侵染冬瓜的病毒病原種類鑒定

尤　毅,　李華平,　謝大森

(1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所,廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州　510640;2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資環(huán)學(xué)院, 廣州　510642)

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侵染冬瓜的病毒病原種類鑒定

尤毅1,2,李華平2,謝大森1*

(1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所,廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州510640;2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資環(huán)學(xué)院, 廣州510642)

本研究在我國(guó)主要冬瓜產(chǎn)區(qū)采集具有典型病毒病癥狀的病葉材料105份,根據(jù)葫蘆科作物上常見(jiàn)的5種病毒病原的CP基因設(shè)計(jì)特異性引物,對(duì)105份待檢冬瓜材料進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明:5對(duì)特異引物可分別在105份待檢材料的95份中檢測(cè)到小西葫蘆黃花葉病毒(Zucchiniyellowmosaicvirus,ZYMV)、西瓜花葉病毒(Watermelonmosaicvirus,WMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)、番木瓜環(huán)斑病毒(Papayaringspotvirus,PRSV)4種病毒,未檢測(cè)到南瓜花葉病毒(Squashmosaicvirus,SqMV);并且發(fā)現(xiàn)不同的冬瓜主產(chǎn)區(qū)致病的病毒種類有較大差異;同時(shí)還發(fā)現(xiàn),在這些待檢樣品中4種病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象較普遍,其中以PRSV與WMV組合最常見(jiàn),占復(fù)合侵染現(xiàn)象的31.25%;未發(fā)現(xiàn)有4種病毒復(fù)合侵染。

冬瓜;病毒病;病原鑒定

冬瓜[Benincasahispida(Thunb.) Cogn.]屬葫蘆科冬瓜屬,是一年生攀緣性草本植物,起源于中國(guó)和印度,廣泛分布于亞洲的熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū),目前以中國(guó)、東南亞和印度等地種植為主。冬瓜是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的農(nóng)作物,在我國(guó)冬瓜栽培已有2 000多年的歷史,年播種面積達(dá)25萬(wàn)hm2。由于市場(chǎng)需求的增加,冬瓜的栽種面積逐年擴(kuò)大,復(fù)種指數(shù)提高,導(dǎo)致冬瓜上的病害日益嚴(yán)重。過(guò)去人們的關(guān)注焦點(diǎn)主要集中在疫病、枯萎病等真菌病害,在這些方面做了大量的研究工作。近年來(lái),冬瓜病毒病呈上升趨勢(shì),所造成的危害已超過(guò)真菌病害,2003年以來(lái)，華南地區(qū)的冬瓜主產(chǎn)區(qū)冬瓜病毒病暴發(fā)成災(zāi),造成冬瓜大幅減產(chǎn),嚴(yán)重的甚至絕產(chǎn)絕收[1]。

引發(fā)冬瓜病毒病的病毒種類各國(guó)相繼有報(bào)道。Samretwanich等[2]認(rèn)為番茄卷葉病毒(Tomatoleafcurlvirus)是冬瓜病毒病的主要病原物,Chen等[3-4]報(bào)道臺(tái)灣冬瓜病毒病的病原物是番茄斑萎病毒屬(Tospovirus)成員,可能是西瓜銀色斑駁病毒(Watermelonsilvermottlevirus, WSMV)的1個(gè)菌株。Tsuda等[5]分析了從5個(gè)不同寄主上分離的Tospovirus屬毒株,發(fā)現(xiàn)冬瓜分離物的蛋白質(zhì)分子量是32 kD,S RNAs的分子量是1.21×106,與WSMV的序列同源率達(dá)97%。Okuda等[6]也證實(shí)在日本導(dǎo)致冬瓜產(chǎn)生病毒病的是WSMV。Tomassoli等[7]首次報(bào)道香石竹斑駁病毒屬(Carmovirus)成員甜瓜壞死病毒(Melonnecroticspotvirus,MNSV)是意大利冬瓜病毒病的病原物。這說(shuō)明不同地區(qū)或國(guó)家引起冬瓜病毒病的病毒種類可能不一樣。

