鼠李糖乳桿菌發(fā)酵南瓜汁過程中揮發(fā)性物質(zhì)的變化

彭興興，林偉鋒，陳 中（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640）

鼠李糖乳桿菌發(fā)酵南瓜汁過程中揮發(fā)性物質(zhì)的變化

彭興興，林偉鋒，陳 中*
（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640）

為了比較不同發(fā)酵時間對鼠李糖乳桿菌發(fā)酵南瓜汁中揮發(fā)性成分的化學(xué)組成的影響，采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對發(fā)酵南瓜汁的揮發(fā)性成分進行分析鑒定。結(jié)果表明發(fā)酵時間不同，發(fā)酵南瓜汁中揮發(fā)性物質(zhì)在種類和含量上均存在差異，其中，發(fā)酵12 h時共鑒定出52種揮發(fā)性成分，含量較高的揮發(fā)性物質(zhì)主要是3-羥基-2-丁酮（16.06%）、2，4-二叔丁基苯酚（8.05%）、乙醇（6.84%）；發(fā)酵24 h時共鑒定出41種揮發(fā)性成分，含量較高的揮發(fā)性物質(zhì)主要是2，3-丁二酮（20.46%）、3-羥基-2-丁酮（10.8%）、乙酸（9.97%）；發(fā)酵36 h時共鑒定出40種揮發(fā)性成分，含量較高的揮發(fā)性物質(zhì)主要是乙酸（13.98%）、2，3-丁二酮（12.35%）、3-羥基-2-丁酮（10.26%），發(fā)酵48 h時共鑒定出37種揮發(fā)性成分，含量較高的揮發(fā)性物質(zhì)主要是乙酸（21.48%）、3-羥基-2-丁酮（14.2%）、2，3-丁二酮（12.3%）。

發(fā)酵南瓜汁，頂空-固相微萃取，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，鼠李糖乳桿菌，揮發(fā)性成分

南瓜是一種人們生活中常見的瓜果類蔬菜之一，近年來人們研究發(fā)現(xiàn)南瓜不僅營養(yǎng)豐富，而且含有大量生理活性物質(zhì)，具有多種藥用價值［1-2］，南瓜的綜合加工廣泛開展，市面上已涌現(xiàn)出各種南瓜加工品。關(guān)于南瓜的研究主要集中于加工工藝方面［1］，對其風(fēng)味的研究較少。

食品的風(fēng)味是構(gòu)成食品美感的最重要的因素。南瓜雖然具有令人喜愛的清香味，但在南瓜汁的加工過程中，需要經(jīng)過熱燙、均質(zhì)和殺菌等加工環(huán)節(jié)，這會使南瓜產(chǎn)生一定的“蒸煮味”，使得南瓜飲料不為人接受。飲料風(fēng)味可以通過益生菌發(fā)酵改善，利用乳酸菌發(fā)酵南瓜而制成的南瓜乳酸菌飲料，不僅具有良好的風(fēng)味，而且富含多種營養(yǎng)成分，提高了飲料的生物學(xué)價值，是一種保健功能很高的營養(yǎng)食品［3］。

國內(nèi)外已有對新鮮南瓜、南瓜汁及發(fā)酵南瓜汁的揮發(fā)性組分進行過研究，李瑜從南瓜中鑒定出44種化合物，從南瓜汁中鑒定出53種化合物［4］；周春麗等用固相微萃取分別從乳酸菌、酵母菌和二者混合發(fā)酵南瓜汁中鑒定出51、36和45種揮發(fā)性化合物［5］，但利用鼠李糖乳桿菌發(fā)酵南瓜汁過程中，其揮發(fā)性物質(zhì)變化的研究尚未見報道。

固相微萃?。⊿PME）是一種新的萃取技術(shù)，萃取條件溫和，萃取過程中風(fēng)味物質(zhì)損失少，現(xiàn)已廣泛用于食品風(fēng)味研究。本文通過頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)，對鼠李糖乳桿菌發(fā)酵南瓜汁過程中揮發(fā)性物質(zhì)的變化進行研究比較，并對其中一些物質(zhì)的形成機理做初步探索，從而為南瓜汁發(fā)酵飲料的生產(chǎn)提供一定技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

市售南瓜 購買于華南理工大學(xué)后勤集團，室溫貯藏；鼠李糖乳桿菌 源于華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院實驗室。

