扁蓿豆SK2型脫水素基因MrDHN3的異源表達(dá)提高大腸桿菌對鹽和高溫脅迫的抗性

沈迎芳，馬超，吳小培，張業(yè)猛，王海慶*

(1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，高原適應(yīng)與進(jìn)化重點實驗室，青海 西寧 810008；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

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扁蓿豆SK2型脫水素基因MrDHN3的異源表達(dá)提高大腸桿菌對鹽和高溫脅迫的抗性

沈迎芳1,2，馬超1，吳小培1,2，張業(yè)猛1,2，王海慶1*

(1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，高原適應(yīng)與進(jìn)化重點實驗室，青海 西寧 810008；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

扁蓿豆為高原高寒地區(qū)優(yōu)質(zhì)豆科牧草，具有極強的抗旱、耐寒、抗鹽堿的能力。脫水素(DHNs)是參與植物逆境應(yīng)答的一類蛋白。根據(jù)前期RNA-seq的結(jié)果，從扁蓿豆幼苗中克隆到一個編碼脫水素的基因MrDHN3。序列分析顯示該基因含666 bp的開放閱讀框，編碼221個氨基酸，為一個SK2型酸性脫水蛋白。氨基酸序列比對結(jié)果表明，MrDHN3與豆科植物白三葉和蒺藜苜蓿相似性最高，達(dá)83%。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，MrDHN3基因受脫水、低溫、高鹽和脫落酸處理誘導(dǎo)表達(dá)，表明MrDHN3參與了扁蓿豆的非生物脅迫響應(yīng)。通過構(gòu)建原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中過表達(dá)MrDHN3蛋白，檢測重組菌在鹽和高溫脅迫處理下的生長存活情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在0.5 mol/L NaCl和0.5 mol/L KCl高鹽脅迫條件下，重組大腸桿菌的存活率明顯高于對照菌株；在55 ℃高溫脅迫條件下, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌的生長狀態(tài)明顯優(yōu)于對照。表明MrDHN3對鹽和高溫引起的細(xì)胞損傷具有保護作用。為今后作物抗逆性遺傳改良的研究提供了有用信息。

脫水素基因；非生物脅迫；異源表達(dá)；扁蓿豆

高鹽、低溫和干旱等環(huán)境脅迫是影響植物生長發(fā)育和產(chǎn)量的主要因素，植物作為固著的生物，在長期的進(jìn)化過程中逐漸演化出了一系列應(yīng)答機制[1]。其中，脫水蛋白作為一類重要的響應(yīng)蛋白，在高鹽、低溫、干旱等脫水的環(huán)境脅迫信號刺激及外源ABA處理下積累表達(dá)[2]。脫水蛋白屬于晚期胚胎發(fā)育豐富蛋白(late embryogenesis abundant protein)LEAII家族，為天然無序蛋白，富含甘氨酸，呈高度的親水性和熱穩(wěn)定性[3]，廣泛分布于高等植物、藻類、酵母、線蟲以及藍(lán)細(xì)菌中[4]。脫水蛋白含有至少一個保守的富含賴氨酸的基序K片段(EKKGIMDKIKEKLPG 或其衍生物)，它們常形成雙親性螺旋結(jié)構(gòu)。部分脫水蛋白還包含Y片段和S片段，Y片段通常以1～3個重復(fù)形式(T/VDEYGNP)出現(xiàn)在脫水蛋白的N-端，S片段由一系列絲氨酸(Ser)殘基組成?；赮，S，K片段出現(xiàn)的類型和數(shù)量可將脫水蛋白分為5個亞家族：YnSKn， SKn， Kn，YnKn和KnS型[5-6]。體內(nèi)和體外實驗證明，脫水蛋白對植物抵御環(huán)境脅迫發(fā)揮重要作用[7]。

