60Co輻照對卵清蛋白結(jié)構(gòu)和抗氧化性的影響

涂宗財，謝 歡，鈕培佩，王 輝，馬 達（.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西南昌330047；2.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌330022）

60Co輻照對卵清蛋白結(jié)構(gòu)和抗氧化性的影響

涂宗財1，2，謝 歡1，鈕培佩1，王 輝1，馬 達1
（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西南昌330047；2.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌330022）

采用6種鈷60輻照劑量（0、2、4、6、8、10 kGy）處理雞蛋卵清蛋白（OVA），并探明輻照技術(shù)對卵清蛋白結(jié)構(gòu)和抗氧化性的影響。以新鮮雞蛋為原料，經(jīng)0、2、4、6、8、10 kGy 6種鈷60輻照劑量處理；硫酸銨沉淀法提取卵清蛋白；并測定不同輻照條件下卵清蛋白溶解度、自由巰基含量、內(nèi)源性熒光、還原力、DPPH自由基清除率的變化。實驗結(jié)果表明：輻照對于卵清蛋白的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)影響較大，隨著輻照劑量的增加，OVA的可溶性蛋白含量、自由巰基含量、DPPH清除能力和還原力，均有不同程度的提高；內(nèi)源熒光呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，當輻照劑量為10 kGy時，內(nèi)源熒光值顯著低于對照組（p＜0.05）。此研究為輻照卵清蛋白產(chǎn)品的工業(yè)應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

卵清蛋白，輻照，結(jié)構(gòu)，抗氧化性

雞蛋卵清蛋白（ovalbumin，OVA）是一種優(yōu)質(zhì)蛋白，占雞蛋中蛋清總蛋白的54%～69%，分子量45000 u，等電點pH4.5，是雞蛋的主要成分［1］。因卵清蛋白具有良好的營養(yǎng)價值和乳化性、起泡性，可以被添加于魚糜、方便面、糕點等多種食品中。隨著人們對于速食食品的方便即食和貨架期長等方面要求的不斷提高，輻照、真空包裝、防腐劑、冷藏等技術(shù)手段被應(yīng)用在食品加工和食品儲藏中，尤其是輻照保藏技術(shù)，因其具備降低食品病原體污染和保留食品完好風(fēng)味的雙重優(yōu)點而廣受青睞，已逐漸成為重要的保藏手段之一［2］。

OVA的熱凝固點低，稍微加熱處理，蛋白便會變性［3］。而輻照是一種有效控制食品中病原微生物，延長食品貨架期的方法［4］。它是一種典型的“冷處理”物理方法，幾乎不會引起食物內(nèi)部溫度改變，從而最大程度還原食物原有風(fēng)味［5］。同時，輻照還具有耗能少，運行成本低等優(yōu)點。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）、世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）和國際原子能機構(gòu)（International Atomic Energy Agency，IAEA）輻照食品聯(lián)合專家委員會早在1980年10月制

定了國際安全線，即任何食品總體平均吸收劑量不超過10 kGy時，不存在毒理學(xué)的危險，也不會產(chǎn)生特別的微生物學(xué)和營養(yǎng)的問題［6］。已有研究表明：花生蛋白經(jīng)1 kGy以上輻照處理后，分子量大于96.9 ku蛋白含量增加［7］；紅豆蛋白通過輻照處理后，溶解性得到了明顯改善，當輻照劑量達到5 kGy時，溶解度達到最高；但隨著輻照劑量的進一步增加，其溶解度有下降趨勢［8］。大豆蛋白經(jīng)低劑量處理后持水性、持油性、分散性和粘度等都沒有明顯變化，仍然保留其原有較好的功能性［9］。目前關(guān)于輻照對卵清蛋白處理結(jié)構(gòu)性質(zhì)影響的研究報道較少。

本實驗主要采用6種鈷60輻照劑量（0、2、4、6、8、10 kGy）處理雞蛋，處理后的蛋清提取OVA，并測定OVA的自由巰基含量、內(nèi)源熒光、溶解性、表面疏水性和抗氧化性等功能性質(zhì)，擬探討輻照技術(shù)對雞蛋主要功能蛋白（卵清蛋白）結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞蛋 購買自江西南昌天虹超市江大店；硫酸銨、乙二胺四乙酸（ethylenediaminete traacetic acid，EDTA） 購買自天津市大茂化學(xué)試劑廠；丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、去離子甲酰胺 購于北京索萊寶科技有限公司；硫酸銨、5，5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）［（5，5’-Dithiobis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB］、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸（glycine）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、K3Fe（CN）6、三氯乙酸（TCA） 購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