超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；隔水式保溫箱 上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；JM-L150膠體磨 溫州市龍灣永興張祥膠體磨廠；固相微萃取頭 75 μm CAR/PDMS；DSQ II氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 南瓜汁的制備 選擇較新鮮完好，且具有較適宜的成熟度的南瓜。將清洗后的南瓜先切成小顆粒備用，按照南瓜∶水（重量比）=1∶1的比例，將南瓜和水適量的逐漸放入膠體磨中研磨兩次，將研磨好的南瓜汁在90～95℃內(nèi)，殺菌加熱10 min。

1.2.2 樣品制備 將活化后的鼠李糖乳桿菌以106cfu/mL的接種量接入滅菌南瓜汁中，在37℃恒溫條件下分別發(fā)酵12、24、36、48 h，分別吸取發(fā)酵液8 mL 與1 g氯化鈉混合，加入到樣品瓶中，加蓋封口。

1.2.3 氣相色譜條件 參照Verzera A等［7］的方法，樣品通過TR-5ms彈性石英毛細色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）進行分離；升溫程序條件：起始溫度45℃，保留2 min，以5℃/min升到150℃，保持1 min，再以10℃/min升至220℃，保持4 min，載氣為高純氦氣（1.0 mL/min）；進樣口溫度250℃，分流比10∶1。

質(zhì)譜條件：電子轟擊電離（EI）離子源，電子能量70 eV；電子倍增器電壓350 V；離子源溫度230℃；傳輸線溫度250℃；質(zhì)量范圍35～350 m/z。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)采用Origin 8.0軟件處理分析，顯著性水平為0.05，當(dāng)p＜0.05時表示差異顯著。揮發(fā)性化合物的鑒定根據(jù)NIST08數(shù)據(jù)庫檢索，選擇正反匹配度均大于800的物質(zhì)作為有效的鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

利用SPME富集，通過GC-MS法對不同發(fā)酵時間點下南瓜汁揮發(fā)性組分進行檢測，根據(jù)氣相色譜、質(zhì)譜分析與譜圖檢索，揮發(fā)性風(fēng)味成分的鑒定結(jié)果見表1。

表1 不同發(fā)酵時間下發(fā)酵南瓜汁揮發(fā)性成分分析Table1 Volatile components of pumpkin fermentation juice with different duration

續(xù)表

續(xù)表

2.1 南瓜汁的揮發(fā)性物質(zhì)分析

由表1可見，南瓜汁的揮發(fā)性物質(zhì)經(jīng)質(zhì)譜鑒定出27種化合物，其中，醛酮類鑒定出8種，占19.28%；醇類鑒定出5種，占13.7%；酚類物質(zhì)2種，占8.89%；酸類1種，占1.1%；酯類2種，占3.31%；烷烴類6種，占6.22%；其他類2種，占1.15%。含量較高的揮發(fā)性物質(zhì)分別是己醛（13.4%）、2，4-二叔丁基苯酚（8.36%），在所有的揮發(fā)性成分中，含量最高的是醛酮類化合物，其次是醇類物質(zhì)，這一結(jié)果與李瑜和周春麗研究南瓜汁揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的結(jié)果是一致的［4-5］。一般說來，鏈狀的醇、醛、酮、酸、酯等化合物，在低分子量范圍內(nèi)由于揮發(fā)性強，官能團的比重大，官能團特有的氣味也較強烈。隨著分子碳鏈的增長，化合物的氣味也由果實香型→清香型→脂肪臭型的方向變化，而且氣味的持續(xù)性也隨著增強［7］。南瓜汁中具有較多C4-C9的醇類和醛酮類物質(zhì)，其中己醛、環(huán)丁醇、2-乙基己醇、1-戊醇、1-己醇的相對含量占26.61%，這對南瓜汁的清香風(fēng)味起著重要的貢獻作用，己醛具有清香和果香味，環(huán)丁醇、1-戊醇具有醉人的香氣。

2.2 發(fā)酵南瓜汁的揮發(fā)性物質(zhì)分析

由表1可以看出，經(jīng)過鼠李糖乳桿菌發(fā)酵南瓜汁產(chǎn)生的揮發(fā)性成分主要是醛酮類、酸類、醇類、酚類和酯類，共同成分包括2，3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮、乙酸、乙醇等29種物質(zhì)。另外，不同發(fā)酵時間南瓜汁揮發(fā)性成分分類比較結(jié)果如圖1所示，發(fā)酵時間不同，其揮發(fā)性物質(zhì)在種類和含量上均存在差異。