扁蓿豆(Medicagoruthenica)為多年生豆科植物，廣泛分布于西伯利亞、蒙古利亞和我國北方地區(qū)，多生長于山坡草地處[8-9]。Campbell 等[10]指出，扁蓿豆是唯一可適應(yīng)干旱、高原嚴(yán)寒及貧瘠土壤的豆科苜蓿屬植物。鑒于其具有優(yōu)于苜蓿的抗低溫性，扁蓿豆被認(rèn)為是高原高寒地區(qū)優(yōu)質(zhì)的豆科牧草[11]，也被認(rèn)為是提高苜蓿作物脅迫耐受性的優(yōu)異種質(zhì)資源。近年來國內(nèi)學(xué)者聚焦于牧草高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆育種的研究，注重與苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展相結(jié)合，而對分子遺傳基礎(chǔ)等機理性研究尚顯不足[12]。盡管脫水蛋白基因已從很多物種中克隆出[13]，包括豆科植物苜蓿(Medicagotruncatula)、豌豆(Pisumsativum)、大豆(Glycinemax)等[14]，但其在扁蓿豆內(nèi)的分子特性鮮有報道。本研究以扁蓿豆為材料，從中克隆脫水素基因(dehydrin)，異源表達(dá)到大腸桿菌中，來探討其在逆境脅迫下可能發(fā)揮的作用，以期為牧草抗逆育種提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1植物材料與處理

扁蓿豆種子承蒙中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所孫啟忠研究員惠贈。2013年6月將種子用濃硫酸處理10 min，用無菌水沖洗數(shù)次去除殘余硫酸。上述經(jīng)過處理的種子置于鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，在21 ℃、16 h/8 h光照條件下萌發(fā)。3 d后將發(fā)芽的幼苗移栽于蛭石∶營養(yǎng)土(3∶1)的混合基質(zhì)中培養(yǎng)，每周用含1/2 MS營養(yǎng)液澆灌1次。生長3周后對幼苗進(jìn)行非生物脅迫和脫落酸處理。NaCl脅迫處理：用150 mmol/L NaCl水溶液從花盆底部澆灌至培養(yǎng)基質(zhì)飽和，處理0，0.5，1，3，6，24 h；脫水脅迫處理：將幼苗洗去砂石后，室溫自然脫水0，0.5，1，3，6，12 h；ABA脫落酸處理：將整株幼苗洗凈砂石后，轉(zhuǎn)移至鋪有多層吸水紙的培養(yǎng)皿中，用含0.05% Tween 20(V/V)的100 μmol/L脫落酸溶液(ABA)噴霧，封蓋以防植株脫水，處理0，0.5，1，3，6，12 h；低溫脅迫處理：將培養(yǎng)的幼苗轉(zhuǎn)移到4 ℃光照培養(yǎng)箱進(jìn)行低溫處理0，1，4，8，12，24 h。每組處理設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，取樣后液氮速凍，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2MrDHN3基因的cDNA克隆及序列分析

總RNA的提取采用TRIZOL?試劑(Invitrogen，USA)，參照說明書用Recombinant DNase I(RNase-free)(TaKaRa，大連)去除基因組DNA。cDNA 第一鏈按PrimeScript?RT reagent Kit(Perfect Real Time)(TaKaRa，大連)的操作說明合成。

根據(jù)本實驗室已有的扁蓿豆轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果(未發(fā)表)設(shè)計正向引物MrDHN3F(5′-CGTGTCATTATGTGTAGTAGTGAAG-3′)和反向引物MrDHN3R(5′-TAAACAAAGCACCCTCCA-3′)，以低溫4 ℃處理24 h的cDNA樣為模板，用PyrobestTMDNA聚合酶(TaKaRa，大連)進(jìn)行PCR擴增。擴增產(chǎn)物膠回收后，用Ex Taq?DNA聚合酶(TaKaRa，大連)進(jìn)行加尾，然后克隆到pGEM?-T Easy載體(Promega, USA)進(jìn)行測序。

用DNAMAN軟件(Lynnon Biosoft, Vaudreuil-Dorion, Quebec, Canada)分析核酸序列、編碼的氨基酸序列以及開放閱讀框ORF；用ExPASy 網(wǎng)站上的Protparam(http://au.expasy.org/tools/protparam.htm)軟件預(yù)測理論等電點(pI)和相對分子量(Mw)；用NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BlastN、BlastP軟件進(jìn)行核苷酸及蛋白序列相似性檢索；用MEGA 6軟件[15]構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3MrDHN3基因表達(dá)的實時熒光定量PCR分析

