存放分心木，在新疆民間的儲藏量較大。新疆盛產核桃，核桃品種繁多，有紙皮核桃、薄皮核桃、石頭核桃等。另外，新疆的少數民族將分心木與石榴外皮配合用于染發(fā)、染布等，是天然的染料。對新疆豐富的分心木資源進行研究利用，變廢為寶，能為當地的社會經濟發(fā)展做出一定貢獻。

目前，對分心木有效成分以及總黃酮含量的測定有研究報道［4-7］，其中沒食子酸和柚皮素是核桃仁膜中的主要活性成分，具有抗炎、抗病毒、抗菌、祛痰、止咳、平喘等作用，但是尚未見用高效液相色譜方法同時測定其含量的相關報道。因此，研究其沒食子酸和柚皮素等有效成分具有十分重要的實踐意義。而高效液相色譜法以操作簡單、準確度高、重復性好等優(yōu)點被廣泛用于多種有效成分的含量測定。本文以五個常見核桃品種分心木作為研究對象，提取其中的沒食子酸和柚皮素，建立測定其含量的高效液相色譜-二極管陣列檢測方法，為新疆豐富的核桃資源的進一步研究和開發(fā)利用提供參考依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

沒食子酸對照品、柚皮素對照品中國藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈色譜純，天津市光復精細化工研究所；水高純水；其他試劑均為分析純；五個品種核桃分心木2014年和2015年初分批采購于喀什市中亞南亞大市場；紙皮核桃和田墨玉；薄皮核桃阿克蘇溫宿；石頭核桃喀什葉城；晚實核桃和田墨玉；新早豐核桃阿克蘇溫宿。

LC-20AT高效液相色譜儀配有SPD-M20A二極管陣列檢測器，DGU-20A5在線脫氣機，LC-solution工作站，日本島津公司；KQ3200DE型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；XA-1型多功能粉碎機江蘇姜堰市分析儀器廠；ZK-82B真空干燥箱上海市實驗儀器總廠；BS224S型電子天平德國賽多利斯公司；0.22 μm微孔過濾膜。

1.2實驗方法

1.2.1檢測波長對沒食子酸和柚皮素對照品混合液在200～500 nm之間進行紫外-可見光譜掃描，并從二極管陣列檢測器采集的樣品三維圖譜中提取紫外光譜和不同波長的色譜進行對比，最后確定最適宜檢測波長。

1.2.2色譜條件色譜柱：安捷倫HC-C18柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流動相：甲醇（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；檢測波長：276 nm，柱溫：30℃；進樣量：20 μL。

1.2.3標準品溶液的配制準確稱取沒食子酸及柚皮素對照品各10.0 mg置于50 mL容量瓶中，用甲醇使其溶解并定容至刻度，搖勻，得200 μg/mL沒食子酸及柚皮素對照品標準儲備溶液，在冰箱里保存（5℃）。使用時根據需要混合并稀釋至所需濃度，得到沒食子酸及柚皮素濃度分別為0.5、1.0；2.0、5.0；10、10；20、20；40、40；80、60 μg/mL的6組標準混合溶液。

1.2.4樣品溶液的制備取不同品種核桃分心木各適量，經重蒸餾水洗凈，放入真空干燥箱內在60℃下干燥4 h，用多功能粉碎機粉碎，過40目篩。

沒食子酸和柚皮素分析樣品的制備：準確稱取已粉碎過篩的不同品種核桃分心木1.0 g，用50 mL 50%甲醇浸泡2 h后，超聲提取20 min，使其完全溶解，再次超聲10 min，過濾，并用純甲醇沖洗濾紙，減壓蒸餾至近干，用甲醇定容至25 mL，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液置于冰箱備用。

2　結果與討論

2.1檢測波長的確定

沒食子酸和柚皮素標準品紫外-可見光譜圖及從二極管陣列檢測器采集的樣品三維圖譜中提取紫外光譜和不同波長的色譜進行對比結果，當檢測波長為276 nm時沒食子酸和柚皮素都有較強吸收。因此，結合相關文獻［8-9］確定276 nm作為檢測波長，沒食子酸和柚皮素的紫外吸收曲線見圖1。

圖1　沒食子酸和柚皮素的紫外吸收曲線Fig.1　Absorption spectrum of gallic acid and naringenin

2.2流動相的選擇

根據文獻，并結合樣品實際成分分別采用不同流動相［10-11］，對樣品的分離情況進行考察，當甲醇（A）/0.1%磷酸（B）作流動相，按時間：0～10～20～45 min，甲醇（A）濃度：20%～40%～55%～20%洗脫程序進行梯度洗脫時，沒食子酸和柚皮素與其他雜質峰得到了良好的分離?；旌蠘藴势泛蜆悠飞V圖見圖2和圖3。從圖2和圖3可以看出，樣品中目標物的出峰時間和標準品的出峰時間一致，沒食子酸和柚皮素的峰形對稱，都能實現基線分離，適合做定量分析。

圖2　沒食子酸和柚皮素標準色譜圖Fig.2　Chromatograms of mixed reference substances注：1為沒食子酸，2為柚皮素；圖3同。

圖3　不同提取法提取的分心木樣品溶液色譜圖Fig.3　Chromatograms of Juglandis fructus samples by different extraction methods

2.3提取溶劑及提取方法的選擇

分別用純乙醇或甲醇超聲、純乙醇或甲醇索氏提取、75%乙醇熱回流索氏提取法、50%甲醇超聲波提取法提取沒食子酸和柚皮素。從圖3可以看出，用50%甲醇浸泡2 h后，超聲提取20 min，放置10 min，再次超聲10 min，對沒食子酸和柚皮素的提取率最高，而且操作簡便，提取對比結果見圖3。通過浸泡加超聲能夠使溶劑充分滲透到樣品內部，將其所含的沒食子等有效成分盡可能完全地溶于溶劑之中，從而得到多成分混合提取液。故選擇浸泡2 h，超聲20 min，放置10 min，再次超聲10 min作為提取方法。