發(fā)酵12 h時，共鑒定出52種揮發(fā)性成分，其中，醛酮類物質(zhì)鑒定出12種，相對峰面積占25.09%；醇類物質(zhì)9種，相對峰面積占11.13%；酚類物質(zhì)3種，相對峰面積占10.99%；酯類物質(zhì)8種，相對峰面積占9.33%；酸類物質(zhì)7種，相對峰面積占8.2%。其中含量較高的揮發(fā)性成分是3-羥基-2-丁酮（16.06%）、2，4-二叔丁基苯酚（8.05%）、乙醇（6.84%）、乙酸（6.31%）、丁二酸二乙酯（5.51%）、2，3-丁二酮（4.42%）、2，4-二叔丁基-6-硝基苯酚（2.54%）。

圖1 不同發(fā)酵時間南瓜汁揮發(fā)性成分比較Fig.1 Comparation of volatile components in different fermentation duration

發(fā)酵24 h時，共鑒定出41種揮發(fā)性成分，其中，醛酮類15種，相對含量占41.51%；酸類4種，相對含量占12.52%；酯類5種，相對含量占9.81%；醇類5種，相對含量占4.33%，酚類3種，相對含量占2.14%。其主要的揮發(fā)性成分為2，3-丁二酮（20.46%）、3-羥基-2-丁酮（10.8%）、乙酸（9.97%）、丁二酸二乙酯（6.17%）、乙醇（2.08%）、丙酮（1.7%）。與發(fā)酵12 h相比，醛酮類化合物種類有所增多，且其相對含量顯著增加，而醇類和酚類化合物含量明顯下降。

發(fā)酵36 h時，共鑒定出40種揮發(fā)性成分，其中，醛酮類13種，含量為33.16%；酸類4種，含量為16.14%；酯類7種，含量為11.65%；醇類5種，含量為4.7%；酚類3種，含量為4.6%。其中含量較高的揮發(fā)性成分是乙酸（13.98%）、2，3-丁二酮（12.35%）、3-羥基-2-丁酮（10.26%）、丁二酸二乙酯（7.59%）、2，4-二叔丁基-6-硝基苯酚（3.15%）、肉桂酸乙酯（2.05%）、乙醇（2.02%）。與發(fā)酵24 h相比，酯類和酸類物質(zhì)含量開始增加，而醛酮類物質(zhì)含量有所下降。

發(fā)酵48 h時，共鑒定出37種揮發(fā)性成分，其中，醛酮類13種，占34.44%；酸類4種，占24.5%；酯類5種，

占12.71%；醇類5種，占6.47%；酚類3種，占2.21%。其主要的揮發(fā)性成分為乙酸（21.48%）、3-羥基-2-丁酮（14.2%）、2，3-丁二酮（12.3%）、丁二酸二乙酯（7.9%）、乙醇（2.48%）、肉桂酸乙酯（2.24%）、3-甲基-3-丁烯-1-醇（1.99%）。與發(fā)酵36 h相比，酯類和酸類含量進一步增加，酚類物質(zhì)含量顯著下降。