將上述不同脅迫處理樣品合成的cDNA稀釋至50～150 ng/μL為模板，用SYBR?Premix Ex TaqTMII (Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa，大連)進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系20 μL，用ViiATM7實時熒光定量PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems, Foster City, CA)擴增。反應(yīng)按兩步法PCR標(biāo)準(zhǔn)程序95 ℃ 30 s預(yù)變性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)進(jìn)行，熒光信號采集在每一循環(huán)的第2步：60 ℃ 30 s。目的基因MrDHN3和內(nèi)參基因Mr18S的qRT-PCR引物用PrimerPrimer 5.0(PREMIER Biosoft International, Silicon Valley, USA)設(shè)計?；虻纳嫌魏拖掠我锓謩e為MrDHN3-qF(5′-GGATGTAACAACTCAACCGCCTG-3′)和MrDHN3-qR(5′-GCAGTCT-TAGGGTGATAACCAGGAA-3′)，Mrt18SF(5′-CGCTCCTACCGATTGAAT-3′)和Mrt18SR(5′-GTTACGACT-TCTCCTTCCT-3′)。

用2-ΔΔCt法[16]計算MrDHN3在各非生物脅迫及ABA處理下的相對表達(dá)量。每個處理設(shè)3次重復(fù)，相對定量結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

1.4MrDHN3原核表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)已測序的MrDHN3 cDNA序列設(shè)計含BamHΙ位點的正向引物MrDHN3-F1(5′-GCGGATCCATGGCTGATCAGGAGAATCAGAAC-3′)和含SacI位點的反向引物MrDHN3-R1(5′-CGCGAGCTCTCAATGAGTAGTAGTCTCATCCTT-3′)，擴增MrDHN3基因編碼區(qū)。擴增的片段測序確認(rèn)后，用BamHI和SacI雙酶切，將酶切后的片段插入到經(jīng)BamHI/SacI雙酶切的pET-30a(Novagen, Madison, WI, USA)原核表達(dá)載體內(nèi)，轉(zhuǎn)化DH5ɑ大腸桿菌菌株，挑選陽性克隆提取質(zhì)粒，酶切鑒定后，獲得重組的原核表達(dá)載體pET30a-MrDHN3。

1.5MrDHN3融合蛋白的表達(dá)及熱穩(wěn)定性和溶解性分析

按照說明書將重組質(zhì)粒pET30a-MrDHN3轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)菌株內(nèi)，含pET30a-MrDHN3質(zhì)粒的BL21(DE3)命名為BL/MrDHN3，只含pET30a的BL21(DE3)為對照，命名為BL/pET30a。在含有50 mg/L卡那霉素(kanamycin, Kan)的LB平板上挑取陽性克隆接種于含50 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃振蕩培養(yǎng)。約12 h后，按1∶100(V/V)轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)2～3 h至OD600達(dá)到0.6～0.8后，取1 mL菌液為誘導(dǎo)前樣。其余菌液中加入異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG)至終濃度為0.5 mmol/L。誘導(dǎo)3 h后，取1 mL菌液為誘導(dǎo)后樣。

離心收集菌體，PB緩沖液重懸，超聲5 min完全破碎誘導(dǎo)后菌體細(xì)胞，12000 r/min離心15 min。收集上清，將其分成2份，1份于100 ℃ 沸水浴中處理10 min；另1份直接用于電泳分析。收集的4份樣品中加入等體積樣品緩沖液，100 ℃煮沸10 min，冷卻至室溫，12000 r/min離心10 min，取10 μL上清液，12% SDS-PAGE進(jìn)行電泳分析。

1.6異源表達(dá)轉(zhuǎn)化子抗逆性實驗

1.6.1定性分析大腸桿菌轉(zhuǎn)化和IPTG誘導(dǎo)條件如1.5所述。分別將BL/MrDHN3和對照BL/pET30a進(jìn)行液體培養(yǎng)，誘導(dǎo)后的菌液OD600至0.9時，用含50 mg/L卡那霉素和0.5 mmol/L IPTG的新鮮液體LB培養(yǎng)基將培養(yǎng)菌液稀釋10倍。取原液和稀釋菌液進(jìn)行脅迫處理，用含終濃度為50 mg/L卡那霉素和0.5 mmol/L IPTG的LB固體培養(yǎng)基為非脅迫對照。鹽脅迫實驗中，以分別添加有0.5 mol/L NaCl和0.5 mol/L KCl的LB固體培養(yǎng)基為鹽脅迫處理；熱脅迫實驗中，將原菌液和稀釋菌液在55 ℃水浴中溫育30 min為熱脅迫處理。取10 μL菌液滴加到上述平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)16 h(熱脅迫處理)、3 d(鹽脅迫處理)后觀察菌體生長情況。

