SSA/Ro60自身抗原的基因克隆與表達(dá)純化*

牛廣華，張　程，呂　丹，高玉潔

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽 110032)

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SSA/Ro60自身抗原的基因克隆與表達(dá)純化*

牛廣華，張程△，呂丹，高玉潔

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽 110032)

目的克隆人SSA/Ro60自身抗原并表達(dá)純化，為輔助診斷自身免疫提供物質(zhì)基礎(chǔ)。方法采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增SSA/Ro60基因，定向插入pPICZ表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，將獲得的重組蛋白行SDS-PAGE和Western blotting鑒定。結(jié)果擴(kuò)增出約1.5 kb的SSA/Ro60全長序列，獲得相對分子質(zhì)量60×103的重組蛋白，經(jīng)鑒定具有SSA/Ro60抗原性。結(jié)論成功克隆并表達(dá)SSA/Ro60，為診斷自身免疫疾病奠定基礎(chǔ)。

SSA/Ro60;基因克隆;表達(dá)純化

干燥綜合征(SS)是一種全身外分泌腺的慢性炎性自身免疫反應(yīng)疾病。研究表明，干燥綜合征A型抗原(SSA)與SS、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)等疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后判斷密切相關(guān)[1]。SSA抗原是細(xì)胞質(zhì)中一類小核糖核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合的復(fù)合物,是一種重要的自身抗原[2]。近年來越來越多的學(xué)者對自身免疫性疾病進(jìn)行深入的研究，對Ro抗原的認(rèn)識也越來越深，Ro成為了核糖核蛋白復(fù)合物(RNP)抗原中最常見的抗原之一[3]。后來發(fā)現(xiàn)，Ro抗原與SSA屬同一種自身抗原，故命名SSA/Ro抗原[4]。同時有研究者發(fā)現(xiàn)檢測SSA/Ro抗原在臨床上對自身免疫性疾病的診斷有極其重要的意義[5]。該抗原有52 000和60 000兩種相對分子質(zhì)量的蛋白，分別稱為SSA/Ro52和SSA/Ro60。SSA/Ro60存在于多種自身免疫性疾病患者體內(nèi),生理狀態(tài)下SSA/Ro60核蛋白及hYRNA共同構(gòu)成核糖核蛋白復(fù)合體SSA/Ro60抗原，與多種自身免疫疾病密切相關(guān)[6]。目前檢測SSA的免疫雙擴(kuò)散法無法區(qū)分Ro52和Ro60，免疫印跡法只能檢出Ro52，常常導(dǎo)致Ro60的漏檢[5]。所以本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用基因克隆技術(shù)成功表達(dá)出SSA/Ro60，為下一步建立新的SSA/Ro60檢測方法奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1質(zhì)粒、菌株、細(xì)胞株P(guān)MD18-T質(zhì)粒、人白血病HL-60細(xì)胞株購買自TAKARA公司，pPICZ質(zhì)粒、大腸埃希菌DH5α、酵母菌SMD1168由大連大學(xué)實(shí)驗(yàn)室贈送。

1.2儀器與試劑Thermo Hera生物安全柜；Biorad C1000 PCR擴(kuò)增儀；Biorad穩(wěn)壓穩(wěn)流水平電泳儀；Biorad穩(wěn)壓穩(wěn)流垂直電泳儀；Thermo Heracell 150 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱；Thermo Maxq 6000恒溫培養(yǎng)搖床；BIO-RAD凝膠成像分析系統(tǒng)；BIORAD電穿孔儀；電轉(zhuǎn)化杯。PCR試劑盒、 DNA連接酶試劑盒、限制性內(nèi)切酶、切膠純化試劑盒、質(zhì)粒抽提純化試劑盒均購買自TAKARA公司。cDNA合成試劑盒來自Transgen Biotech?？筍SA抗體、生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG、親和素標(biāo)記的HRP購買自ABCAM公司。

1.3方法

1.3.1SSA基因的擴(kuò)增HL-60細(xì)胞株經(jīng)CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)收獲，用TRIZOL方法提取RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用GeneBank數(shù)據(jù)庫確定SSA在基因組的位置，設(shè)計(jì)其兩端的引物，并引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，HIS標(biāo)簽位點(diǎn)等為后續(xù)的克隆及蛋白純化提供便利。上游引物：SAP3 5′-CCG GAA TTC AAA AGA ATG GAG GAA TCT GTA AAC CAA ATG CAG CCA CTG AAT GAG AAG CAG ATA-3′，下游引物：SAP4 5′-GCC TCG AGT TAT CAT TAT CAA TGA TGA TGA TGA TGA TGG GAA CCA CCA CCA CCT TAA ATC ATA TCT AAT GTG AAA TTT CGA ATT ACA T-3′。反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min， 94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s共30個循環(huán)， 72 ℃ 10 min。擴(kuò)增片段應(yīng)為1 511 bp。

