聚集條件對羅非魚皮Ⅰ型膠原自聚集動力學的影響

閆鳴艷，秦 松（中國科學院煙臺海岸帶研究所，山東煙臺264003）

聚集條件對羅非魚皮Ⅰ型膠原自聚集動力學的影響

閆鳴艷，秦 松*
（中國科學院煙臺海岸帶研究所，山東煙臺264003）

采用Boltzmann函數(shù)擬合結合兩階段動力學模型（成核階段和生長階段），研究了膠原濃度、溫度、溶液pH和離子強度對羅非魚皮Ⅰ型膠原自聚集動力學的影響。結果表明：膠原濃度、溫度、溶液pH和離子強度能調控膠原自聚集動力學。當濃度達到或高于0.34 mg/mL時，膠原表現(xiàn)明顯的自聚集，且濃度越高越有利于膠原晶核的形成，過量的膠原分子能阻礙膠原纖維的生長；聚集溫度越接近膠原來源原料的生活溫度或溶液pH偏堿性，膠原越易自聚集；NaCl濃度也可影響膠原的自聚集動力學，適量濃度的NaCl有利于膠原晶核的形成，但NaCl濃度過高卻對膠原纖維的生長有阻礙作用。

膠原，自聚集，羅非魚，魚皮，動力學

Ⅰ型膠原是動物皮膚、軟骨、肌腱與韌帶等組織的基本結構物質［1］，由于其低抗原性、細胞粘附性、生物相容性和可降解性而被廣泛應用于生物材料和組織工程等領域。膠原通常從豬和牛中提取，然而近年來由于瘋牛病、口蹄疫等頻發(fā)與宗教文化上的差異，豬牛源膠原的應用受到限制。魚源膠原由于其來源的廣泛性、生物安全性和產品成本等方面均具有明顯優(yōu)勢［2］，因而對其研究和應用逐漸受到重視。羅非魚是我國常見的淡水魚之一，其出口量的逐年增長產生大量魚皮、魚骨等廢棄物，其中魚皮約占4.0%，而魚皮中的干物質70%以上為膠原。因此，對羅非魚皮膠原進行研究利用，不僅可減少環(huán)境污染與資源浪費，更有利于提高企業(yè)的經濟效益。

Ⅰ型膠原在體外能自聚集形成纖維，即具有完整三螺旋結構的膠原分子單體通過分子間的有序排列，形成具有交錯條紋結構（D-周期）的膠原纖維［2］，這是其在組織工程和生物材料領域的應用基礎。膠原的自聚性與溶液pH、離子強度、溶劑、溫度和濃度等密切相關［3-6］。到目前為止，相關學者已對狹鱈魚皮［7］、大馬哈魚［8］、草魚皮［2］和魚鱗［9］與烏鱧魚皮［10］等水產膠原在不同聚集條件下的自聚性開展了研究，發(fā)現(xiàn)聚集條件對水產膠原的自聚集動力學曲線有顯著影響。Fessler［11］認為膠原的氨基酸組成隨物種和組織的不同而表現(xiàn)差異，因此研究不同來源膠原的自聚性是極其必要的。然而，目前的研究工作大多集中于膠原自聚集體形態(tài)方面，對膠原自聚動力學的研究和解析甚少。因此，本文主要通過Boltamann函數(shù)擬合結合兩階段動力學模型探討濃度、溫度、溶液pH和離子強度等對羅非魚皮Ⅰ型膠原自聚動力學的影響，研究結果將對天然海洋膠原基材料的研究開發(fā)具有理論價值與參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚皮 由青島廠家提供，-20℃保存，實驗時4℃解凍；胃蛋白酶（1∶10000） 購自Sigma公司。

BR4i冷凍離心機 法國Jouan公司；LGJ0-5冷凍干燥機 北京四環(huán)科技儀器廠；UV-2102 PC紫外-可見分光光度計 上海龍尼柯儀器有限公司；PHS-3C精密酸度計 上海虹益儀器儀表有限公司；HHSNi電熱恒溫水浴鍋 北京長安科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 羅非魚皮Ⅰ型膠原的制備 參照Huang Y等［12］的I型膠原制備方法進行。由SDS-PAGE電泳分析其為Ⅰ型膠原。