目前,我國(guó)發(fā)現(xiàn)的侵染葫蘆科作物的病毒中,分布最廣、危害最重的有5種,即小西葫蘆黃花葉病毒(Zucchiniyellowmosaicvirus,ZYMV)、西瓜花葉病毒(Watermelonmosaicvirus,WMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)、番木瓜環(huán)斑病毒(Papayaringspotvirus,PRSV)和南瓜花葉病毒(Squashmosaicvirus,SqMV)[8]。由于缺乏有關(guān)冬瓜病毒病毒原種類的調(diào)查報(bào)道,本研究調(diào)查了葫蘆科作物上5種常見(jiàn)的病毒在冬瓜上的發(fā)生情況,以及我國(guó)各主要冬瓜產(chǎn)區(qū)的病毒病發(fā)病及病原分布情況,可為冬瓜病毒病抗性育種提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1供試材料

待檢材料:具有典型或可疑病毒病癥狀的冬瓜材料105份,分別采自我國(guó)冬瓜主產(chǎn)區(qū),主要包括廣東三水(7份)、臺(tái)山(5份)、徐聞(8份)、清遠(yuǎn)(英德8份,清新3份)、廣州(白云7份,番禺4份);江西樟樹(7份);湖南(長(zhǎng)沙4份,瀏陽(yáng)6份);陜西(西安2份,寶雞4份);重慶(4份);廣西(南寧11份,桂林5份);江蘇大豐(9份)以及海南(文昌5份,儋州6份),保存于-80℃超低溫冰箱。

陽(yáng)性對(duì)照:ZYMV、WMV、SqMV毒源由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所古勤生研究員惠贈(zèng),CMV和PRSV由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病毒研究室提供。所有陽(yáng)性對(duì)照均采用摩擦接種的方法接種到西葫蘆(CucurbitapepoL.)葉片上,待顯癥后采用DAS-ELISA法進(jìn)行檢測(cè),確認(rèn)病原為唯一病毒病原后,取葉片干燥保存。

1.2方法

1.2.1冬瓜葉片總RNA的提取

使用天根公司RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒(離心柱型)提取待測(cè)樣品和陽(yáng)性對(duì)照的葉片總RNA,具體提取步驟參照產(chǎn)品說(shuō)明書。

(1)勻漿處理:取50～100 mg冬瓜葉片,在液氮中迅速研磨成粉末狀,加入450 μL 裂解液RL(使用前加入β-巰基乙醇,終濃度為2%),混勻后室溫放置5 min。

(2)13 400 g 離心5 min,取上清(約400 μL)于另一新離心管。

(3)緩慢加入上清0.5倍體積的無(wú)水乙醇,混勻(此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)沉淀),將得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱CR3中,13 400 g 離心60 s,棄掉收集管中的廢液,并將吸附柱CR3放回收集管中。

(4)向吸附柱CR3中加入700 μL去蛋白液RW1,13 400 g離心60 s,棄掉收集管中的廢液,將吸附柱CR3放回收集管中。

(5)向吸附柱CR3中加入500 μL漂洗液RW(使用前已按比例加入無(wú)水乙醇),室溫靜置2 min,13 400 g離心60 s,棄掉收集管中的廢液,并將吸附柱CR3放回收集管中。

(6)重復(fù)步驟(5)。

(7)13 400 g空柱離心2 min,取出后將吸附柱CR3置于室溫放置數(shù)分鐘,以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

(8)將吸附柱CR3放入一個(gè)新的RNase-free離心管中,向吸附膜中間部位懸空滴加50 μL RNAse-free ddH2O,室溫靜置2 min,13 400 g離心2 min,得到RNA溶液。

RNA溶液保存于-80℃冰箱。

1.2.2冬瓜病毒病毒原RT-PCR檢測(cè)

1.2.2.1引物設(shè)計(jì)

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及已有的病毒CP基因序列,設(shè)計(jì)引物組合(表1)。

1.2.2.2RT-PCR擴(kuò)增

采用寶生物工程(大連)有限公司Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,常規(guī)PCR擴(kuò)增。反轉(zhuǎn)錄體系及PCR擴(kuò)增體系參考產(chǎn)品說(shuō)明書,5種病毒的PCR擴(kuò)增參數(shù)見(jiàn)表2。PCR產(chǎn)物4℃保存,取8 μL在1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳,PCR檢測(cè)呈陰性的待檢材料,重復(fù)1次RT-PCR擴(kuò)增,若結(jié)果仍為陰性,則重新提取RNA,再次進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,若檢測(cè)結(jié)果仍為陰性,即認(rèn)為該材料不含有病毒。

表1　檢測(cè)5種病毒毒原CP基因的特異性引物Table 1　Specific primers for detection of CP gene in the five virus pathogens by RT-PCR

表2　5種病毒的PCR擴(kuò)增參數(shù)1)Table 2　PCR amplification parameter for each virus

1) 循環(huán)次數(shù)均為35次。∞代表反應(yīng)時(shí)間不限定,直到樣品取出為止。

35 cycles. ∞ indicated reaction time was unlimited till the samples were taken out.

