直接免疫熒光法快速檢測(cè)甲型流感病毒抗原的臨床意義*

劉玉蘭，何鳳屏△，肖　蕓，馬占忠，管振祺，郭艷樂，肖　捷，候紅梅，楊玉婷

(1.廣東省韶關(guān)市粵北人民醫(yī)院　512026；2.上海星耀醫(yī)藥有限公司　200444)

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直接免疫熒光法快速檢測(cè)甲型流感病毒抗原的臨床意義*

劉玉蘭1，何鳳屏1△，肖蕓1，馬占忠1，管振祺1，郭艷樂1，肖捷1，候紅梅1，楊玉婷2

(1.廣東省韶關(guān)市粵北人民醫(yī)院512026；2.上海星耀醫(yī)藥有限公司200444)

目的探討直接免疫熒光法快速檢測(cè)早期甲型流感病毒抗原及其臨床應(yīng)用。方法選擇臨床上診斷為急性呼吸道感染入院的患者，采集標(biāo)本200例，將其分為兩組：冬春兩季流行季節(jié)兒童組(100例)和夏秋兩季非流感流行期間兒童組(100例)，使用美國(guó)D3 Ultra甲型流感病毒抗原檢測(cè)試劑，采用熒光標(biāo)記的單克隆抗體對(duì)感冒患者進(jìn)行甲型流感病毒抗原檢測(cè)。結(jié)果在冬春兩季流感流行期間，100例兒童檢測(cè)有8例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為8%；在夏秋兩季非流感流行期間100例兒童檢測(cè)有2例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為2%；兩組陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論運(yùn)用直接免疫熒光法快速檢測(cè)甲型流感毒感抗原是一種經(jīng)濟(jì)、高效、快速、特異的檢測(cè)方法，能指導(dǎo)臨床快速診斷，合理用藥。

甲型流感病毒;直接免疫熒光;抗原;兒童

呼吸道病毒是指一大類能侵犯呼吸道引起呼吸道局部病變或僅以呼吸道為侵入門戶，主要引起呼吸道外組織器官病變的病毒。目前已證明兒童95%的急性上呼吸道感染和大部分下呼吸道感染是由細(xì)菌以外的病原體引起的，其中病毒感染最為常見。呼吸道感染的病毒病原學(xué)因不同國(guó)家、不同省市和地區(qū)、不同年份、季節(jié)和年齡等而異。近年來隨著各種抗生素的廣泛應(yīng)用，呼吸道細(xì)菌感染有所降低，而呼吸道病毒感染呈上升趨勢(shì)[1]。國(guó)內(nèi)目前對(duì)于呼吸道病毒診斷的方法和技術(shù)還遠(yuǎn)落后于發(fā)達(dá)國(guó)家，從病發(fā)到確診往往需要一周左右的時(shí)間從而錯(cuò)過了治療的最佳時(shí)間。采用免疫熒光抗原檢測(cè)既能實(shí)現(xiàn)在呼吸道病毒感染的初始階段進(jìn)行特異性診斷，又可以避免病毒分離培養(yǎng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)，因此是對(duì)呼吸道病毒進(jìn)行檢測(cè)的理想方法[2]。本文分析直接免疫熒光法用于甲型流感抗原的快速檢測(cè)，該研究對(duì)粵北人民醫(yī)院2013年和2014年兩年間分別在春、夏、秋、冬季節(jié)住院的200例呼吸道感染患兒的呼吸道病毒采用直接免疫熒光法進(jìn)行快速檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2013～2014年粵北人民醫(yī)院呼吸道感染住院患兒200例，由患者的病史、X線片以及輔助檢查等結(jié)果以及原衛(wèi)生部頒發(fā)的《甲型H1N1流感診療方案及診斷標(biāo)準(zhǔn)(2010年版)》[3]中規(guī)定的呼吸道感染診斷標(biāo)準(zhǔn)得到確診。其中男120例、女80例，年齡0～12歲。按照入院的季節(jié)將其分為兩組：冬春兩季流行季節(jié)兒童組(100例)和夏秋兩季非流感流行期間兒童組(100例)。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集由專職人員將一次性采樣導(dǎo)管經(jīng)鼻腔插入7～8 cm到達(dá)鼻咽部，通過負(fù)壓誘導(dǎo)吸取1.0～2.0 mL分泌物置于10～15 mL放入微生物轉(zhuǎn)運(yùn)液的試管中,避免混入唾液及奶液而影響檢出率，標(biāo)本2 h內(nèi)送檢。