1.6.2定量分析大腸桿菌培養(yǎng)、IPTG誘導(dǎo)及脅迫處理條件同1.6.1定性分析。稀釋10倍的菌液，取100 μL均勻涂布于上述非脅迫和脅迫處理的平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)16 h(熱脅迫處理)、3 d(鹽脅迫處理)后菌落計數(shù)，按如下公式分析菌落形成率。

2　結(jié)果與分析

2.1MrDHN3基因克隆與序列分析

根據(jù)已有的扁蓿豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計引物，采用RT-PCR方法從低溫處理24 h的扁蓿豆幼苗中擴增得到約900 bp的特異片段(圖1A)，將其命名為MrDHN3。該片段經(jīng)膠回收，進(jìn)行載體連接，并測序。測序結(jié)果顯示該cDNA長890 bp，含有666 bp的開放閱讀框，編碼221個氨基酸。ProtParam預(yù)測該基因編碼蛋白的分子量(Mw)為24.84 kD，理論等電點(pI)為5.56，為酸性蛋白。總平均疏水性指數(shù)(grand average of hydropathicity,GRAVY)為-1.444，表明具有較高的親水性。MrDHN3蛋白含有1個S片段和2個富含賴氨酸的K片段，為典型的SK2型脫水蛋白(圖1B)。

圖1　扁蓿豆MrDHN3基因的cDNA克隆(A)及序列分析(B)Fig.1　Cloning and sequence analysis of cDNA for MrDHN3 gene from M. ruthenica　A：扁蓿豆MrDHN3基因RT-PCR產(chǎn)物擴增；M：1 kb DNA Ladder；B：扁蓿豆MrDHN3的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列，脫水蛋白預(yù)測的S片段用下劃線標(biāo)出，3個保守的K片段用陰影標(biāo)出。A: RT-PCR products of MrDHN3 from M. ruthenica; M: 1 kb DNA Ladder; B: Nucleotide sequence of the MrDHN3 cDNA and its deduced amino acids, the DHN deduced S-segment is underlined and the conserved three K-segments are marked as shadow edge.

編碼MrDHN3的氨基酸序列經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫中的BlastP分析，發(fā)現(xiàn)其與白三葉(Trifoliumrepens)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、豌豆(Pisumsativum)、鷹嘴豆(Cicerarietinum)等豆科植物DHN蛋白家族成員具有高度一致性，相似性達(dá)77%，其中與白三葉和蒺藜苜蓿中DHN蛋白的一致性最高，達(dá)83%。在GenBank中選取部分DHN蛋白，進(jìn)一步用 DNAMAN 軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(圖2)，結(jié)果顯示比對的DHN蛋白均含有保守結(jié)構(gòu)域S片段和2個K片段，為SK2型脫水蛋白。

用MEGA6對NCBI下載的6個物種SKn型脫水蛋白氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)，分析結(jié)果顯示，MrDHN3與豆科植物豌豆SK2蛋白的親緣關(guān)系最近。而與禾本科的小麥(Triticumaestivum)、粳稻(OryzasativaJaponica Group)，芭蕉科大蕉(MusaABB Group)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。豆科不同物種聚為一組，禾本科不同物種聚為一組，其他科植物為另一組，說明DHN蛋白具有種屬特性。

圖2　MrDHN3脫水蛋白與其他物種SKn類DHN脫水蛋白的氨基酸序列比對Fig.2　Alignment of amino acid sequences of MrDHN3 and other SKn-type dehydrin proteins　實線方框示DHN脫水蛋白的保守結(jié)構(gòu)區(qū)段S片段；虛線方框示DHN脫水蛋白的保守結(jié)構(gòu)區(qū)段K片段；The conserved S-segment and K-segment of MrDHN3 and other SKn-type dehydrin proteins are boxed;TrDHN3:白三葉T. repens (ADD09573.1);MtDHN3:蒺藜苜蓿M. truncatula (XP_003603987.1); PsDHN3:豌豆P. sativum (CAA78515.1); CaDHN3:鷹嘴豆C. arietinum (XP_004500781.1).