1.2.2 膠原聚集條件 參照Yan M等的方法［7］。以濃度為0.5 mol/L的醋酸溶液為溶劑配制質量濃度為2 mg/mL的膠原溶液，將該溶液與等體積的40 mmol/L磷酸緩沖液（含有NaCl，pH為7.4）在冰浴中混合，使NaCl終濃度為0～260 mmol/L，膠原質量濃度為0.23～2.12 mg/mL，混合均勻后調節(jié)溶液pH為5.4～9.4，立即將溶液分別放在20、30、37℃水浴中進行自聚集。

1.2.3 膠原的自聚集動力學 溶液中膠原的自聚集過程可通過紫外-可見分光光度法來表征［13］。每1 h測定一次溶液在400 nm下的吸光度值以表征溶液中膠原的聚集，以0 h時的膠原溶液為空白。

所得膠原自聚集動力學曲線應用Boltzmann函數(shù)進行擬合，見式（1）。

依據(jù)Yan M等［7］的方法，膠原自聚集動力學可通過式（2）進行分析。

其中，At：膠原溶液在時間t時400 nm的吸光度；Ae：膠原溶液在平衡階段400 nm的吸光度；A0：膠原溶液在時間為0 h時400 nm的吸光度；k：速率常數(shù)。

將ln［（Ae-At）/（Ae-A0）］對時間t作圖可得到一條直線，斜率即為膠原自聚集速率常數(shù)k。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用Origin 7.5進行ANOVA單因素方差分析。p＜0.05，表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 濃度對羅非魚皮Ⅰ型膠原自聚集動力學的影響

研究表明膠原的自聚集動力學曲線為S型［7，13］，因此本研究通過Boltzmann函數(shù)對不同濃度膠原自聚集動力學曲線進行擬合，擬合結果如圖1（a）和表1所示?？梢钥闯鰸舛葹?.34、0.52、0.94、2.12 mg/mL的膠原自聚集動力學曲線均可用Boltamann函數(shù)擬合（R2＞0.9），但濃度為0.23 mg/mL膠原的擬合結果較差（R2＜0.9），表明膠原在濃度為0.34～2.12 mg/mL時可發(fā)生明顯的自聚集，但膠原濃度為0.23 mg/mL的自聚集現(xiàn)象不明顯。Kadler［14］認為膠原自聚集存在臨界濃度，在臨界濃度以上，膠原能自聚集形成明顯的聚集體；但在臨界濃度以下，通過離心和濁度測定方法不能檢測到膠原聚集體的形成［15］。由此推斷，羅非魚皮Ⅰ型膠原自聚集的臨界濃度為0.23～0.34 mg/mL。

圖1 不同濃度下羅非魚皮Ⅰ型膠原自聚集動力學曲線（a）及線性擬合關系（b）Fig.1 The kinetic self-assembly curves（a）and linear fitting relationships（b）of type Ⅰ collagen from tilapia skin with different concentrations

為進一步研究不同濃度膠原的自聚集動力學，運用式（2）對測定數(shù)據(jù)進行分析，所得結果如圖1（b）所示?？梢钥闯瞿z原的自聚集過程可分為兩個階段，其分界點對應于溶液吸光度開始顯著增大的時間，如圖1（a）所示，這與膠原的成核-生長理論［16］相對應，說明運用式（2）對膠原自聚集動力學進行解析是合理的。因此，可以認為膠原自聚集過程的第一和第二階段分別為其成核階段和生長階段［7］；兩階段分界點對應的時間可認為是膠原的成核時間。圖1（b）還表明隨著濃度的增大，膠原的成核時間逐漸降低，表明膠原分子越多，越容易自聚集形成晶核。膠原自聚集兩階段的聚集速率常數(shù)可通過最小二乘法得到，結果如表1所示。隨著膠原濃度的增大，成核階段的速率常數(shù)逐漸增大，進一步說明膠原分子越多越有利于晶核的形成。但生長階段的聚集速率常數(shù)隨著膠原濃度的增大呈現(xiàn)先升高后降低的特點，在膠原濃度為0.94 mg/mL時達到最大值，表明適量的膠原分子能促進纖維的生長，但過多卻產生抑制作用。