2.4線性關系和精密度實驗

分別精密吸取6組混合標準系列溶液20 μL，從低濃度到高濃度按1.2.2色譜條件測定其峰面積，每一組重復3次，以對照品濃度c（μg/mL）為橫坐標，峰面積A為縱坐標，進行線性回歸，得到的線性回歸方程、相關系數、線性范圍見表1。從表1的相關數據可以看出，沒食子酸和柚皮素的濃度與峰面積的線性關系良好。每一組標準溶液連續(xù)進樣3次，測定沒食子酸和柚皮素的峰面積，計算RSD分別為0.65%和0.82%，表明該檢測方法的精密度良好。

表1　線性回歸方程、相關系數、線性范圍Table 1　Linearity between peak area and concentration

2.5穩(wěn)定性及重現性實驗

穩(wěn)定性實驗：取樣品溶液，在12 h內每隔2 h進樣一次，進樣量20 μL，測定沒食子酸和柚皮素峰面積，相對標準偏差分別為1.21%、1.86%。結果表明：供試品溶液在12 h內基本穩(wěn)定。

重現性實驗：精密稱取紙皮核桃樣品5份，每份約1.0 g，按1.2.4配制樣品溶液，按1.2.2色譜條件進行測定，所得到的樣品中沒食子酸和柚皮素峰面積的RSD分別0.96%和1.14%，實驗結果表明重現性良好。

2.6加標回收率實驗

準確稱取已知沒食子酸和柚皮素含量的紙皮核桃分心木樣品5份，每份1 g左右，分別添加不同量的沒食子酸和柚皮素標準溶液，測定結果見表2。其平均回收率為沒食子酸99.7%，柚皮素101.2%。

2.7樣品含量測定結果

沒食子酸和柚皮素含量的測定：精密吸取不同批次不同品種核桃分心木樣品溶液20 μL進樣，按外標法計算樣品中沒食子酸和柚皮素的含量。測定結果見表3。從測定數據可以看出，產地為和田的晚實核桃分心木中沒食子酸和柚皮素的含量略高于其他品種核桃，分別為295.6 μg/g和115.7 μg/g。

表2　方法的回收率和精密度（n=5）Table 2　Recovery of the method（n=5）

表3　樣品中沒食子酸、柚皮素的測定結果（n=3）Table 3　Determination results of samples（n=3）

3　結論

本文用高效液相色譜-二極管陣列檢測法對不同產地不同品種核桃分心木中沒食子酸和柚皮素進行了測定，并建立了測定分心木中沒食子酸和柚皮素含量的方法。結果表明，選用的流動相梯度洗脫條件下基線平穩(wěn)，沒有出現漂移，沒食子酸和柚皮素基線分離，而且沒食子酸和柚皮素的周圍沒有干擾的雜質峰，分離效果較好。不同產地不同品種核桃分心木中沒食子酸和柚皮素含量之間有一定的差異，這可能與生長環(huán)境、采摘時間和個體差異有關。

本文所采用的測定方法操作簡便、快捷、靈敏度高、穩(wěn)定性好、測定結果準確可靠，適于測定核桃分心木中沒食子酸和柚皮素的含量。報道顯示［12-13］，分心木中含有較豐富的沒食子酸、柚皮素、香草酸、核桃素D等物質，本實驗測定出了柚皮素和沒食子酸，與上述研究結果一致。但由于實驗條件限制未能對其他成分進行測定，后續(xù)實驗需進一步完善。

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Determination of content of gallic acid，naringenin in Juglans regia. by HPLC-PAD

Mamat·TURSON1，2，Ajigul·ABUDUREXIT1，2，Risalat·EMIN1，2，JIA Shu-ping1，2，Mamat·EZIZ1
（1.College of Chemistry and Environmental Science，Kashgar University，Kashgar 844007，China；2.Laboratory of Xinjiang Native Medicinal and Edible Plant Resources Chemistry，Kashgar 844007，China）

Objective：The content of gallic acid and naringenin in Juglans regia.extrated by ultrasonic was determined by RP-HPLC.Mothod：RP-HPLC with Agilent HC-C18column（5 μm，250 mm×4.6 mm）and used CH3OH（A）-0.1%H3PO4（B）as the mobile phase with flow rate of 1.0 mL/min.Column temperature was 30℃and the detection wavelength was 276 nm.Result：There was a linear correlation between the concentration of gallic acid（2.0～80 μg/mL，r=0.9999）and naringenin（1.0～60 μg/mL，r=0.9999），respectively.The average recovery of gallic acid and naringen were 99.7%（RSD=1.84%，n=5），101.2%（RSD=2.65%，n=5），respectively. The result showed that the content of gallic acid and naringenin in Juglans regia.，which had pharmacodynamics as anti-inflammatory，antiviral and antibacterial，were 268.3 μg/g and 102.2 μg/g respectively.Conclusion：this method was simple，rapid，sensitive and accurate，and could be used to identify and evaluate the quantitative determination of gallic acid and naringenin in Juglans regia..

HPLC-PAD；Juglans regia.；gallic acid；naringenin

TS207.3

A

1002-0306（2016）04-0077-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.006

2015-05-22

買買提吐爾遜（1971-），男，碩士，教授，主要從事色譜分離分析、天然產物及藥物分析方面的研究，E-mail：maimat@126.com。

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金項目（201318101-15）。