頂孢霉Ahy1菌株微粉劑的配方篩選

郝　雨,　楊順義,　沈慧敏,　張新虎,　陳　娥

(甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院,草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)省部共建教育重點實驗室,中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展中心,蘭州　730070)

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頂孢霉Ahy1菌株微粉劑的配方篩選

郝雨,楊順義,沈慧敏,張新虎*,陳娥

(甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院,草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)省部共建教育重點實驗室,中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展中心,蘭州730070)

采用室內生物測定的方法,從6種載體、6種分散劑、5種黏著劑、5種紫外保護劑中篩選適宜于頂孢霉Ahy1孢子粉微粉劑的助劑。結果表明,載體硅藻土、紫外線保護劑熒光素鈉和腐植酸、分散劑木質素磺酸鈉(或鈣)、黏著劑羧甲基纖維素對頂孢霉孢子的生物活性無顯著影響。用以上助劑加工的20%頂孢霉孢子粉微粉劑,孢子含量為9.8×109個/g,干燥減量為4.36%,孢子萌發(fā)率為90.23%,比重為0.37 g/cm3,顆粒細度過200目篩,粉粒直徑約為74 μm, 5 ℃下貯藏6個月后孢子萌發(fā)率為80%,符合真菌農藥粉劑國家標準(標準號GB/T25864-2010),在微粉細度上符合制劑標準。

頂孢霉;孢子粉;粉劑;載體;分散劑;黏著劑;紫外保護劑

真菌生防制劑是以有害生物的病原真菌為有效成分的生物農藥,具有觸殺性、流行性、環(huán)境安全、不殺傷非目標生物等特點,在病蟲草害控制中具有巨大潛力[1]。隨著微生物防治的日益發(fā)展,病原微生物的生產規(guī)模向制劑化及其商業(yè)化方向發(fā)展[2]。球孢白僵菌的應用在昆蟲病原真菌中是比較成功的例子,其劑型從傳統(tǒng)的粉劑、油懸浮劑、顆粒劑、可濕性粉劑到安全環(huán)保的水基性制劑均有登記注冊,利用這些制劑防治農林業(yè)害蟲也取得了巨大成效[3]。

漢遜頂孢霉(Acremoniumhansfordii)是一種蟲生真菌[4]。甘肅農業(yè)大學農藥系從蚜蟲上分離獲得一株頂孢霉菌株Ahy1。宋麗雯[5]研究證實該菌株對桃蚜、苜蓿斑蚜、豆無網(wǎng)長管蚜、黏蟲和菜青蟲均有較強的侵染力。開發(fā)適宜于甘肅省干旱條件下生產和應用的頂孢霉殺蟲制劑,對保護生態(tài)環(huán)境具有十分重要的意義。甘肅農業(yè)大學農藥實驗室已經篩選的頂孢霉Ahy1菌株分生孢子制劑有可濕性粉劑[6]、乳懸劑[7]。近年來隨著有機食品需求越來越大,蔬菜大棚應用越來越廣泛,篩選一種更適用于溫室大棚環(huán)境的頂孢霉分生孢子制劑對溫室蔬菜害蟲的綠色防控有重要意義。微粉劑以單一粒子在空間懸浮、擴散,可均勻附著在作物上。平均粒徑在5 μm以下的細粉劑,其特點是粉劑粒子不凝聚,適用于從室外向溫室、大棚內噴粉,且操作簡單、迅速、安全。粉粒在空氣中的懸浮時間也比同等細度的霧滴長,粉劑在棚室空間能夠形成比較持久的粉霧現(xiàn)象。真菌孢子粉形成的粉霧在溫室大棚中能夠充分擴散,在葉上均勻分布,其效果顯著優(yōu)于噴霧法[8]。本文對頂孢霉Ahy1菌株分生孢子微粉劑配方進行了篩選,旨在為研制頂孢霉新制劑提供依據(jù)。