圖3　MrDHN3脫水蛋白與其他物種SKn類脫水蛋白構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3　Phylogenetic tree between MrDHN3 and other SKn-type dehydrin proteins　OsDHN3:粳稻O. sativa Japonica Group (ABS44866.1);TaDHN3:小麥T. aestivum (AAB18202.1);MaDHN3:大蕉Musa ABB Group (AEI54683.1);CsDHN3:茶Camellia sinensis (ACT10283.1);PpDHN3:桃Amygdalus persica (AAZ83586.1); PsDHN3:豌豆P. sativum (AAL50315.1).

2.2MrDHN3基因在非生物脅迫下表達(dá)特性

為分析MrDHN3是否受非生物脅迫和ABA處理誘導(dǎo)表達(dá)，以組成型表達(dá)的基因Mr18S為內(nèi)參，利用實時熒光定量PCR定量檢測MrDHN3基因在各非生物脅迫，低溫、高鹽、室溫脫水以及外源ABA處理下的相對表達(dá)量(圖4)。結(jié)果顯示，MrDHN3基因在不同處理條件下的表達(dá)特性是有差異的。在低溫(圖4A)和脫水脅迫(圖4C)處理下，MrDHN3的表達(dá)量呈逐步上升的趨勢，在脅迫處理24和12 h時相對表達(dá)量達(dá)到最高，分別約為對照的2.7和6.9倍；不同于低溫和脫水脅迫，MrDHN3的相對表達(dá)量在NaCl脅迫(圖4B)1 h時快速積累達(dá)到對照的4.8倍，在ABA處理(圖4D)3 h時達(dá)到對照的6倍，之后逐漸降低到與對照相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)水平。由此可見，MrDHN3基因的表達(dá)受各種非生物脅迫和ABA的誘導(dǎo)。表明MrDHN3基因參與了ABA及干旱、低溫、鹽等非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)。

圖4　扁蓿豆MrDHN3基因在不同非生物脅迫及ABA處理下的實時熒光定量PCR分析Fig.4　Relative expression patterns of MrDHN3 gene in M. ruthenica under various abiotic stresses and ABA treatment

2.3MrDHN3原核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白的表達(dá)特性分析

為了解MrDHN3在體外非生物脅迫下可能的功能，將MrDHN3基因的編碼區(qū)經(jīng)BamHI和SacI雙酶切后，重組到pET30a表達(dá)載體內(nèi)，得到重組質(zhì)粒pET30a-MrDHN3。構(gòu)建的表達(dá)載體pET30a-MrDHN3經(jīng)酶切鑒定(圖5A)后，以pET30a為對照，轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)。

含重組質(zhì)粒的菌體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)2 h，用SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)(圖5B)。與誘導(dǎo)前的樣相比(圖5B-1)，圖5B-2顯示1條約28 kD蛋白出現(xiàn)在誘導(dǎo)表達(dá)的BL/MrDHN3中，表明重組蛋白成功表達(dá)。但表達(dá)的蛋白比融合蛋白的理論分子量略大，推測可能是MrDHN3含有大量親水結(jié)構(gòu)域并且重組蛋白N-端含有堿性殘基的His-標(biāo)簽序列，阻滯了重組蛋白在SDS-PAGE中的泳動，導(dǎo)致表觀分子量變大。

誘導(dǎo)表達(dá)的菌體破碎后離心，表達(dá)的大部分蛋白出現(xiàn)在上清液中(圖5B-3)。另外，經(jīng)沸水浴處理后，上清液中仍有目標(biāo)蛋白存在(圖5B-4)，這些結(jié)果表明目標(biāo)蛋白MrDHN3在大腸桿菌中具有一定的親水性和熱穩(wěn)定性。