表1 不同濃度下羅非魚皮Ⅰ型膠原自聚集速率常數(shù)Table1 The rate constant of typeⅠcollagen self-assembly from tilapia skin with different concentrations

2.2 溫度對羅非魚皮Ⅰ型膠原自聚集動力學的影響

溫度對羅非魚皮Ⅰ型膠原自聚集動力學的影響如圖2（a）和表2所示。經Boltzmann函數(shù)擬合發(fā)現(xiàn)，膠原在20℃和37℃條件下也可發(fā)生明顯的自聚集，并且與在30℃時自聚集類似，其聚集過程也分為兩個階段，但是自聚集參數(shù)卻隨著溫度的不同而不同。在自聚集溫度為30℃時，膠原的成核時間明顯短于在其他溫度下，且其自聚集速率常數(shù)也較高，表明羅非魚皮膠原在30℃時較易自聚集，這可能與膠原原料的生活溫度有關。羅非魚的最適生活溫度為28～30℃［17］，由此可以認為自聚集溫度越接近于動物的生活溫度，由其來源的膠原的自聚集能力越強，這與在草魚魚鱗膠原自聚集研究上得到的結果是一致的［9］。

2.3 溶液pH對羅非魚皮Ⅰ型膠原自聚集動力學的影響

圖2 不同溫度下羅非魚皮Ⅰ型膠原自聚集動力學曲線（a）及線性擬合關系（b）Fig.2 The kinetic self-assembly curves（a）and linear fitting relationships（b）of type Ⅰ collagen from tilapia skin at different temperatures

表2 不同溫度下羅非魚皮Ⅰ型膠原自聚集速率常數(shù)Table2 The rate constant of type Ⅰ collagen self-assembly from tilapia skin at different temperatures

不同溶液pH下，羅非魚皮Ⅰ型膠原自聚集動力學擬合曲線如圖3（a）和表3所示，可以看出膠原在pH5.4～9.4的范圍內均能夠發(fā)生明顯的自聚集，與牛皮Ⅰ型膠原的研究結果一致［18］。采用式（2）對擬合曲線進行分析，結果如圖3（b）和表3所示。當溶液pH為7.4、8.4和9.4時，膠原的成核時間明顯短于pH為5.4和6.4時；隨著溶液pH由5.4增大到9.4，膠原自聚集成核階段的速率常數(shù)逐漸增大，生長階段的速率常數(shù)先增大后降低，在pH7.4時達到最大值。上述結果表明羅非魚皮膠原在堿性條件下自聚集能力較強，這主要與其等電點有關［3］。

圖3 不同pH下羅非魚皮Ⅰ型膠原自聚集動力學曲線（a）及線性擬合關系（b）Fig.3 The kinetic self-assembly curves（a）and linear fitting relationships（b）of typeⅠcollagen from tilapia skin at different pH values

2.4 溶液離子強度對羅非魚皮Ⅰ型膠原自聚集動力學的影響

圖4 不同NaCl濃度下羅非魚皮Ⅰ型膠原自聚集動力學曲線（a）及線性擬合關系（b）Fig.4 The kinetic self-assembly curves（a）and linear fitting relationships（b）of typeⅠcollagen from tilapia skin at different NaCl concentrations

表3 不同pH下羅非魚皮Ⅰ型膠原自聚集速率常數(shù)Table3 The rate constant of type Ⅰ collagen self-assembly from tilapia skin at different pH values