F-7000型熒光光度計 日本日立公司；T6型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器責任有限公司；Nicop380 ZLS型激光納米粒度測定儀 美國PSS（Particle Sizing Systems）公司；LGJ-1型冷凍干燥機 北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；TGL-10C高速臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 卵清蛋白的提取 以鮮雞蛋為原料，采用鹽析法分離提純卵清蛋白，冷凍干燥后備用。

卵清蛋白制備工藝：蛋清→過濾→蒸餾水稀釋并調(diào)pH5.5→4000 r/min離心→上清液添加硫酸銨至飽和度50%→4000 r/min離心→上清液調(diào)pH4.5→沉淀用10-4mol/L EDTA溶解→添加硫酸銨至飽和度38%→4000 r/min離心→重復(fù)上述步驟直至6次重結(jié)晶→透析24 h→凍干［10］。

1.2.2 樣品處理 分別將5%卵清蛋白溶液凍干成粉末，送去江西科苑輻照有限公司進行60Coγ輻照處理，劑量為2、4、6、8、10 kGy共5個劑量的輻照處理，未經(jīng)輻照的做為對照組。

1.2.3 可溶性蛋白含量的測定［11］雙縮脲試劑的配制：0.75 g硫酸銅（CuSO4·5H2O）和3g酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4H2O），用250 mL蒸餾水溶解，在攪拌下加入150 mL 10%NaOH，用水稀釋到500 mL。

標準曲線的繪制：于試管中分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL濃度為10 mg/mL的牛血清蛋白（BSA）溶液，用蒸餾水補足到1 mL，然后加入4 mL雙縮脲試劑。用漩渦混合器充分搖勻后，在室溫（20～25℃）下放置30 min，與540 nm處進行比色測定。空白對照以蒸餾水代替BSA溶液。取三組測定的平均值，以蛋白質(zhì)的mg數(shù)為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，y=5.6603x+0.0122（R2=0.9965）。

可溶性蛋白含量的測定：1 mL樣品溶液加入4 mL雙縮脲試劑；1 mL樣品溶液試劑和4 mL雙縮脲試劑做空白調(diào)零，室溫反應(yīng)30 min，540 nm處測其吸光值，根據(jù)標準曲線求出樣品蛋白濃度。將經(jīng)過處理的蛋白溶液于10000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，使不溶物沉淀，取上清液以雙縮脲法測定其可溶性蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 自由巰基的測定 蛋白質(zhì)中自由巰基含量的變化是通過Ellman［12］的方法來測定的。

Ellman試劑配制：4 mg DTNB溶解于l mL Trisglycine緩沖液（0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L Glycine，和0.004 mol/L EDTA，pH8.0）。

樣品測量：4 mL卵清蛋白溶液（1 mg/mL，溶劑為含有8 mol/L尿素的Tris-glycine緩沖液）與200 μL Ellman試劑混合，室溫下放置30 min后經(jīng)8000 r/min離心20 min，用Tris-glycine緩沖液作為空白，在412 nm處測量吸光度值。

自由巰基含量的計算公式如下［13］：

式中：摩爾消光系數(shù)=13600 mol/（L·cm）。

1.2.5 熒光光譜的分析 用F-7000熒光光譜儀測定不同輻照劑量對OVA熒光強度的影響，取OVA配制成0.2 mg/mL的溶液，取2 mL放置于1 cm×1 cm的四面透比色皿中，在激發(fā)波長為280 nm，掃描發(fā)射波長范圍300～500 nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為5 nm［14］。

1.2.6 DPPH自由基清除率的測定 配制一系列濃度的樣品溶液，將3 mL的樣液與1 mL DPPH溶液（0.1 mmol/L，溶于無水乙醇）混勻后，在室溫下避光反應(yīng)30 min，在517 nm下測吸光值A(chǔ)s，對照組為1 mL DPPH溶液加上3 mL去離子水代替樣品在517 nm下測定其吸光值A(chǔ)0，采用VC作對照［15］，計算如下：

式中：A0—對照組吸光值；As—樣品組吸光值。

1.2.7 還原力的測定 取一定濃度的樣品液2 mL加入2 mL磷酸緩沖液（pH6.6，0.2 mol/L）和2 mL 1%的K3Fe（CN）6溶液中，于50℃水浴中反應(yīng)20 min后迅速冷卻，加入2 mL 10%（w/v）的三氯乙酸（TCA）溶液，充分混勻后，以8000 r/min離心5 min，取上清液2 mL，并加入蒸餾水2 mL及400 μL 0.l%（w/v）的FeCl3溶液，混勻后于50℃水浴中反應(yīng)10 min，在波長700 nm處測吸光值，吸光值越大，說明樣品的還原力越強，抗氧化能力越強［16］。