1　材料和方法

1.1試驗材料

菌株及孢子粉:頂孢霉Ahy1菌株及其孢子粉,由甘肅農業(yè)大學農藥實驗室提供。

載體:硅藻土(天津市大茂化學試劑廠)、高嶺土(上海建信化工有限公司試劑廠)、白炭黑(天津市大茂化學試劑廠)、碳酸鈣、膨潤土和滑石粉均由天津市光復精細化工研究所生產。

分散劑:木質素磺酸鈣、木質素磺酸鈉、聚萘磺酸鈉、二丁基萘磺酸鈉、月桂酸鈉均由天津市光復精細化工研究所提供,辛基酚聚氧乙烯醚磺酸鈉(江蘇省海安石油化工廠)。

黏著劑:淀粉、聚乙烯醇(蘇州利源化工)、聚乙酸乙烯酯(蘇州利源化工)、羧甲基纖維素(天津市光復精細化工研究所)、硅酸鈉(天津市光復精細化工研究所)。

紫外保護劑:腐植酸(烏海市全圣化工有限責任公司)、熒光素鈉(天津市光復精細化工研究所)、糊精(天津市光復精細化工研究所)、抗壞血酸(天津市光復精細化工研究所)、海藻酸鈉(分析純)(山東昊洋海藻工業(yè)有限公司)。

1.2試驗方法

1.2.1載體篩選方法

以5%(W/V)的比例將6種供試載體加入PDA培養(yǎng)基中混勻,滅菌后制成平板。取0.1 mL孢子濃度為103個/mL的頂孢霉孢子懸浮液,涂布在含不同載體的各平板上。以不含載體的PDA平板為對照,每處理設置3個重復,置于恒溫培養(yǎng)箱中,(25±1) ℃下培養(yǎng)3 d。觀察記錄各平板長出的頂孢霉形成的菌落數(shù)量,計算1 mL孢子懸浮液形成菌落數(shù)(cfu/mL)。

按上述方法制備含各種載體的平板。在培養(yǎng)5 d的菌落邊緣生長旺盛的部分,用打孔器(d=5 mm)打取菌塊,接種到含各載體的培養(yǎng)基上,每處理設置3個重復,置于恒溫培養(yǎng)箱中,(25±1) ℃下培養(yǎng)5 d后,測出菌落直徑,計算菌落直徑日增長量:

分別取1 g孢子粉與5 g不同載體粉末混勻,置于棕色試劑瓶內,封口后常溫貯存,分別于15、30和120 d后取0.5 g混合物加入50 mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液(PDB)中。在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中,(25±1) ℃下振蕩培養(yǎng)24 h,抽樣鏡檢孢子萌發(fā)率。

1.2.2分散劑篩選方法

將供試分散劑按 125、250、500和1 000 μg/mL 4種濃度的比例與融化的PDA培養(yǎng)基混合,滅菌后制成平板。取0.1 mL孢子濃度為103個/mL 的頂孢霉孢子懸浮液,涂布在含不同分散劑的各平板上。以不含分散劑的 PDA 平板為對照。每處理設置3個重復,置于恒溫培養(yǎng)箱中,(25±1)℃下培養(yǎng)3 d。觀察各平板形成的菌落數(shù)量,計算1 mL孢子懸浮液形成菌落數(shù)(cfu/mL)。菌落直徑增長量的試驗方法同1.2.1。

1.2.3黏著劑的篩選

5種黏著劑對頂孢霉菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響測定方法同1.2.1。

分別取孢子粉2 g與0.1 g不同載體粉末混勻,置于棕色試劑瓶內,封口后常溫貯存,分別于15、30和120 d后取0.2 g混合物加入20 mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液(PDB)中。在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中,(25±1) ℃下振蕩培養(yǎng)24 h,抽樣鏡檢孢子萌發(fā)率。

