反應(yīng)條件對葡萄糖-甘氨酸模擬美拉德反應(yīng)體系中α-二羰基化合物生成的影響

黃啟瑞，曾茂茂，*，何志勇，秦 昉，陳 潔，2（.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫2422；2.江南大學(xué)食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇無錫2422）

反應(yīng)條件對葡萄糖-甘氨酸模擬美拉德反應(yīng)體系中α-二羰基化合物生成的影響

黃啟瑞1，曾茂茂1，*，何志勇1，秦 昉1，陳 潔1，2
（1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇無錫214122）

采用鄰苯二胺（OPD）衍生和HPLC定性定量考察了反應(yīng)條件（溫度、pH、時間和底物濃度比）對葡萄糖-甘氨酸模擬美拉德反應(yīng)體系中三種α-二羰基化合物3-葡萄糖醛酮（3-DG）、乙二醛（GO）和丙酮醛（MGO）生成的影響。結(jié)果表明：在80～140℃范圍內(nèi)溫度的升高會促進(jìn)體系中MGO和GO的生成，而3-DG在溫度達(dá)到110℃時達(dá)到峰值，隨后則開始下降。pH在5～9范圍內(nèi)對三種物質(zhì)的影響趨勢和溫度類似，MGO和GO的生成隨pH的升高而不斷增加，而3-DG在pH為6時含量達(dá)到最高，隨后急劇降低。3-DG和GO生成的速率隨著時間的延長逐漸降低，而在2 h內(nèi)MGO的生成速率則趨于恒定。葡萄糖的相對含量升高有利于3-DG的生成，而當(dāng)甘氨酸的相對含量較高時則會促進(jìn)MGO和GO的生成。本研究能夠?yàn)槊览路磻?yīng)中以α-二羰基化合物為中間產(chǎn)物的風(fēng)味物質(zhì)的生成機(jī)制研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

α-二羰基化合物，葡萄糖，甘氨酸，HPLC，反應(yīng)條件

美拉德反應(yīng)是食品加工過程中羰基化合物（還原糖等）與氨基化合物（氨基酸、肽和蛋白質(zhì)等）之間發(fā)生的一種非酶促褐變反應(yīng)。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物是加工食品色澤（如焙烤類食品的色澤）和濃郁芳香的各種風(fēng)味的主要來源，在食品生產(chǎn)中具有重要意義［1］。

α-二羰基化合物是美拉德反應(yīng)中的重要中間產(chǎn)物，可以由單糖、低聚糖或多聚糖在焦糖化反應(yīng)中的部分羥醛縮合和自動氧化產(chǎn)生的碎片生成，也可由阿馬多利化合物（Amadori compound）的降解產(chǎn)生。研究表明［2］，α-二羰基化合物如乙二醛（GO）、丙酮醛

（MGO）以及3-脫氧葡萄糖醛酮（3-DG）因能夠?qū)е碌鞍踪|(zhì)糖基化而造成細(xì)胞的損害，進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病及人體的衰老。

α-二羰基化合物相關(guān)研究多側(cè)重于在不同食品如咖啡［3］、披薩、烘焙類食品［4］、牛奶產(chǎn)品［5］、嬰兒食品［6］、香醋［2］和白酒［7］以及空氣懸浮顆粒［8］中的定性定量分析。亦有一些研究探討了α-二羰基化合物在單糖［9-10］、雙糖［11］的美拉德體系中形成的機(jī)理，然而反應(yīng)條件（如溫度、時間、pH和底物濃度比）對美拉德反應(yīng)中α-二羰基化合物生成的影響研究較少。α-二羰基化合物在美拉德反應(yīng)風(fēng)味的產(chǎn)生中具有關(guān)鍵作用，葡萄糖和甘氨酸是形成焦糖風(fēng)味的重要的前體物質(zhì)，研究該體系下α-二羰基化合物的形成對探索焦糖風(fēng)味和美拉德反應(yīng)終產(chǎn)物的形成有重要意義。本文以產(chǎn)生甜香型風(fēng)味物質(zhì)的葡萄糖/甘氨酸模擬美拉德反應(yīng)體系為研究對象，采用鄰苯二胺衍生反應(yīng)體系中產(chǎn)生的GO、MGO和3-DG生成其喹啉衍生產(chǎn)物，并采用HPLC進(jìn)行定性定量分析，考察不同條件如溫度、pH、反應(yīng)時間和底物濃度比對該模擬體系中產(chǎn)生的α-二羰基化合物（GO、MGO和3-DG）的影響，以期對采用美拉德反應(yīng)制備甜香型香精提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄糖、甘氨酸、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、鹽酸、鄰苯二胺、乙二醛水溶液（40%） 均為分析純，購自國藥集團(tuán)；甲基乙二醛、3-脫氧葡萄糖醛酮、喹喔啉、2-（2，3，4-三羥基丁基）-喹喔啉、2-甲基喹喔啉 均≥98%，購于北京百靈威公司。