1.2.8 統(tǒng)計分析 本實驗均進行3次平行實驗，2次重復(fù)實驗。采用Origin 8.6軟件作圖，SPSS 19.0軟件統(tǒng)計分析；p＜0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 輻照處理對卵清蛋白可溶性蛋白含量的影響

由圖1可知，經(jīng)輻照處理組OVA的可溶性蛋白含

量相對于未處理組均有增加，隨著輻照劑量的增加，可溶性蛋白含量呈現(xiàn)上升的趨勢，卵清蛋白的可溶性蛋白含量得到明顯改善（p＜0.05）。當輻照劑量達到10 kGy時樣品OVA的可溶性蛋白含量達到最大。輻照處理能夠?qū)е伦杂蓭€基含量顯著上升，蛋白質(zhì)分子發(fā)生去折疊，親水性基團暴露，從而體現(xiàn)在可溶性蛋白含量的提高［17］。石燕等［18］研究隨著輻照劑量從2～10 kGy，可溶性蛋白含量先上升后下降，隨著輻照劑量的上升，肌原纖維蛋白呈現(xiàn)一種先折疊包埋疏水性氨基酸殘基，高輻照劑量時，肌原纖維蛋白的發(fā)生去折疊，從而暴露了疏水性氨基酸殘基。而每種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都有差距，對于輻照的耐受能力也存在著差異。

圖1 輻照對卵清蛋白可溶性蛋白含量的影響Fig.1 Effect of radiation on solubility of OVA

2.2 輻照對卵清蛋白自由巰基的影響

如圖2所示，巰基含量經(jīng)過輻照處理后顯著上升，輻照0～8 kGy隨著輻照劑量的增加，巰基含量顯著上升，8～10 kGy劑量沒有顯著性差異，巰基含量的升高意味著OVA的二級、三級結(jié)構(gòu)受到破壞［19］。其可能的原因是輻照使蛋白分子結(jié)構(gòu)展開，使埋藏分子內(nèi)部的巰基和疏水基團暴露［17］，還有可能與蛋白質(zhì)部分二硫鍵斷裂，生成了游離的巰基，從而使得經(jīng)輻照處理之后的OVA自由巰基的含量升高［20］。

圖2 輻照對卵清蛋白自由巰基的影響Fig.2 Effect of radiation on free sulfhydryl contents of OVA

巰基基團在天然蛋白質(zhì)中難以取代，而且起著很重要的作用。巰基基團與蛋白質(zhì)聚集體的產(chǎn)生和熱處理后凝膠結(jié)構(gòu)有關(guān)。卵清蛋白中的巰基基團藏于天然蛋白分子的疏水核心。研究發(fā)現(xiàn)，巰基-二硫鍵之間的轉(zhuǎn)換是影響蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的重要因素［21］。

2.3 熒光光譜法分析輻照對卵清蛋白影響

圖3是經(jīng)過6種輻照劑量處理OVA內(nèi)源熒光發(fā)射波譜，它的最強吸收峰的發(fā)射波長為345 nm左右，沒有顯著出現(xiàn)明顯紅移或藍移。圖3中的最大熒光強度作為縱坐標，輻照劑量作為橫坐標繪制成圖4，由圖4可知隨著輻照劑量的增加，最大熒光強度0～2 kGy呈現(xiàn)上升，2～6 kGy沒有顯著性差異，6～10 kGy下降，且10 kGy輻照劑量下的內(nèi)源熒光最大值明顯小于（p＜0.05）對照組0 kGy。經(jīng)過輻照處理后，OVA的內(nèi)源熒光呈現(xiàn)先增加后降低趨勢。含有芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）殘基的蛋白質(zhì)在280 nm或295 nm的激發(fā)光的激發(fā)下會產(chǎn)生熒光，這種熒光稱為內(nèi)源性熒光，而蛋白質(zhì)中內(nèi)源熒光主要來源于色氨酸殘基（Trp），它對微環(huán)境的變化很敏感。內(nèi)源熒光的結(jié)果表明OVA的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。芳香族氨基酸周圍的局部微環(huán)境發(fā)生改變是直接導(dǎo)致內(nèi)源熒光變化的原因［22］，結(jié)合圖4可知，0～8 kGy劑量下芳香族氨基酸更多的暴露在極性環(huán)境，使得其內(nèi)源熒光強度上升，OVA呈現(xiàn)一種去折疊結(jié)構(gòu)，而8～10 kGy劑量，暴露于蛋白表面的芳香族氨基酸殘基被掩埋到分子內(nèi)部，蛋白質(zhì)呈現(xiàn)一種折疊結(jié)構(gòu)，使其內(nèi)源熒光強度顯著低于（p＜0.05）對照組。