在不同離子強度（NaCl濃度）下，羅非魚皮Ⅰ型膠原自聚集動力學曲線如圖4（a）所示，擬合Boltzmann函數(shù)如表4所示?？梢钥闯霎斪跃奂芤褐杏蠳aCl存在時，膠原表現(xiàn)明顯的自聚集現(xiàn)象（R2＞0.9），但是若溶液中沒有NaCl存在，膠原并未表現(xiàn)明顯的自聚集過程（R2=0.66）。由此可以得出：NaCl在膠原的自聚集過程中發(fā)揮重要作用，這與Li和Douglas在牛膠原自聚集性上的研究結果類似［13］，但是與狹鱈魚皮膠原上的結果不同［7］，可能是由聚集溫度不同導致的。利用式（2）對膠原自聚集動力學曲線進行分析，結果見圖4（b）和表4。隨著溶液中NaCl濃度的增大，膠原的成核時間明顯縮短，原因可能是NaCl通過屏蔽帶電基團而降低了膠原分子間的斥力［19］。另外，隨著溶液中NaCl濃度的增大，膠原自聚集成核階段的速率常數(shù)是逐漸增大的；而生長階段的速率常數(shù)在NaCl濃度由32.5 mmol/L增大到130 mmol/L時是增大的，但是繼續(xù)增大NaCl濃度，其值是降低的，表明在聚集溶液中適度加入NaCl有利于膠原的自聚集，但是過量的NaCl卻阻礙了膠原纖維的生長。

表4 不同NaCl濃度下羅非魚皮Ⅰ型膠原自聚集速率常數(shù)Table4 The rate constant of type Ⅰ collagen self-assembly from tilapia skin at different NaCl concentrations

3 結論

羅非魚皮Ⅰ型膠原具有體外自聚集能力，其自聚集過程表現(xiàn)為兩個階段：成核階段和生長階段。膠原濃度、溫度、溶液pH和離子強度（NaCl濃度）均能夠影響到羅非魚皮Ⅰ型膠原的自聚集動力學。膠原或NaCl濃度越高越有利于膠原晶核的形成，但是濃度過高卻對膠原纖維的生長有阻礙作用；聚集溫度越接近膠原來源原料的生活溫度或溶液pH偏堿性，膠原越容易自聚集。因此可通過調控膠原的聚集條件來調控其自聚集過程，進一步對聚集體形態(tài)進行調控，這對于海洋Ⅰ型膠原生物材料和食品包裝材料的研究和開發(fā)具有非常重要的意義。后續(xù)研究將著重探討聚集條件對膠原聚集體形態(tài)和功能的調控作用。

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Effect of the aggregation conditions on the kinetic self-assembly of typeⅠcollagen from tilapia（Oreochromis niloticus）skin

YAN Ming-yan，QIN Song*
（Yantai Institute of Coastal Zone Research，Chinese Academy of Sciences，Yantai 264003，China）

The effects of collagen concentration，temperature，pH value and ionic strength on the kinetic self-assembly of type Ⅰ collagen from tilapia（Oreochromis niloticus）skin were investigated by Boltzmann function and a two-phase kinetic self-assembly model（nucleation phase and growth phase）.It showed that the kinetic self-assembly of collagen could be modulated by collagen concentration，temperature，pH value and ionic strength.The marked self-assembly was formed when the concentration of collagen reaching and above 0.34 mg/mL from the fitted kinetic self-assembly curve.More of collagen molecules were beneficial for the formation of nucleus，but excess would inhibit the growth of fibril.Collagens were more likely to self-assemble when the temperature was close to the environmental temperature for samples or in the alkaline solution.Finally，the collagen self-assembly could be modulated by NaCl concentration.The higher NaCl concentration was beneficial to the formation of nucleus，but the superabundant of NaCl would inhibit the growth of fibril.

collagen；self-assembly；tilapia；fish skin；kinetic

TS201.1

A

1002-0306（2016）02-0093-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.010

2015-05-06

閆鳴艷（1980-），女，博士，助理研究員，研究方向：海洋生物活性物質及其功能特性研究，E-mail：mingyan012003@163.com。

*通訊作者：秦松（1968-），男，博士，研究員，研究方向：海岸帶生物活性物質及其功能特性研究，E-mail：sqin@yic.ac.cn。

國家自然科學基金（31201455，41576155）；山東省海洋經濟創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范產業(yè)項目（海洋活性蛋白及其功能制品的開發(fā)與產業(yè)化）。