1.2.4紫外保護劑篩選

取活化培養(yǎng)7 d的新鮮菌株,向培養(yǎng)皿中加入10 mL無菌水洗脫孢子,在顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)并計算孢子含量,配制成濃度為104個/mL的孢子懸浮液,然后將各種供試紫外保護劑按0.3%的比例加入孢子懸浮液中,混合均勻。用移液器吸取0.1 mL上述孢子懸浮液于無菌蓋玻片上,涂抹均勻。然后,將各蓋玻片置于紫外燈(功率30 W,光強120 lx)下照射1 min后,將玻片平放在培養(yǎng)皿底部,皿中用濕潤的濾紙保濕。將培養(yǎng)皿放在25 ℃下黑暗培養(yǎng),以免孢子光復活。24 h后,在顯微鏡下抽樣計數(shù)萌發(fā)孢子數(shù)并計算出萌發(fā)率。以不加紫外保護劑的頂孢霉孢子懸浮液作照射和不照射的對照處理。

1.2.520%頂孢霉Ahy1菌株微粉劑加工及質量檢查方法

按照孢子粉含量20%,分散劑5%,紫外保護劑1%的比例加工頂孢霉微粉劑,并對其質量指標進行檢測。真菌孢子微粉劑的質量檢測主要包含以下指標:含孢量、干燥減量、活孢率、細度和貯存穩(wěn)定性。

含孢量檢測[8]:用萬分之一天平稱取1 g產品加入100 mL蒸餾水中混勻,用血球計數(shù)板計數(shù)孢子懸浮液濃度c,計算制劑孢子含量。

制劑孢子含量(個/g)=c×100;

干燥減量檢測[8]:用萬分之一天平稱取10 g產品,置于恒溫鼓風干燥箱中,120 ℃下干燥2 h后迅速稱其重量W,計算干燥減量。

活孢率檢測[9]:取少許混合物加入3 mL的營養(yǎng)液中,振蕩均勻。加入孢子的濃度以400倍顯微鏡下,血球計數(shù)板每小格4～8個孢子為宜。將菌懸液涂成玻片,(25±1) ℃下培養(yǎng)24 h后,觀察計數(shù)孢子的萌發(fā)率。取不同位置的5個視野,分別觀察萌發(fā)孢子數(shù)與孢子總數(shù),計算萌發(fā)率。

微粉細度檢測[8]:容積比重測定方法。選取已知容積的塑料瓶,把干燥的測試粉劑樣品從光滑的紙上滑入塑料筒中直至藥粉溢出筒口,注意藥粉不可急速沖入塑料筒中。靜置約半分鐘,用一把直尺貼近筒口,小心地從筒口平推,把多余的藥粉刮去,使筒口的藥粉成為平面狀態(tài)。把筒內的藥粉仔細倒出,稱出粉劑的質量(g),計算出單位體積的粉劑質量,即得容積比重(g/cm3)。

貯存穩(wěn)定性檢測:5 ℃貯存180 d,每隔15 d檢查活孢率?；铈呗蕶z測方法同上。

1.2.6生物活性測定

生物活性的測定采用噴粉法。將田間采集的甘藍蚜(Brevicorynebrassicae)轉至室內盆栽的甘藍苗上飼養(yǎng),定殖后選擇齡期一致的無翅成蚜,移入鋪有甘藍葉片的培養(yǎng)皿(直徑150 mm,底部用海綿和濾紙保濕)中,用浸漬十字花科營養(yǎng)液的消毒棉球包裹葉柄。使用小型塑料噴粉瓶在培養(yǎng)皿上均勻噴粉。每皿30頭試蟲,重復3次,并設不噴粉的對照。

將噴粉處理的培養(yǎng)皿和對照置于光照培養(yǎng)箱(25 ℃,RH=80%,L∥D=12 h∥12 h)中,自第3天起每天觀察一次,記錄試蟲死亡、存活數(shù)目及蟲體感病癥狀。每次檢查時將蟲尸移出培養(yǎng)皿,根據(jù)蟲尸表面是否有供試菌長出物而確定感染致死情況,計算死亡率和校正死亡率。