1.3.2PCR產(chǎn)物純化，TA克隆及測序?qū)CR產(chǎn)物切膠純化后測量濃度，經(jīng)合適的酶切后連接于PMD18-T載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，通過藍(lán)白斑篩選方法，挑出白色斑點(diǎn)的重組質(zhì)粒進(jìn)行LB培養(yǎng)，培養(yǎng)后送至上海生工測序。

1.3.3定向克隆將測序鑒定好的質(zhì)粒和PICZ質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，經(jīng)切膠純化后按合適濃度進(jìn)行定向連接，轉(zhuǎn)化至DH5α后過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切鑒定。

1.3.4重組子線性化、導(dǎo)入表達(dá)系統(tǒng)及篩選挑選正確的轉(zhuǎn)化菌,增殖后抽提質(zhì)粒,用SacⅠ行單酶切,生成線性pPICZ-SSA重組子。采用電穿孔方法,將線性重組子導(dǎo)入畢赤酵母菌SMD1168中。用G418篩選高表達(dá)重組菌。

1.3.5重組蛋白的SDS-PAGE電泳分析在上述重組菌上清液1 mL加入0.4 g無菌的硫酸銨充分混勻,4 ℃條件下放置2 h,期間約10 min混勻一次,在4 ℃條件下,15 000 r/min離心5 min,棄上清液,加入15 μL pH 7.4 PBS徹底混勻,再加入上樣緩沖液15 μL混勻,置100 ℃煮沸5 min(Marker煮1 min),然后4 ℃,15 000 r/min離心5 min。取25 μL樣品加樣后進(jìn)行電泳(4 ℃,120 V),考馬斯亮藍(lán)染色。

1.3.6重組蛋白的Western blotting鑒定利用電轉(zhuǎn)儀將重組蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，BSA-TBST為封閉液，一抗是鼠抗人SSA抗體，二抗是生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，在親和素標(biāo)記的HRP、TMB顯色液共同作用下完成。

1.3.7蛋白純化將離心過濾后的碎菌上清液加入準(zhǔn)備好的His Bind column柱中，經(jīng)過一系列的洗柱平衡后收集濾液。

2　結(jié)　　果

2.1SSA基因擴(kuò)增及SSA-TA克隆測序瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示約一條1.5 kb的特異性條帶,片段大小與預(yù)計(jì)的1 511 bp相符(圖1)。且重組質(zhì)粒測序結(jié)果顯示與GeneBank報(bào)道的一致。

注：1為SSA PCR產(chǎn)物；M為DL2000 Marker。

2.2SSA-PICZ雙酶切鑒定將SSA-PICZ重組質(zhì)粒用XhoⅠ與EcoRⅠ雙酶切后電泳鑒定，得到兩條清晰條帶，片段大小分別為3.6 kbp和1.5 kbp，與預(yù)期結(jié)果一致(圖2方框內(nèi))。

注：方框內(nèi)為雙酶切后基因片段，上面約3.6 kb為質(zhì)粒，下面約1.5 kb為SSA;最右側(cè)為DL2000 Marker。

2.3重組蛋白SDS-PAGE和Western blotting鑒定本實(shí)驗(yàn)成功表達(dá)出SSA/Ro60重組蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，在60 000左右的位置出現(xiàn)一條較濃的蛋白區(qū)帶(圖3)。且該重組蛋白可與鼠抗人SSA結(jié)合，WB實(shí)驗(yàn)中可被特異性抗體識別，顯示其有良好的特異性(圖4)。

圖3　　重組蛋白SDS-PAGE電泳圖譜

圖4　　重組蛋白Western blotting圖譜

3　討　　論

Ro抗原根據(jù)其蛋白成分相對分子質(zhì)量的大小分為兩種類型:Ro52和Ro60抗原[7]。Ro抗原大部分存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),少部分存在于核周質(zhì)及核內(nèi)。Ro抗原在細(xì)胞內(nèi)以低含量的RNP形式存在,是與細(xì)胞角蛋白相似的一種纖維網(wǎng)絡(luò),所以對該抗原的提取具有一定的難度[8]。

由于自身抗原本身的特點(diǎn)為低含量、種類多,所以提取自身抗原的難度較大，要獲得均一的自身抗原更為困難。本實(shí)驗(yàn)從人白血病淋巴細(xì)胞HL-60株提取RNA,通過反轉(zhuǎn)錄技術(shù)得到cDNA,再以cDNA為模板成功擴(kuò)增出了SSA基因。將SSA基因轉(zhuǎn)入pPICZ載體構(gòu)建pPICZ-SSA重組質(zhì)粒,并將重組質(zhì)粒導(dǎo)入畢赤酵母菌SMD1168真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),最終獲得純度較高的重組蛋白，經(jīng)過對重組蛋白的純化鑒定后，證明其有一定的特異性。

本實(shí)驗(yàn)對靶基因SSA/Ro60 的核苷酸序列進(jìn)行 cDNA 合成中,采取反轉(zhuǎn)錄PCR 這一途徑代替用合成寡核苷酸探針篩選 cDNA 文庫的繁瑣基因克隆途徑，可以方便、簡捷地合成出目的基因SSA/Ro60。

畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)是蛋白表達(dá)研究中比較常用的表達(dá)系統(tǒng)。與原核表達(dá)系統(tǒng)相比,畢赤酵母基因系統(tǒng)具有許多優(yōu)點(diǎn)[9-12]。(1)具有強(qiáng)大的啟動子：畢赤酵母載體具有最強(qiáng)的醇氧化酶基因啟動子，使得該表達(dá)系統(tǒng)對外源蛋白表達(dá)的調(diào)控相當(dāng)嚴(yán)格。(2)表達(dá)量高：宿主菌株在畢赤酵母

菌中易于進(jìn)行高密度連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng),外源蛋白表達(dá)量高。(3)穩(wěn)定性高:重組質(zhì)粒能在畢赤酵母體系中的特定位點(diǎn)以單/多拷貝的形式穩(wěn)定整合,使外源基因在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定存在。

重組SSA/Ro60 抗原能特異識別患者體內(nèi)抗SSA血清,因而可用重組抗原作為診斷抗原來檢測自身免疫病,也可分析其片段的抗原性以了解其抗原表位，為探索自身免疫病的發(fā)生、發(fā)展提供輔助依據(jù)。下一步的研究中,筆者將對重組蛋白進(jìn)行理化學(xué)分析，希望通過對SSA/Ro60重組抗原的透徹分析,從分子免疫學(xué)角度為某些自身免疫病的臨床診斷提供依據(jù)，為制備重組抗原用于臨床檢測奠定基礎(chǔ)。

[1]蔡逸婷，劉慶中，趙超，等.聯(lián)合檢測抗α-胞襯蛋白、抗SSA和抗SSB抗體在干燥綜合征診斷中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代免疫學(xué)，2012，32(2)：152-155.

[2]彭勇， 譚立明，李華，等.ANA、SSA、SSB、RO-52在干燥綜合征診斷中的臨床意義 [J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2013，31(3)：229-247.

[3]鄭宗富.SSA抗原的克隆表達(dá)及其抗體檢測方法的建立[D].福州：福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007.

[4]魏權(quán)，楊湘越，蘭小鵬．人自身抗原SSA/Ro60的基因克隆和原核表達(dá)[J]．實(shí)用醫(yī)技雜志，2005，12(23)：3393-3394．

[5]徐泉.60kd SSA/Ro抗原的提取、純化及蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定[D].北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)，2004.

[6]李潔.抗SSA/RO60kDa抗原表位特異性單克隆抗體的表達(dá)和致病機(jī)制的研究[D].北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)，2009.

[7]呂良敬，陳順樂， 顧越英，等.R060/SSA基因轉(zhuǎn)染HEp-2細(xì)胞作為間接免疫熒光檢測底物及其應(yīng)用[J].標(biāo)記免疫分析與臨床，2006，13(1)：31-34.

[8]朱濤.人自身抗原Ro52的酵母重組表達(dá)及其抗體檢測斑點(diǎn)免疫金滲濾法的建立[D].福州：福建醫(yī)科大學(xué)，2011.

[9]張義浜，施立楠，唱韶紅，等.人sTNFRⅡ-IgG Fc融合蛋白在畢赤酵母菌中的表達(dá)及其產(chǎn)物分析[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2007,23(6)：515-519.

[10]Cereghino JL,Cregg JM.Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J].FEMS Microbiol Rev,2000,24(1):45-66.

[11]Thongekkaew J,Boonchird C.Molecular cloning and functional expression of a Novel extracellular liPase from the thermotolerant yeast Candida thermoPhila[J].FEMS Yeast Res,2007,7(2):232-243.

[12]Lin Cereghino GP,Sunga AJ,Lin Cereghino J,et al.Expression of foreign genes in the yeast Piehia Pastoris[J].Genet Eng (N Y),2001,23:157-169.

Gene cloning and expression purification of human autoimmune antigen SSA/60*

NIUGuanghua,ZHANGCheng△,LYUDan,GAOYujie

(AffiliatedHospitalofLiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang,Liaoning110032,China)

ObjectiveTo clone human autoimmune antigen SSA/Ro60 and to purify its expression to provide the material basis for the assisted diagnosis of human autoimmune diseases.MethodsThe SSA/Ro60 gene was cloned by RT-PCR and directionally inserted into expression vector pPICZ.The recombinant plasmid was transformed into Pichia SMD1168.The obtained recombinant protein was identified by SDS-PAGE and Western blotting.ResultsThe amplified full-length sequence was about 1.5 kb in size.The pPICZ-SSA positive clone produced a 60×103recombinant protein which had natural immunogenicity of human autoimmune antigen SSA/Ro60 by SDS-PAGE and Western blot.ConclusionHuman autoimmune antigen SSA/Ro60 is successfully cloned and expressed,which lays a foundation for diagnosing autoimmune diseases.

SSA/60；gene cloning；expression and purification

遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(02014010058-301)。

牛廣華，男，主任技師，主要研究方向是風(fēng)濕免疫分子生物?！?/p>

，E-mail:cecillia-85414@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.007

A

1673-4130(2016)16-2224-03

2016-01-29

2016-06-03)