Alliance 2695型高效液相色譜儀 美國Waters公司；DF-2型攪拌油浴鍋 金壇市水北科普實(shí)驗(yàn)儀器廠；HWS12型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PL2002型電子天平及FE20型pH計(jì) 瑞士Mettler Toledo公司；OKP型超純水器 上海淶科儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制、檢測限和定量限 分別配制2 mL濃度為2 mmol/L的喹喔啉（GO衍生物）、2-甲基喹喔啉（MGO衍生物）和2-（2，3，4-三羥基丁基）-喹喔啉（3-DG衍生物）的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，分別稀釋至0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1 mmol/L，渦旋混勻，過0.22 μm有機(jī)濾膜，采用HPLC進(jìn)行分析，測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。將0.05 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液逐步稀釋后衍生，以峰高3倍于噪聲對應(yīng)的濃度為檢測限，峰高10倍于噪聲所對應(yīng)的濃度為定量限，得到三種待測物質(zhì)的檢測限和定量限。

1.2.2 樣品中α-二羰基化合物的衍生 采用文獻(xiàn)方法［6］，配制0.05 mol/L的鄰苯二胺水溶液，取100 μL的美拉德反應(yīng)液，加入200 μL的鄰苯二胺水溶液，渦旋混勻，在25℃的黑暗環(huán)境下衍生2 h，過0.22 μm的針頭式過濾器后，采用HPLC分析。

1.2.3 HPLC分析 HPLC分析參考文獻(xiàn)方法［6］，色譜柱：安捷倫LiChrospher C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱；柱溫：40℃；紫外檢測波長：320 nm；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1 mL/min；流動相A：0.1%的甲酸水溶液，流動相B：甲醇，洗脫梯度見表1。

表1 流動相的梯度洗脫程序Table1 Gradient elution program of flow phase

1.2.4 反應(yīng)條件對體系中α-二羰基化合物的影響

1.2.4.1 溫度的影響 參考文獻(xiàn)方法［12］，取0.05 mol葡萄糖和0.05 mol甘氨酸加入磷酸鹽緩沖液中，使其濃度均為0.2 mol/L，用1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)到pH=7，最后定容到250 mL，分別于80、90、100、110、120、130、140℃下反應(yīng)2 h后置于冰水浴30 min終止反應(yīng)，隨后立即進(jìn)行測定。每組樣品重復(fù)三次。

1.2.4.2 pH的影響 參考文獻(xiàn)方法［13］，取0.05 mol的葡萄糖和0.05 mol的甘氨酸加入磷酸鹽緩沖液中，使其濃度均為0.2 mol/L，用1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl分別調(diào)節(jié)到pH為5、6、7、8、9，最后定容到250 mL。于120℃下反應(yīng)2 h后置于冰水浴30 min終止反應(yīng)，隨后立即進(jìn)行測定。每組樣品重復(fù)三次。

1.2.4.3 反應(yīng)時間的影響 取0.05 mol的葡萄糖和0.05 mol的甘氨酸加入磷酸鹽緩沖液中，使其濃度均為0.2 mol/L，用1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)到pH7，最后定容到250 mL。分別于120℃下反應(yīng)10、20、30、60、90、120 min后置于冰水浴中30 min終止反應(yīng)，隨后立即進(jìn)行測定。每組樣品重復(fù)三次。

1.2.4.4 反應(yīng)物摩爾比的影響 分別取0.05 mol的葡萄糖和0.05 mol的甘氨酸，0.025 mol的葡萄糖和0.075 mol的甘氨酸，0.075 mol的葡萄糖和0.025 mol的甘氨酸加入磷酸鹽緩沖液中，使葡萄糖和甘氨酸的濃度比分別為1∶3、1∶1、3∶1，用1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)到pH7，最后定容到250 mL。分別于120℃下反應(yīng)后置于冰水浴30 min終止反應(yīng)，隨后立即進(jìn)行測定。每組樣品重復(fù)三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-二羰基化合物的HPLC定性定量分析