1.2.2標(biāo)本處理及制片用漩渦混勻器打散黏液，2 500 r/min離心10 min，棄去上清液(用于病毒分離鑒定)，留約100～150 μL，吸管吹打混勻，形成混濁細(xì)胞懸浮液。將標(biāo)本點(diǎn)樣在載玻片上(15～20 μL)，用電吹風(fēng)機(jī)冷風(fēng)下風(fēng)干10～15 min至干燥，浸沒在冷丙酮中固定10 min，取出晾干。

1.2.3標(biāo)本反應(yīng)及觀察每個(gè)標(biāo)本分別加D3試劑一滴(25 μL)，必須完全覆蓋待測(cè)標(biāo)本。將載玻片放在濕盒中置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育15～30 min。載玻片用PBS沖洗一遍，然后浸沒在PBS中洗兩遍(PBS不能重復(fù)使用)。在載玻片中央加一滴封閉液，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4結(jié)果判斷200倍顯微鏡下每視野找到≥2個(gè)綠色熒光細(xì)胞即為陽(yáng)性，否則為陰性。陰性細(xì)胞被Evans Blue染成紅色。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1甲型流感病毒陽(yáng)性結(jié)果FITC標(biāo)記的病毒特異性抗體和細(xì)胞中相應(yīng)的抗原結(jié)合后，形成抗原抗體復(fù)合物，在熒光顯微鏡下細(xì)胞內(nèi)呈黃綠色熒光，該細(xì)胞稱為陽(yáng)性細(xì)胞，見圖1。而未發(fā)生抗原抗體特異性反應(yīng)的細(xì)胞被Evans Blue染成紅色，見圖2。

圖1 甲型流感病毒陽(yáng)性結(jié)果 圖2 甲型流感病毒陰性結(jié)果

2.2不同季節(jié)兩組兒童甲型流感病毒感染情況冬春兩季流感流行期間，100例兒童檢測(cè)有8例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為8%；在夏秋兩季非流感流行期間100例兒童檢測(cè)有2例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為2%；兩組陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3　討　　論

在病毒流行季節(jié)，根據(jù)患兒的年齡和臨床表現(xiàn)，不難作出病毒感染診斷，但特異性病因?qū)W診斷對(duì)臨床預(yù)后、傳播方式、防治措施、危重患兒的監(jiān)護(hù)及合理用藥十分重要。甲型流感病毒又稱A型流感病毒，在動(dòng)物中廣為分布，能造成世界流感大流行,病毒感染免疫力較弱的兒童時(shí)會(huì)引起較嚴(yán)重的癥狀，如肺炎或是心肺衰竭等[4-5]。血清學(xué)檢查是目前應(yīng)用較廣泛的感染性疾病檢測(cè)方法，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清中是否存在針對(duì)呼吸道病毒的特異性抗體，作為呼吸道病毒感染診斷的依據(jù)，但病毒特異性抗體通常在病毒感染一周以后方能在血液中被檢測(cè)到，因此難以實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒感染的早期及時(shí)診斷。在甲型流感病毒流行季節(jié)，快速、準(zhǔn)確檢測(cè)出該病毒感染能及時(shí)指導(dǎo)臨床治療，為合理選用抗病毒、抗細(xì)菌藥物提供依據(jù)，從而能避免嚴(yán)重并發(fā)癥的出現(xiàn)。目前臨床甲型流感病毒有多種方法，但均存在一定的局限性[6]。電鏡可檢測(cè)病毒顆粒，但操作復(fù)雜、昂貴，不適用于臨床快速診斷；病毒分離培養(yǎng)被稱為“金標(biāo)準(zhǔn)”，但費(fèi)時(shí)、耗力，標(biāo)本內(nèi)病毒數(shù)量少時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陰性。病毒核酸檢測(cè)應(yīng)用雜交或PCR技術(shù)，通過檢測(cè)病毒特異性核酸來發(fā)現(xiàn)相關(guān)病毒；此法靈敏度高，能進(jìn)行微量檢測(cè)，但實(shí)驗(yàn)條件嚴(yán)格，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性[7]。本文采用熒光標(biāo)記的單克隆抗體對(duì)感冒患兒進(jìn)行甲型流感病毒抗原檢測(cè)，結(jié)果判斷以見到≥2個(gè)完整細(xì)胞內(nèi)有明亮的黃綠色熒光為陽(yáng)性，整個(gè)實(shí)驗(yàn)到發(fā)出報(bào)告可以在3 h內(nèi)完成，而設(shè)備只需要熒光顯微鏡，在普通實(shí)驗(yàn)室即可開展，有效地保證了快速出具診斷結(jié)果，滿足臨床對(duì)治療時(shí)效性的要求。