2　結(jié)果與分析

2.1RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

在西葫蘆上分別接種5種病毒,取有明顯癥狀的葉片作為陽(yáng)性對(duì)照。以待測(cè)樣品及陽(yáng)性對(duì)照的總RNA作為模板,分別用不同的引物對(duì)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。部分檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1,陽(yáng)性對(duì)照和待檢樣品中,引物ZYMV-F/ZYMV-R可擴(kuò)增出大小約1 500 bp的條帶(圖1a);引物WMV-F/WMV-R可擴(kuò)增出大小約為1 200 bp的條帶(圖1b);引物CMV-F/CMV-R可擴(kuò)增出大小約660 bp的條帶(圖1c),引物PRSV-F/PRSV-R可擴(kuò)增出大小約500 bp的條帶(圖1d);引物SqMV-F/SqMV-R僅在陽(yáng)性對(duì)照中能擴(kuò)增出大小約1 100 bp的條帶(圖1e),在所有的待檢材料中均沒(méi)擴(kuò)出目標(biāo)條帶。3次重復(fù)檢測(cè)結(jié)果一致。這表明在待檢樣品中能分別檢測(cè)出CMV、ZYMV、PRSV和WMV,但未檢測(cè)到SqMV。

2.2各地區(qū)的發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)

不同地區(qū)的待檢材料RT-PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。105份材料中有95份分別檢出ZYMV、CMV、PRSV和WMV 4種病毒,未檢測(cè)出SqMV,陽(yáng)性檢出率達(dá)90.48%。其中陽(yáng)性檢出率最高為PRSV和WMV(檢出率分別達(dá)47.62%和45.72%),其次為ZYMV和CMV(檢出率分別達(dá)24.76%和21.90%)。按待檢材料的采集區(qū)域來(lái)看,廣東大部分區(qū)域(除廣州白云、徐聞外)及海南所采的樣品中,未檢出ZYMV;在廣東清新、徐聞、海南、江西、江蘇及湖南地區(qū)采集的樣品中,未檢出CMV;在廣東番禺、清新、陜西西安和寶雞采集的樣品中未檢出WMV;在各地區(qū)的樣品中均能檢出PRSV;在所有的樣品中,均未檢出SqMV。這些結(jié)果表明,PRSV與WMV在我國(guó)主要冬瓜產(chǎn)區(qū)可能分布最為廣泛,其次是ZYMV與CMV,在冬瓜上尚未發(fā)現(xiàn)SqMV。

表3的結(jié)果反映出在各地區(qū)普遍存在不同病毒的復(fù)合侵染現(xiàn)象。其中有2種病毒復(fù)合侵染,也有3種病毒復(fù)合侵染,但未見(jiàn)4種病毒復(fù)合侵染。且病毒組合多種多樣,有ZYMV與CMV組合,ZYMV與PRSV組合,ZYMV與WMV組合,PRSV與WMV組合,PRSV與CMV組合,WMV與CMV組合,ZYMV、WMV與PRSV組合,ZYMV、WMV與CMV組合,ZYMV、PRSV與CMV組合。2種病毒復(fù)合侵染,以PRSV與WMV組合最常見(jiàn),在95份檢出樣品中有15份材料,占復(fù)合侵染組合的31.25%;3種病毒復(fù)合侵染則相對(duì)較少,共5份材料,其中有3份是ZYMV、WMV和PRSV組合。

采集地Site樣品總數(shù)/份Totalnumberofsamples攜帶不同病毒樣本數(shù)/份NumberofsampleswithdifferentvirusesZYMVCMVPRSVWMVSqMV復(fù)合侵染Mixedinfection份數(shù)Number百分率/%Percentage陽(yáng)性檢出率Positiverate份數(shù)Number百分率/%Percentage白云Baiyun733240455.56685.71番禺Panyu40120000375.00清新Qingxin30010000133.33英德Yingde80266081008100三水Sanshui703250342.867100臺(tái)山Taishan501130120.00480.00徐聞Xuwen820550562.50787.50江蘇Jiangsu960540666.679100江西Jiangxi720240228.577100陜西Shaanxi616400583.336100海南Hainan1100620218.18981.82湖南Hunan1030460220.0010100廣西Guangxi1676870743.751487.50重慶Chongqing421220375.004100合計(jì)Total1052623504804845.719590.48