2.3 不同發(fā)酵時間南瓜汁的揮發(fā)性成分比較

2.3.1 醛酮類化合物 醛酮類化合物是發(fā)酵南瓜汁的主要風(fēng)味物質(zhì)，低級飽和脂肪醛具有強烈的刺激性氣味，隨著分子量的增加，其刺激性氣味減弱，并逐漸出現(xiàn)愉快氣味，低級飽和酮往往具有特殊香氣，但C15以上的脂肪甲基酮常會帶有油脂腐敗的臭氣［7］。無論是發(fā)酵12 h還是發(fā)酵24、36、48 h的南瓜汁，其揮發(fā)性成分中含量最高的都是醛酮類物質(zhì)，分別占揮發(fā)性化合物總含量的25.09%、41.51%、33.16%、34.44%，其中又以發(fā)酵24 h時的最高。經(jīng)過鼠李糖乳桿菌發(fā)酵12 h的南瓜汁中含醛酮類主要是3-羥基-2-丁酮（16.06%），發(fā)酵24 h的南瓜汁中含醛酮類主要是2，3-丁二酮（20.46%）、3-羥基-2-丁酮（10.8%），發(fā)酵36 h的南瓜汁中含醛酮類主要是2，3-丁二酮（12.35%）、3-羥基-2-丁酮（10.26%），發(fā)酵48 h的南瓜汁中含醛酮類主要是3-羥基-2-丁酮（14.2%）、2，3-丁二酮（12.3%），發(fā)酵過程中雖然南瓜汁中醛酮類主要物質(zhì)種類沒有發(fā)生改變，但是它們的相對含量卻一直在變。發(fā)酵南瓜汁中酮類物質(zhì)一部分是以糖類為底物，通過乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的，另有部分來自油酸及亞油酸等脂肪酸的氧化分解，醛類物質(zhì)來自氨基酸的降解［8-9］，也有研究認為醛類物質(zhì)的生成與美拉德反應(yīng)有關(guān)［10］。其中，2，3-丁二酮、3-羥基丁酮、壬酮是乳酸菌發(fā)酵所特有的揮發(fā)性成分，前二者具有清香氣味，后者具有新鮮味和土腥味，壬醛具有清香和動物脂味。隨著發(fā)酵時間的延長，羰基類物質(zhì)先增加后減少，這可能與鼠李糖乳桿菌在南瓜汁中的代謝活動有關(guān)，剛開始時南瓜汁中營養(yǎng)物質(zhì)豐富，鼠李糖乳桿菌利用南瓜汁的可發(fā)酵性糖，快速增長繁殖，將葡萄糖轉(zhuǎn)化為3-羥基-2-丁酮、2，3-丁二酮等一系列風(fēng)味物質(zhì)，醛酮類物質(zhì)快速增加，后來隨著發(fā)酵的繼續(xù)，南瓜汁中營養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，并伴隨著有害代謝物的累積，菌種活動受到抑制，醛酮類物質(zhì)慢慢減少。

2.3.2 醇和酚類化合物 短碳鏈的醇類通常具有芳香，碳數(shù)較多的飽和醇，其氣味逐步減弱以至無嗅感，酚類物質(zhì)一般具有特殊的芳香氣味。發(fā)酵南瓜汁中醇類物質(zhì)先大幅下降后緩慢上升，從11.13%降為4.33%后又升為6.47%，醇類物質(zhì)的變化與菌種種類以及菌種的胞內(nèi)酶有關(guān)，也與糖類、氨基酸的代謝有關(guān)［11］。發(fā)酵南瓜汁中酚類物質(zhì)似乎沒有明顯的變化規(guī)律，但從表1中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵南瓜汁中酚類主要物質(zhì)2，4-二叔丁基苯酚的含量發(fā)生顯著變化，發(fā)酵12、24、36、48 h后的南瓜汁中2，4-二叔丁基苯酚相對含量分別占8.05%、1.12%、1.07%、0.45%，從8.05%減少到0.45%。這可能與微生物的生理代謝活動能力有關(guān)，從一個環(huán)境進入另一個新的培養(yǎng)環(huán)境時，剛開始不適應(yīng)，經(jīng)過一段時間的調(diào)整后，鼠李糖乳桿菌通過改變體內(nèi)的分子組成包括酶和細胞結(jié)構(gòu)成分，逐漸可以把2，4-二叔丁基苯酚轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)。

2.3.3 酯類化合物 酯類物質(zhì)是由醇和酸的酯化作用生成的。酯類物質(zhì)廣泛存在于發(fā)酵食品中，揮發(fā)性高且閾值通常較低，極易被人的嗅覺感受器所感知，對食品風(fēng)味的影響起著重要作用。經(jīng)過發(fā)酵后的南瓜汁中酯類物質(zhì)含量明顯增多，且隨著發(fā)酵時間的延長，酯類含量逐漸上升，從最初的9.33%增長到12.71%，這是由于隨著發(fā)酵的進行，有機酸含量變多，而酸類易于和醇類結(jié)合生成酯，因而酯類物質(zhì)也隨之增加，一些酯類物質(zhì)的產(chǎn)生也有可能是由于微生物代謝所引起的。其中，丁二酸二乙酯、肉桂酸乙酯是含量最高的兩種芳香酯，其閥值較低，對發(fā)酵南瓜汁風(fēng)味的形成起關(guān)鍵作用，賦予發(fā)酵南瓜汁果香。