圖3 輻照對卵清蛋白內(nèi)源熒光的影響Fig.3 Effect of radiation on intrinsic fluorescence of OVA

圖4 輻照對于內(nèi)源熒光最大發(fā)射波長的影響Fig.4 Effect of radiation on max emission wavelength of intrinsic fluorescence

2.4 輻照處理對卵清蛋白DPPH自由基清除率的影響

當遇到自由基清除劑時，自由基的孤對電子被配對，反應(yīng)體系在517 nm處的吸光值降低，通過測定

吸光度的變化來評價對其抗氧化性。由圖5可知，經(jīng)過輻照處理的卵清蛋白，隨著輻照劑量的增加，DPPH自由基清除率總體呈現(xiàn)顯著上升（p＜0.05）趨勢，具體表現(xiàn)為：在0～8 kGy時DPPH自由基清除率，逐漸上升，8～10 kGy沒有顯著性變化，8 kGy時達到最大。這可能是由于通過輻照處理，蛋白質(zhì)展開，自由巰基的含量上升DPPH更易接觸并捕獲自由基，從而清除自由基的能力增強［23］。

圖5 輻照處理對卵清蛋白DPPH清除率的影響Fig.5 Effect of radiation on scavenging effects of DPPH radicals

2.5 輻照處理對卵清蛋白還原力的影響

還原力是表示抗氧化物質(zhì)提供電子能力的重要指標，可以通過提供電子使自由基變?yōu)榉€(wěn)定的物質(zhì)，以中斷自由基的連鎖反應(yīng)［24］。物質(zhì)的吸光值與還原力呈正相關(guān)，可檢驗待測物是否為良好的電子供體。由圖6可知，經(jīng)輻照處理后的卵清蛋白，隨著處理劑量的增加，樣品的還原力逐漸升高，10 kGy還原力達最大。這和DPPH自由基清除能力的結(jié)果是一致的，這可能是由于經(jīng)過輻照處理后，溶液中自由巰基含量上升，再者蛋白質(zhì)的溶解性上升導(dǎo)致溶液中的電子供體增加，使得還原力呈現(xiàn)上升的趨勢。

圖6 輻照處理對卵清蛋白還原力的影響Fig.6 Effect of radiation on reducing power of OVA

3 結(jié)論

本研究表明，輻照對于雞蛋卵清蛋白的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)影響較大，隨著輻照劑量（0、2、4、6、8、10 kGy）的增加，OVA的可溶性蛋白含量、自由巰基含量、DPPH自由基清除能力和還原力，均有不同程度的提高；內(nèi)源熒光呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，當輻照劑量為10 kGy時，內(nèi)源熒光值低于對照組。推測經(jīng)一定輻照處理之后OVA呈現(xiàn)一種去折疊結(jié)構(gòu)，親水性氨基酸殘基和自由巰基暴露，自由巰基含量上升，溶解性增加，內(nèi)源熒光上升，當10 kGy時，蛋白漸漸折疊，內(nèi)源熒光淬滅；在蛋白質(zhì)去折疊和折疊的過程中，還原性自由基暴露，從而使得其DPPH自由基清除能力和還原力上升。

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Effect of60Co radiation on structure and antioxidant activity of ovalbumin

TU Zong-cai1，2，XIE Huan1，NIU Pei-pei1，WANG Hui1，MA Da1
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China；2.College of Life Science，Jiangxi Normal University，Nanchang 330022，China）

By studying changes on ovalbumin（OVA）from eggs treated by radiation，the effect of radiation on structure and antioxidant activity of OVA were measured.The OVA were treated by 6 radiation doses 0，2，4，6，8，and 10 kGy，respectively.Ovalbumin extracted from fresh eggs with the method of ammonium sulfate precipitation.Solubility，free sulfhydryl conten，fluorescence spectroscopy，reducing power and DPPH radical scavenging of the OVA were determined.The results showed that with the increase of radiation intensity，free sulfhydryl contents，protein solubility，reducing power and DPPH increased.However，intrinsic fluorescence firstly increased and then decreased.When the irradiation does increased to 10 kGy，intrinsic fluorescence was significantly lower than the control group.This study could provide the theoretical basis for radiated ovalbumin industrial applications.

ovalbumin；radiation；structure；antixoidant activity

TS253.1

A

1002-0306（2016）08-0135-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.019

2015-10-08

涂宗財（1965-），男，博士，教授，研究方向：食物資源開發(fā)與高效利用，E-mail：tuzc_mail@aliyun.com。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）（2011AA100803）；江西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金資助（JXARS-04）；江西省重大生態(tài)安全問題監(jiān)控協(xié)同創(chuàng)新中心資助項目（JSX-EW-00）。