2.4過表達(dá)MrDHN3對大腸桿菌的逆境脅迫保護

為檢測不同逆境脅迫條件下過表達(dá)MrDHN3對重組大腸桿菌的作用，將BL/pET30a和BL/MrDHN3菌體滴加到含不同脅迫因子的LB培養(yǎng)基上，觀察菌落形成情況(圖6A)。結(jié)果顯示，BL/MrDHN3和對照BL/pET30a之間在克隆形成數(shù)和生長速率方面沒有明顯的差別；當(dāng)LB培養(yǎng)基上添加了0.5 mol/L NaCl后，重組菌的數(shù)量明顯高于對照BL/pET30a，添加0.5 mol/L KCl的結(jié)果與之相同。以上結(jié)果表明過表達(dá)MrDHN3能顯著增強大腸桿菌對鹽的耐受性。在熱脅迫下，經(jīng)55 ℃脅迫處理30 min后大部分BL/pET30a菌死亡。而同樣條件下，BL/MrDHN3的菌體存活率高于對照。該結(jié)果表明，過表達(dá)MrDHN3能顯著增強大腸桿菌對高溫脅迫的抗性。

菌落計數(shù)結(jié)果(圖6B)顯示，在0.5 mol/L NaCl和KCl高鹽脅迫下，BL/MrDHN3的菌落形成率分別為16.71%和20.80%，對照BL/pET30a的菌落形成率僅為3.55%和4.29%；55 ℃高溫處理后，BL/MrDHN3的菌落形成率為11.22%，對照BL/pET30a的菌落形成率為2.40%。脅迫條件下，BL/MrDHN3的菌落形成率是BL/pET30a的4～5倍，表明MrDHN3能顯著增強宿主菌對鹽和熱的抗性，與菌落定性分析結(jié)果一致。

圖5　MrDHN3原核表達(dá)載體的鑒定(A)及原核表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析(B)Fig.5　Identification of pET30a-MrDHN3 by enzymatic digestion (A) and analysis of prokaryotic expression products by SDS-PAGE (B)　M：1 kb DNA Ladder(A)，低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白(B)；1：IPTG誘導(dǎo)前的BL/MrDHN3表達(dá)產(chǎn)物；2：IPTG誘導(dǎo)后的BL/MrDHN3表達(dá)產(chǎn)物；3：上清液中誘導(dǎo)表達(dá)的BL/MrDHN3；4：上清液100 ℃處理10 min后的表達(dá)產(chǎn)物。M: 1 kb DNA Ladder (A), LMW Markers Proteins (B); Lane 1: Total protein fraction from non-induced BL/MrDHN3 cells; Lane 2: Total protein fraction from IPTG-induced BL/MrDHN3 cells; Lane 3: Soluble supernatant protein fraction from IPTG-induced BL/MrDHN3 cells; Lane 4: Protein fraction from soluble supernatant, which boiled at 100 ℃ for 10 min.

圖6　MrDHN3蛋白過表達(dá)對大腸桿菌在逆境脅迫下的保護效果Fig.6　Effects of MrDHN3 over-expression on protection of E. coli against injury under abiotic stresses　A：菌液滴板試驗；B：菌落形成率測定；BL/pET30a：含有pET30a(+)質(zhì)粒的BL21(DE3)大腸桿菌；BL/MrDHN3：含有pET30a-MrDHN3質(zhì)粒的BL21(DE3)大腸桿菌；LB：Luria-Bertani (LB)固體培養(yǎng)基添加有0.5 mmol/L IPTG；LB+0.5 mol/L NaCl：LB固體培養(yǎng)基添加0.5 mmol/L IPTG和0.5 mol/L NaCl；LB+0.5 mol/L KCl：LB固體培養(yǎng)基添加0.5 mmol/L IPTG和0.5 mol/L KCl； LB(55 ℃,30 min)：55 ℃熱處理30 min。A: Spotting assays; B: Colony forming efficiency assays; BL/pET30a: pET-30a(+) plasmid harboring BL21(DE3) strain; BL/MrDHN3: pET30a-MrDHN3 plasmid harboring BL21(DE3) strain; LB: Luria-Bertani (LB) solid medium with 0.5 mmol/L IPTG; LB+0.5 mol/L NaCl: LB solid medium with 0.5 mmol/L IPTG and 0.5 mol/L NaCl; LB+0.5 mol/L KCl: LB solid medium with 0.5 mmol/L IPTG and 0.5 mol/L KCl; LB (55 ℃,30 min): Incubation at 55 ℃ for 30 min.