各地區(qū)樣品的病毒檢出率都較高,廣東三水和英德、陜西、江西、江蘇、湖南及重慶地區(qū)的檢出率達(dá)到100%,清新地區(qū)檢出率最低。由于本研究所采集的冬瓜樣品均為具有典型病毒病癥狀的冬瓜葉片,但部分樣品未檢出上述5種病毒中的任意一種,說(shuō)明除了這5種病毒外,可能還存在其他種類的病毒危害冬瓜生產(chǎn)。

3　討論

從本研究的結(jié)果來(lái)看,侵染冬瓜的病毒病原主要有ZYMV、CMV、PRSV和WMV 4種,未檢測(cè)出SqMV陽(yáng)性的材料。利用機(jī)械摩擦人工接種冬瓜葉片,SqMV可以成功接種,并在冬瓜葉片上產(chǎn)生典型的病毒病病斑[9],本研究在所有供試冬瓜材料中未檢出SqMV的主要原因有:(1)病毒毒原的分布具有地區(qū)性,在我國(guó),報(bào)道該病毒發(fā)生的地方并不多,目前只在黑龍江的南瓜(Cucurbitamoschata)[10],新疆[11-13]、甘肅[12]的甜瓜(Cucumismelo),山西運(yùn)城的南瓜[14]、河南開封和孟津的西葫蘆(Cucurbitapepo)[14]上發(fā)現(xiàn)。(2)樣品采樣的主要依據(jù)是冬瓜葉片上有無(wú)病斑,由于病毒侵染具有潛伏期,在潛伏期內(nèi)植株不表現(xiàn)癥狀,導(dǎo)致漏采。(3)采樣量少,一方面的原因是采樣地點(diǎn)具有病毒病癥狀的植株少;有的病株已經(jīng)枯萎,失去研究的可能性;另一方面,采樣地點(diǎn)發(fā)病植株表現(xiàn)的癥狀非常相似,具有差異的病株較少,導(dǎo)致重復(fù)采樣。

本研究中,尚有部分材料具有典型病毒病癥狀,但對(duì)5種所檢病毒均呈陰性的材料,未檢出病毒的原因主要有:(1)保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)且保存條件不好,導(dǎo)致RNA降解。(2)材料受到除本文涉及的5種病毒以外的其他病毒侵染,據(jù)目前的報(bào)道,冬瓜上的病毒病原除了本研究所涉及的5種外,已經(jīng)確認(rèn)的還有黃瓜綠斑駁花葉病毒、西瓜銀色斑駁病毒[4]、番茄曲葉病毒[2]、馬蹄蓮?fù)示G斑病毒[15]等,其中有部分為檢疫病毒,但如黃瓜綠斑駁花葉病毒在我國(guó)已有相關(guān)報(bào)道,不排除該病毒侵染冬瓜的可能性。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Identification of pathogenic viruses infecting wax gourd

You Yi1,2,Li Huaping2,Xie Dasen1

(1. Vegetable Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangdong Provincial Key Lab for New Technology Research on Vegetables, Guangzhou510640, China; 2. College of Natural Resources and Environment, South China Agricultural University, Guangzhou510642, China)

According to the CP genes ofZucchiniyellowmosaicvirus(ZYMV),Watermelonmosaicvirus(WMV),Cucumbermosaicvirus(CMV),Papayaringspotvirus(PRSV)andSquashmosaicvirus,(SqMV), five pairs of specific primers were designed for RT-PCR. A total of 105 diseased wax gourd leaf samples with typical symptoms collected from the main producing area were amplified with the specific primers. ZYMV, WMV, CMV and PRSV were detected in the 95 diseased samples, and all the tested samples showed negative with SqMV. There were different types of pathogenic viruses in different main producing areas.Complex infection is very common, and 31.25% of them is mixed infection of PRSV and WMV, which is the most common one. No infection was found by all four viruses.

wax gourd;virus disease;pathogen identification

2015-02-14

2015-04-17

廣州市產(chǎn)學(xué)研協(xié)同創(chuàng)新重大專項(xiàng)(201508020085);廣東省公益研究與能力建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(20140202)

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S 432.41

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.02.033