圖1為三種α-二羰基化合物標(biāo)準(zhǔn)品及美拉德反應(yīng)液在320 nm下的HPLC色譜圖，可以看出美拉德反應(yīng)液中三種α-二羰基化合物3-DG、GO和MGO得到了較好的分離。三種α-二羰基化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、檢測限和定量限如表2所示，可以看出三種化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.9980。三種物質(zhì)的峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.48% ～6.86%之間，表明方法具有較好的穩(wěn)定性。三種物質(zhì)的檢測限為0.4976×10-5～3.0516×10-5mmol/L，定量限為2.488×10-5～33.907×10-5mmol/L。結(jié)果表明方法具

有較好的穩(wěn)定性、精密度和靈敏度。

圖1 三種α-二羰基化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液和美拉德反應(yīng)液的色譜圖Fig.1 The HPLC chromatograms of three α-dicarbonyl standards and maillard reaction solution

2.2 溫度對體系中α-二羰基化合物生成的影響

溫度對葡萄糖/甘氨酸模擬美拉德反應(yīng)體系中的α-二羰基化合物生成的影響如圖2所示，可以看出三種物質(zhì)的濃度變化趨勢有明顯差異，3-DG在80～90℃的范圍內(nèi)隨溫度的升高快速增加，當(dāng)溫度繼續(xù)升高時，其生成速率開始降低，當(dāng)溫度達(dá)到110℃時濃度達(dá)到峰值為0.4970 mmol/L，當(dāng)溫度高于110℃時，反應(yīng)液中的3-DG開始降低。MGO的濃度在80℃～140℃的范圍內(nèi)持續(xù)增加，GO的濃度在80～110℃范圍內(nèi)亦逐漸增加，但當(dāng)高于110℃時，其濃度開始降低，在高于120℃時濃度又開始呈上升趨勢。在80～130℃的范圍內(nèi)，3-DG的濃度要明顯高于GO和MGO的濃度。結(jié)果表明溫度的升高會促進(jìn)葡萄糖/甘氨酸模擬體系產(chǎn)生MGO和GO，有報(bào)道GO在105、115、125℃下，2 h后其含量的順序?yàn)?15℃＞105℃＞125℃［14］。Weenen等［15］發(fā)現(xiàn)GO的形成直接來源于醛糖或者相應(yīng)亞胺的逆縮醛反應(yīng)。本研究中，當(dāng)溫度高于120℃時，可能是溫度較高造成美拉德反應(yīng)的速度加快，導(dǎo)致醛糖的逆縮醛反應(yīng)加速造成生成的GO的含量增加。MGO含量隨著溫度的變化逐漸增加的現(xiàn)象與Martins［16］的結(jié)果一致。MGO是葡萄糖/甘氨酸體系中產(chǎn)生的主要α-二羰基化合物［16］，主要來源于阿馬多利產(chǎn)物逆向的羥醛縮合，而溫度升高有利于加速阿馬多利產(chǎn)物的逆向羥醛縮合。所以在本研究中可以看到溫度升高，造成美拉德反應(yīng)起始階段產(chǎn)生的阿馬多利產(chǎn)物逆向的羥醛縮合反應(yīng)加速，導(dǎo)致了MGO含量的增加。3-DG在溫度達(dá)到110℃時含量開始下降，這與Martins等［17］的結(jié)果不同，但是與其在較低溫度下的變化趨勢一致。Martins等［16］的研究認(rèn)為，3-DG來源于葡萄糖/甘氨酸體系中最重要的阿馬多利中間產(chǎn)物N-（1-脫氧-D-果糖）甘氨酸（DFG）和甘氨酸反應(yīng)的產(chǎn)物。在本研究中，在較低溫度下，阿馬多利產(chǎn)物和甘氨酸持續(xù)反應(yīng)導(dǎo)致3-DG的含量增加，當(dāng)溫度高于110℃時加速了3-DG向乙酸的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致其含量快速下降。α-二羰基化合物比如3-DG是具有高度活性的物質(zhì)，是產(chǎn)生褐變和風(fēng)味物質(zhì)的MR的中間產(chǎn)物［18］，在反應(yīng)后期溫度的升高加速了其與甘氨酸生成類黑精的反應(yīng)。

圖2 溫度對葡萄糖-甘氨酸美拉德反應(yīng)體系中3-DG，GO和MGO生成的影響Fig.2 The effect of temperature on the formation of 3-DG，GO and MGO in glucose-glycine maillard reaction system