3　討論

脫水素(dehydrin)為LEA 蛋白DII家族成員。本研究所克隆的MrDHN3基因含1個S片段和2個K片段，為SK2 類脫水蛋白。SKn類脫水蛋白是一類酸性蛋白，受低溫、高鹽、干旱、機械損傷及脫落酸信號的調(diào)節(jié)[17]。小麥wzy1-2基因編碼一個SK3類脫水蛋白，其mRNA的表達(dá)量在低溫、滲透脅迫及ABA誘導(dǎo)下上調(diào)[18]。紫花針茅(Stipapurpurea)SK3型脫水蛋白基因SpDHN1在干旱脅迫時表達(dá)[19]。本研究中扁蓿豆SK2型脫水蛋白基因MrDHN3在低溫、干旱、鹽及ABA處理下表達(dá)都有上調(diào)，由此推測MrDHN3的表達(dá)與積累和扁蓿豆抗逆性之間存在正相關(guān)關(guān)系。

眾多研究為異源表達(dá)dehydrins(DHNs)基因能增強植物和細(xì)菌的非生物脅迫抗性提供了直接的證據(jù)。Ochoa-Alfaro等[20]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)扭刺仙人掌(Opuntiastreptacantha)SK3型脫水蛋白基因OpsDHN1的擬南芥(Arabidopsisthaliana)抗凍能力提高。Lakshmi等[21]研究發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)高粱(Sorghumbicolor)SK2型脫水蛋白基因SbDHN1到煙草(Nicotianatabacum)中可以增強其對干旱和鹽脅迫的抗性。目前，關(guān)于原核表達(dá)植物脫水蛋白基因提高大腸桿菌抗性的研究也有很多。原核表達(dá)大豆(Glycinemax)KS型脫水基因SLT1629可提高大腸桿菌抗鹽能力[22]。過表達(dá)沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)KS類脫水蛋白AmCIP到大腸桿菌可增強宿主菌對低溫脅迫的耐受性[23]。本研究將MrDHN3編碼區(qū)連接到pET30a表達(dá)載體上，異源表達(dá)MrDHN3到大腸桿菌中，發(fā)現(xiàn)MrDHN3與維持大腸桿菌在鹽和高溫脅迫條件下的存活有密切聯(lián)系，說明植物基因可以提高宿主菌的抗脅迫能力?；谝陨涎芯?，可以推測原核和真核生物在脅迫條件下可能具有相似的保護機制。

高鹽和極端溫度脅迫會引起胞內(nèi)脫水，也可導(dǎo)致蛋白及細(xì)胞膜的損傷[24]。本研究顯示，重組的大腸桿菌細(xì)胞對鹽和高溫脅迫的抗性增強，表明過表達(dá)扁蓿豆MrDHN3基因可以使宿主菌的蛋白、細(xì)胞膜、細(xì)胞免受損傷。本研究預(yù)測扁蓿豆MrDHN3基因編碼一個酸性蛋白，總平均疏水性指數(shù)為-1.444，具有較高的親水性。在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)的MrDHN3呈水溶性和熱穩(wěn)定性。有報道指出，脫水蛋白含有高比例的親水性氨基酸殘基，在水溶液中呈高度無序的柔性狀態(tài)[25]。當(dāng)處于脫水環(huán)境下，其構(gòu)象會發(fā)生改變，K片段可形成雙親性a-螺旋結(jié)構(gòu)[26]，可與其他蛋白部分脫水的表面及生物膜表面相互作用，進(jìn)而保護該蛋白免受更進(jìn)一步脫水導(dǎo)致的不可逆的蛋白變性[27]。S片段可以被酪蛋白激酶磷酸化[28]，從而具有Ca2+結(jié)合活性[29]。此外DHNs中的組氨酸也可與Cu2+、Zn2+、Mn2+和Fe2+等金屬離子結(jié)合[30]。因此可以推測，在逆境脅迫條件下，MrDHN3中的K片段可維持膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，防止其在高溫下的聚集；酸性的SKn蛋白可作為離子緩沖液或伴侶分子穩(wěn)定受脅迫細(xì)胞的蛋白、核酸和膜結(jié)構(gòu)，減少細(xì)胞脫水過程中鹽分沉淀和結(jié)晶，從而減輕高鹽脅迫對重組菌的毒害，提高轉(zhuǎn)化子的存活率。