2　結果與分析

2.1載體的選擇

高嶺土、硅藻土、碳酸鈣、膨潤土、白炭黑和滑石粉6種載體對頂孢霉菌株Ahy1菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響測定結果見表1和圖1。6種供試載體對頂孢霉菌株Ahy1菌落直徑日增長量的影響與對照相比差異顯著,碳酸鈣、硅藻土和白炭黑與頂孢霉混合后,頂孢霉平均菌落直徑日增長量分別為13.58、13.41和13.00 mm,優(yōu)于高嶺土、膨潤土和滑石粉;6種供試載體對菌落形成單位數(shù)的影響與對照相比差異顯著,硅藻土、碳酸鈣和膨潤土與Ahy1混合后平均菌落形成單位數(shù)分別為716.37、700.82和696.77 cfu/mL,顯著優(yōu)于高嶺土、白炭黑和滑石粉。6種載體與Ahy1孢子粉混合對其孢子萌發(fā)率的影響見圖1。儲存120 d后對孢子萌發(fā)率影響最小的載體是硅藻土和碳酸鈣。由于碳酸鈣的分子量(100.09)和密度(0.5 g/cm3)均大于硅藻土(分子量60.08,密度0.28 g/cm3),所以選擇粒徑更細、懸浮性能強的硅藻土作為Ahy1微粉劑的載體。

2.2分散劑的選擇

木質素磺酸鈣、木質素磺酸鈉、辛基酚聚氧乙烯醚磺酸鈉、聚萘磺酸鈉、二丁基萘磺酸鈉、月桂酸鈉6種分散劑對Ahy1菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響見圖2、圖3。木質素磺酸鈉和木質素磺酸鈣在低濃度時對Ahy1菌絲生長和孢子萌發(fā)均無明顯影響,但在高濃度時對Ahy1菌落直徑日增長量和孢子萌發(fā)有輕微的抑制作用;其他4種分散劑在低濃度和高濃度時均影響較大。因此選用木質素磺酸鈉或木質素磺酸鈣作為Ahy1微粉劑的分散劑。

表1　6種載體對Ahy1菌絲體生長的影響1)Table 1　Effects of six carriers on Ahy1 mycelial growth

1) 同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。下同。
Data followed by different lowercase letters in the same column are significantly different at the 0.05 level by Duncan’s test. The same below.

圖1　6種載體對頂孢霉Ahy1孢子萌發(fā)的影響Fig.1　Effects of six carriers on Ahy1 conidial germination

圖2　6種分散劑對頂孢霉Ahy1菌絲生長的影響Fig.2　Effects of six dispersing agents on Ahy1 mycelial growth

2.3黏著劑的選擇

淀粉、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、羧甲基纖維素、硅酸鈉5種黏著劑對頂孢霉菌株Ahy1菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響測定結果見表2和圖4。羧甲基纖維素和淀粉對Ahy1菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響均不顯著,處理后Ahy1平均菌落日增長量分別是13.74和13.23 mm,平均形成菌落數(shù)分別是674.91和666.78 cfu/mL;5種分散劑與Ahy1孢子粉混合儲存120 d后對孢子萌發(fā)率影響最小的是羧甲基纖維素(見圖4)。結果表明:羧甲基纖維素可作為Ahy1微粉劑的黏著劑。

圖3　6種分散劑對頂孢霉Ahy1孢子萌發(fā)的影響Fig.3　Effects of six dispersing agents on Ahy1 conidial germination