2.3 pH對體系中α-二羰基化合物生成的影響

pH對葡萄糖/甘氨酸模擬美拉德反應(yīng)體系中的α-二羰基化合物生成的影響如圖3所示，可以看出3-DG酸性比堿性條件下生成較多，pH在5～6的范圍內(nèi)3-DG的濃度隨著pH的升高增加，而pH高于6時，3-DG的濃度開始急劇降低，當(dāng)pH達(dá)到8時，3-DG降低的速率開始降低，但還是隨著pH的升高濃度降低。在pH在5～9的范圍內(nèi)，GO和MGO的濃度隨著pH的升高不斷增加。到pH達(dá)到9時，三種中間產(chǎn)物的濃度大小為：MGO＞GO＞3-DG。結(jié)果表明pH的升高會促進(jìn)MGO 和GO的生成，但會促進(jìn)3-DG的轉(zhuǎn)化。較低的pH條件有利于阿馬多利產(chǎn)物進(jìn)行1，2-烯醇化產(chǎn)生3-DG，故

在酸性條件下，3-DG的濃度較高。而高pH條件下有利于加強(qiáng)阿馬多利產(chǎn)物2，3-烯醇化的程度，抑制了3-DG的生成，促進(jìn)了MGO和GO的生成［19］。Martins等［16］研究了5.5和6.8兩個pH條件下生成的3-DG和MGO的含量變化，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。

表2 三種α-二羰基化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、檢測限、定量限、精密度和回收率Table2 The regression equation，limit of detection，limit of quantitation of three α-dicarbonyl standards

圖3 pH對葡萄糖-甘氨酸美拉德反應(yīng)體系中3-DG，GO和MGO生成的影響Fig.3 The effect of initial pH on the formation of 3-DG，GO and MGO in glucose-glycine maillard reaction system

2.4 反應(yīng)時間對體系中α-二羰基化合物生成的影響

反應(yīng)時間對葡萄糖/甘氨酸模擬美拉德反應(yīng)體系中的α-二羰基化合物生成的影響如圖4所示，可以看出3-DG隨著時間變化濃度的變化和GO變化的規(guī)律基本一致，在10～20 min濃度逐漸上升，而在20～30 min濃度開始下降，當(dāng)反應(yīng)時間達(dá)到30 min時濃度又開始上升，反應(yīng)時間達(dá)到60 min時，濃度達(dá)到最大值，3-DG和GO的最大濃度分別達(dá)到0.4488 mmol/L 和0.1670 mmol/L，繼續(xù)反應(yīng)產(chǎn)生的3-DG和GO濃度則開始下降。MGO的濃度隨著反應(yīng)時間的延長，濃度持續(xù)增加，在反應(yīng)時間10～120 min的過程中，濃度一直增加到0.1479 mmol/L。結(jié)果表明：3-DG和GO兩種物質(zhì)生成的速率隨著時間的延長逐漸降低，而在2 h 內(nèi)MGO的生成速率趨于恒定。在反應(yīng)的后期階段，3-DG這種重要的中間產(chǎn)物含量達(dá)到穩(wěn)定，表征反應(yīng)達(dá)到平衡，而MGO以及GO作為反應(yīng)支路的末端產(chǎn)物隨著反應(yīng)的進(jìn)行含量一直在增加。在本實(shí)驗(yàn)中3-DG 和MGO隨時間的變化趨勢和Martins等［17］的結(jié)果一致，而GO的結(jié)果與呂夢莎［14］的結(jié)果相似，其結(jié)果中125℃時GO的濃度從15 min后開始下降，可能是因?yàn)槠渌玫臏囟容^高造成反應(yīng)的速率較快，導(dǎo)致與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有所差異。

圖4 反應(yīng)時間對葡萄糖-甘氨酸美拉德反應(yīng)體系中3-DG，GO 和MGO生成的影響Fig.4 The effect of reaction time on the formation of 3-DG，GO and MGO in glucose-glycine maillard reaction system