本研究中，雖然MrDHN3蛋白可明顯提高大腸桿菌的耐鹽和耐高溫能力，但對低溫脅迫及山梨醇和甘露醇模擬的滲透脅迫未表現(xiàn)出明顯的抗性，其可能的原因是MrDHN3對不同脅迫保護存在機制上的差異性。這與Zhang等[31]和Lan 等[32]的研究結(jié)果類似，他們發(fā)現(xiàn)不同組的LEA基因在滲透脅迫中的保護機制不同。

總之本研究克隆并分析了扁蓿豆MrDHN3基因，結(jié)果表明，MrDHN3為SK2類LEAII蛋白，MrDHN3基因受脫水等非生物脅迫及外源激素ABA誘導(dǎo)表達(dá)，異源表達(dá)MrDHN3蛋白到大腸桿菌中能顯著增強宿主菌對鹽和高溫的脅迫耐受性。推測超表達(dá)MrDHN3在提高植物的逆境脅迫耐受性方面有一定的作用，以后可用于作物抗逆基因工程改良研究中。未來，對于過表達(dá)MrDHN3到植物體中是否能提高作物的抗脅迫能力還有待進(jìn)一步研究。

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Heterologous expression of an SK2-type dehydrin gene (MrDHN3) fromMedicagoruthenicaenhancesEscherichiacolitolerance under salt and high temperature stress

SHEN Ying-Fang1,2, MA Chao1, WU Xiao-Pei1,2, ZHANG Ye-Meng1,2, WANG Hai-Qing1*

1.KeyLaboratoryofAdaptationandEvolutionofPlateauBiota,NorthwestInstituteofPlateauBiology,ChineseAcademyofSciences,Xining810008,China; 2.UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China

Medicagoruthenica, is an excellent legume in highland and cold regions, and is highly resistant to drought, cold and high salinity. Dehydrins (DHNs) are stress proteins involved in plant protective reactions against environmental stress. According to our previous RNA-sequence data, a DHN gene,MrDHN3, was cloned from young seedlings ofM.ruthenica. Sequence analyses showed that theMrDHN3 gene contained a 666 bp open reading frame, putatively translated to 221 amino acids, and was an SK2-type acidic DHN. Amino acid sequence alignment showed that MrDHN3 shared the highest similarity (83%) with TrDHN3 and MtDHN3. Quantitative RT-PCR analysis showed that the expression ofMrDHN3 was induced by dehydration, cold, high salinity stress and abscisic acid (ABA), which suggests thatMrDHN3 is involved in abiotic stress responses. A prokaryotic expression vector was constructed and transferred toEscherichiacoliso as to induce MrDHN3 over expression inE.coli. The survival and growth of the recombinantE.coliunder salinity and high temperature stress conditions were determined. It was found that survival rates of recombinantE.coliafter exposure to high salinity (0.5 mol/L NaCl, 0.5 mol/L KCl) and high temperature (55 ℃) stress were obviously higher than those of the control group. This suggests that MrDHN3 plays an important role in cell response to damage caused by salinity and high temperature stress. This research indicates a potential methodology for the genetic improvement of crops to improve stress tolerance.

dehydrins; abiotic stress; heterologous expression;Medicagoruthenica

10.11686/cyxb2015510http://cyxb.lzu.edu.cn

沈迎芳, 馬超, 吳小培, 張業(yè)猛, 王海慶. 扁蓿豆SK2型脫水素基因MrDHN3的異源表達(dá)提高大腸桿菌對鹽和高溫脅迫的抗性. 草業(yè)學(xué)報, 2016, 25(8): 118-127.

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2015-11-10；改回日期：2016-02-17

青海省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃(2014-ZJ-764)，中科院“西部之光”聯(lián)合學(xué)者項目和中科院科技服務(wù)網(wǎng)絡(luò)計劃(KFJ-SW-STS-177)資助。

沈迎芳(1987-)，女，青海西寧人，在讀博士。E-mail：syfnc@126.com

Corresponding author. E-mail: wanghq@nwipb.cas.cn