在冬春兩季流感流行期間，本文所檢測(cè)的甲型流感病毒感染患兒陽(yáng)性率為8%，夏秋兩季非流感流行期間陽(yáng)性率為2%，可見不同季節(jié)兒童感染甲型流感病毒的情況也有所不同，冬春兩季的感染率高于夏秋兩季(P<0.05)，說明冬春兩季是甲型流感病毒感染的好發(fā)季節(jié)[8-9]。該病毒感染患兒時(shí)會(huì)引起較嚴(yán)重的癥狀，早期快速檢測(cè)病原體能為臨床提供病原學(xué)資料，及時(shí)對(duì)癥治療，縮短病程。運(yùn)用直接免疫熒光法快速檢測(cè)甲型流感病毒抗原是一種經(jīng)濟(jì)、高效、快速、特異的檢測(cè)方法[10]，能指導(dǎo)臨床快速診斷，合理用藥。

[1]李軍偉，孫南葉，王慧晶．流感病毒快速檢測(cè)法對(duì)甲型H1N1流感的臨床診斷價(jià)值[J]．當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2013，19(12)：83．

[2]賴曉亞，栗燕．直接免疫熒光抗體法和血清IgM檢測(cè)呼吸道病毒的比較[J]．中外婦兒健康，2011，19(3)：6-7．

[3]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.甲型H1N1流感診療方案：2010年版[S].北京：中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，2010．

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Clinical significance of direct immunofluorescence assay for rapidly detecting influenza A virus antigen*

LIUYulan1,HEFengping1△,XIAOYun1,MAZhanzhong1,GUANZhenqi1,GUOYanle1,XIAOJie1,HOUHongmei1,YANGYuting2

(1.YuebeiPeople′sHospital,Shaoguan,Guangdong512026,China;2.ShanghaiXingyaoPhamarceuticalCo.Ltd.,Shanghai200444,China)

ObjectiveTo study the direct immunofluorescence method for rapidly detecting influenza A virus antigen and its clinical application.MethodsThe inpatients with clinically diagnosed acute respiratory tract infection were selected.Two hundred samples were collected and divided into two groups:the winter and spring epidemic seasons children group and the summer and autumn non-epidemic seasons children group,100 cases in each group.The US D3 Ultra influenza A virus antigen detection reagent was used.The fluorescence labeled monoclonal antibody was adopted to detect influenza A virus antigen in the patients with cold.ResultsDuring the winter and spring seasons of influenza prevalence,8 cases of 100 detected cases were positive with the positive rate of 8%;during the summer and autumn seasons of non-influenza prevalence,2 cases of 100 cases were positive with positive rate of 2%,the difference in the positive rate between the two groups had statistical significance(P<0.05).ConclusionApplying the direct immunofluorescence method for rapidly detecting influenza A virus antigen is an economical,efficient,rapid and specific detection method,and can guide clinical rapid diagnosis and rational medication.

influenza A virus;direct immunofluorescence;antigen;children

廣東省韶關(guān)市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013CX/K199)。

劉玉蘭，女，主管技師，主要從事檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)工作。△

，E-mail:fengphe@hotmail.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.011

A

1673-4130(2016)16-2234-02

2016-01-07

2016-06-14)