2.5 反應(yīng)物摩爾比對體系中α-二羰基化合物生成的影響

反應(yīng)物底物濃度比的變化對葡萄糖/甘氨酸模擬美拉德反應(yīng)體系中的三種α-二羰基化合物生成的影響如圖5所示，可以看出3-DG的生成量在葡萄糖/甘氨酸濃度比為3∶1時最高，同時隨著底物濃度比的增加，3-DG的產(chǎn)量也在逐漸增加。而MGO和GO的生成的濃度的變化規(guī)律相似，但是和3-DG的變化趨勢相反，在葡萄糖/甘氨酸濃度比例達(dá)到1∶3時，兩者的濃度在三種底物濃度比中最高。隨著濃度比的增加，這兩種物質(zhì)的濃度開始下降，在底物濃度比為1∶1 和3∶1時，兩種物質(zhì)的濃度基本沒有變化，但是MGO的濃度要比GO的濃度偏高。結(jié)果表明葡萄糖的相對含量升高時有利于3-DG的生成，而當(dāng)甘氨酸的相對含量較高時則會促進(jìn)MGO和GO的生成。Hollnagel等［20］研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)甘氨酸存在時反應(yīng)120 min后，葡萄糖的降解程度比沒有甘氨酸的情況下增加20%。在氨基酸存在的情況下會加速葡萄糖反應(yīng)的活性［21］，或者說氨基酸作為一個基質(zhì)，會催化糖類的羥醛縮合反應(yīng)。對于底物濃度比對美拉德反應(yīng)體系的α-二羰基化合物的研究較少，可從Martins［16］提出的葡萄糖/甘氨酸反應(yīng)機(jī)理中推斷出當(dāng)甘氨酸的含量較高時即糖酸比較低時會抑制產(chǎn)生有機(jī)酸的反應(yīng)路徑，從而促進(jìn)了MGO和GO的生成，而當(dāng)糖酸比較高時，會有利于有機(jī)酸路徑的進(jìn)行，從而促進(jìn)了3-DG的生成。

圖5 反應(yīng)物摩爾比對葡萄糖-甘氨酸美拉德反應(yīng)體系中3-DG，GO和MGO生成的影響Fig.5 The effect of the ratio of reactants on the formation of 3-DG，GO and MGO in the glucose-glycine maillard reaction system

3 結(jié)論

考察了四種反應(yīng)條件（溫度、pH、反應(yīng)時間和底物濃度比）對葡萄糖/甘氨酸模擬美拉德體系中三種α-二羰基化合物3-DG、GO和MGO生成的影響。結(jié)果表明溫度的升高會促進(jìn)葡萄糖/甘氨酸模擬體系產(chǎn)生MGO和GO，而3-DG在溫度達(dá)到110℃時含量開始下降。pH條件變化對三種物質(zhì)的影響和溫度類似，但是pH大于6時，3-DG的含量急劇降低。3-DG和GO兩

種物質(zhì)生成的速率隨著時間的延長逐漸降低，而在2 h 內(nèi)MGO的生成速率趨于恒定。葡萄糖的相對含量升高時有利于3-DG的生成，而當(dāng)甘氨酸的相對含量較高時則會促進(jìn)MGO和GO的生成。本研究能夠?yàn)槊览路磻?yīng)中以α-二羰基化合物為中間產(chǎn)物的風(fēng)味物質(zhì)的生成機(jī)制研究提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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［21］Hollnagel A，Kroh L W.3-Deoxypentosulose：an αdicarbonyl compound predominating in nonenzymatic browning of oligosaccharides in aqueous solution［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50（6）：1659-1664.

Effects of reaction parameters on the formation of α-Dicarbonyl compounds in Glucose-Glycine Maillard chemical model system

HUANG Qi-rui1，ZENG Mao-mao1，*，HE Zhi-yong1，QIN Fang1，CHEN Jie1，2
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Derivatization with o-phenylenediamine（OPD）as well as qualitative and quantitative analysis with HPLC were employed to investigate the effects of reaction conditions（temperature，pH，duration and reactant ratio）on the formation of three α-dicarbonyl compounds including 3-deoxyglucosone（3-DG），glyoxal（GO）and methylglyoxal（MGO）in glucose-glycine maillard chemical model systems.The results showed thatthe increasing of temperature promoted the generation of MGO and GO within 80～140℃，while the level of 3-DG increased to the highest at 110℃，and decreased subsequently.The effects of pH value within 5～9 were similar to that of the temperature：the formation of GO and MGO increased with the increasing of pH values，while the levels of 3-DG increased to the maximum as pH vaue of 6.The rate of 3-DG and GO formation decreased as the extension of duration，but it tended to be constant for MGO within 2 h.In terms of the substrate ratio，the formation of 3-DG could be enhanced by the increasing of relative content of glucose，while increasing of glycine levels could promote GO and MGO formation.The results may provide experimental basis to certain extent for flavor compounds with α-dicarbonyl compounds as intermediate products.

α-dicarbonyl compounds；glucose；glycine；HPLC；reaction condition

TS201.2

A

1002-0306（2016）08-0150-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.022

2015－10－09

黃啟瑞（1991-），男，碩士研究生，研究方向：食品加工與組分變化，E-mail：hqr974706572@163.com。

*通訊作者：曾茂茂（1982-），男，博士，副教授，研究方向：食品加工與組分變化，E-mail：mmzeng@jiangnan.edu.cn。

國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)（2011YQ170067）；國家自然科學(xué)基金（31101287）。