黏著劑Agglutinant菌落直徑日增長量/mmDailyincrementofcolonydiameter平均菌落數(shù)/cfu·mL-1AveragenumberofcoloniesCK14.23a687.29a羧甲基纖維素CarboxymethylCellulose13.74a674.91a淀粉Amylum13.23a666.78a聚乙酸乙烯酯Polyvinylacetate10.58b620.75b硅酸鈉Sodiumsilicate9.67bc583.14b聚乙烯醇Polyvinylalcohol7.41c406.43c

圖4　5種黏著劑對頂孢霉Ahy1孢子萌發(fā)的影響Fig.4　Effects of five agglutinants on Ahy1 conidial germination

2.4紫外保護劑的選擇

腐植酸、熒光素鈉、糊精、抗壞血酸、海藻酸鈉5種紫外保護劑對頂孢霉菌株Ahy1孢子萌發(fā)的影響結果見表3。在紫外燈(功率30 W,光強120 lx)下照射40 s后,5種紫外保護劑處理的Ahy1孢子萌發(fā)率與對照差異顯著。其中腐植酸和熒光素鈉處理后,Ahy1孢子萌發(fā)率分別為77.67%和75.67%; 其余3種紫外保護劑處理Ahy1孢子萌發(fā)率較低,均在30%以下。結果表明紫外保護劑可選擇腐植酸和熒光素鈉。

表3　5種紫外保護劑對Ahy1孢子萌發(fā)率的影響Table 3　Effect of five UV protectants on Ahy1 conidial germination rate

2.520%頂孢霉微粉劑加工與質量檢測

2.5.198億孢子/g頂孢霉微粉劑配方與加工

以木質素磺酸鈉或木質素磺酸鈣作分散劑、羧甲基纖維素作黏著劑、熒光素鈉作紫外保護劑和孢子粉按照以下比例混合:孢子粉20%,分散劑5%,黏著劑1%,紫外保護劑1%,添加硅藻土填料至100%,用超細粉碎機將各成分混勻,制成98億孢子/g頂孢霉Ahy1菌株微粉劑(中試產品)。

2.5.298億孢子/g頂孢霉微粉劑的質量檢測

通過98億孢子/g頂孢霉Ahy1微粉劑加工獲得的中試產品,質量檢測結果為:孢子含量9.8×109個孢子/g,干燥減量4.36%,孢子萌發(fā)率90.23%,容積比重0.37 g/cm3,顆粒細度為過200目篩,粉粒直徑約74 μm,5 ℃下貯藏6個月后孢子萌發(fā)率80%(圖5),20%頂孢霉Ahy1微粉劑中試產品基本符合同類粉劑的國家標準(標準號GB/T25864-2010)[10]。

圖5　貯存時間對頂孢霉Ahy1微粉劑孢子萌發(fā)的影響(5 ℃)Fig.5　Effects of storage time on conidial germination of Ahy1 microgranule(5 ℃)

2.698億孢子/g頂孢霉微粉劑生物活性測定結果

通過對98億孢子/g頂孢霉Ahy1微粉劑進行生物活性測定,結果表明在第8天時死亡率達到60%(圖6)。

圖6　98億孢子/g頂孢霉Ahy1微粉劑對甘藍蚜 生物活性測定結果Fig.6　Bioassay results of 9.8×109 conidia/g Ahy1 conidial microgranule to Brevicoryne brassicae

3　結論與討論

載體是微粉劑中的主要成分,對粉劑的質量起著至關重要的作用。特別是對微生物制劑來說,孢子是有效成分,載體的優(yōu)劣決定著孢子的成活率和貯存時間。試驗結果表明,碳酸鈣和硅藻土是兩種對Ahy1菌株菌落生長量和菌落形成數(shù)影響均較小的載體。但從2種載體本身性質及所要研究的劑型特點考慮,硅藻土是較為理想的頂孢霉微粉劑載體。

太陽輻射的紫外線能降低孢子的萌發(fā)率,或延緩孢子萌發(fā)[11],因為紫外線有可能造成細胞中DNA分子結構的損傷,特別是胸腺嘧啶二聚體的形成,使DNA復制受阻而導致細胞死亡[12]。對紫外保護劑的篩選結果表明,紫外保護劑效果最好的是腐植酸,其次是熒光素鈉。