2.3.4 其他類化合物 酸類的產(chǎn)生可以通過乳酸菌的發(fā)酵作用產(chǎn)生，也可以通過氨基酸的代謝途徑生成。發(fā)酵時間越長，發(fā)酵南瓜汁中有機酸含量越高，其中主要是乙酸含量增多，發(fā)酵48 h乙酸含量增加到21.48%，這可能是鼠李糖乳桿菌在利用南瓜汁中的葡萄糖和果糖等糖類物質(zhì)發(fā)酵過程中，源源不斷地產(chǎn)生較多的乙酸及其他有機酸引起的結(jié)果。發(fā)酵南瓜汁揮發(fā)性有機酸主要為乙酸、2-甲基丁酸、2-乙基丁酸，前者表現(xiàn)酸味，后兩者表現(xiàn)奶酪味［12］。這些酸類物質(zhì)的產(chǎn)生使得發(fā)酵南瓜汁的風(fēng)味變得更加豐富。

3 結(jié)論

本研究通過頂空固相微萃取（HS-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)，經(jīng)過鼠李糖乳桿菌發(fā)酵南瓜汁后，從發(fā)酵12、24、36、48 h的南瓜汁中分別鑒定出52、41、40、37種揮發(fā)性物質(zhì)，四者共有的揮發(fā)性成分有29種，鼠李糖乳桿菌發(fā)酵南瓜汁中主要揮發(fā)性物質(zhì)為2，3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮、乙酸、丁二酸二乙酯、乙醇等物質(zhì)。發(fā)酵12 h時含量較高的揮發(fā)性物質(zhì)主要是3-羥基-2-丁酮（16.06%）、2，4-二叔丁基苯酚（8.05%）、乙醇（6.84%）；發(fā)酵24 h時含量較高的揮發(fā)性物質(zhì)主要是2，3-丁二酮（20.46%）、3-羥基-2-丁酮（10.8%）、乙酸（9.97%）；發(fā)酵36 h時含量較高的揮發(fā)性物質(zhì)主要是乙酸（13.98%）、2，3-丁二酮（12.35%）、3-羥基-2-丁酮（10.26%）；發(fā)酵48 h時含量較高的揮發(fā)性物質(zhì)主要是乙酸（21.48%）、3-羥基-2-丁酮（14.2%）、2，3-丁二酮（12.3%）。發(fā)酵時間不同，其揮發(fā)性物質(zhì)在種類和含量上均存在差異，有些物質(zhì)減少甚至?xí)В行┪镔|(zhì)增加。通過這些揮發(fā)性成分共同的作用分別賦予了四種發(fā)酵南瓜汁特有的風(fēng)味。

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The change of volatile compounds in fermentation pumpkin juice of Lactobacillus Rhamnose

PENG Xing-xing，LIN Wei-feng，CHEN Zhong*
（College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

In order to compare the difference of volatile components in Lactobacillus Rhamnose fermentation pumpkin juice with different fermentation duration，the volatile compounds were detected using headspacesolid-phase microextraction（HS-SPME）combined with gas chromatography-mass spectrometry.The results showed that the composition and content of volatiles had some differences with different fermentation duration.52 kinds of volatile components were identified with 12 hours fermentation.The volatile compounds with higher contents included 3-hydroxy-2-butanone（16.06%），2，4-2 tertiary butyl phenol（8.05%）and alcohol（6.84%）.41 kinds of volatile components were identified with 24 hours fermentation.The volatile compounds with higher contents included 2，3-butanedione（20.46%），3-hydroxy-2-butanone（10.8%）and acetic acid（9.97%）.40 kinds of volatile components were identified with 36 hours fermentation.The volatile compounds with higher contents included acetic acid（13.98%），2，3-butanedione（12.35%）and 3-hydroxy 2-butanone（10.26%）.37 kinds of volatile components were identified with 48 hours fermentation.The volatile compounds with higher contents included acetic acid（21.48%），3-hydroxy-2-butanone（14.2%）and 2，3-dione（12.3%）.

fermentation pumpkin juice；headspace-solid-phase microextraction；gas chromatography-mass spectrometry；Lactobacillus Rhamnose；volatile compounds

TS201.1

A

1002-0306（2016）08-0180-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.029

2015－10－08

彭興興（1990-），男，碩士研究生，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程，E-mail：wuhuanmin@126.com。

*通訊作者：陳中（1968-），男，副教授，研究方向：食品科學(xué)與工程，E-mail：chzhong@scut.edu.cn。