20%頂孢霉Ahy1微粉劑加工獲得的中試產品,孢子含量為9.8×109個孢子/g,干燥減量為4.36%,孢子萌發(fā)率為90.23%,顆粒細度為過200目篩,粉粒直徑約為74 μm,5 ℃下貯藏6個月后孢子萌發(fā)率為80%。與球孢白僵菌粉劑國家標準(標準號GB/T25864-2010,含孢量(100土10)億孢子/g,孢子萌發(fā)率≥90%,干燥減量≤10%,在5 ℃條件下貯存180 d,孢子萌發(fā)率大于80%,細度為高孢粉全部通過160目篩,低孢粉全部通過35目篩)比較,20%頂孢霉Ahy1微粉劑中試產品基本符合低孢粉標準,在顆粒細度上符合微粉劑的要求。

在測定過程中,由于每次檢查時將蟲尸移出培養(yǎng)皿,減少了繼續(xù)侵染的機會,導致第8 天以后試蟲死亡率不再繼續(xù)增大。而在田間應用中,由于菌絲體產生的分生孢子能夠再次侵染害蟲,所以持效期更長。

微生物農藥的劑型加工和貯存穩(wěn)定性一直是制約其發(fā)展和應用的重要因素之一[13]。粉劑是微生物農藥應用較早的一種劑型，例如白僵菌粉劑用于森林蟲害的防治。由于設施農業(yè)推廣和溫室經濟作物的種植面積逐漸擴大,設施大棚病蟲害發(fā)生呈上升趨勢,鑒于溫室大棚的小氣候特別適合微粉劑的微生物殺蟲劑,借助于高溫高濕,真菌孢子可黏著在蟲體上,完成入侵和致病過程,從而達到防治為害設施蔬菜害蟲的效果，因此研究頂孢霉微粉劑新劑型,對于頂孢霉菌株在設施經濟作物蚜蟲等重要害蟲的綠色防控具有重要意義。但是微粉劑的穩(wěn)定性和田間防效還需進一步試驗研究。

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(責任編輯：田喆)

Screening for the formula of microgranule ofAcremoniumhansfordiiconidia

Hao Yu,Yang Shunyi,Shen Huimin,Zhang Xinhu,Chen E

(Pratacultural College of Gansu Agricultural University, Key Laboratory of Grassland Ecosystem Education Ministry; The Sino-US Centers for Grazingland Ecosystem Sustainability, Lanzhou730070, China)

Through biological assays in the laboratory, additive agents and formulation for micropowder ofAcremoniumhansfordiiconidia were selected from six carriers, six dispersing agents, five agglutinants and five ultraviolet protectors. The results indicated that the diatomite (carrier), sodium fluorescein and humic acids (UV protectant), sodium lignosulfonate or calcium lignosulfonate (dispersing agent) and carboxymethyl cellulose(agglutinant) had little effect onA.hansfordiiconidia. The quality indicators were as followed: 20% microgranule ofA.hansfordiiconidia, conidia number of 9.8×109conidia/g, loss from drying by 4.36%, conidial germination rate of 90.23%, bulk density of 0.37 g/cm3,granule fineness of passing through a 200 mesh sieve, granule of about 74 μm in diameter, conidial germination rate of 80% after stored for 6 months at 5 ℃. These quality indicators are in line with national standards for the micropowders of fungal insecticide standard No. GB/T25864-2010), and the granule fineness is in line with microgranule.

Acremoniumhansfordii;conidial powder;powder;carrier;dispersing agent;agglutinant;ultraviolet protector

2015-01-26

2015-02-27

甘肅省科技支撐計劃項目(1204NKCA073)

E-mail:ndzxh@gsau.edu.cn

S 482.39

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.02.015