河南甜櫻桃病毒病害調(diào)查及病原檢測

劉聰利,　李　明,　趙改榮,　李玉紅

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所,鄭州 450009)

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河南甜櫻桃病毒病害調(diào)查及病原檢測

劉聰利,李明*,趙改榮,李玉紅

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所,鄭州 450009)

在河南省鄭州市、鞏義市、滎陽市、新鄭市選擇具有代表性的甜櫻桃生產(chǎn)園對(duì)病毒病發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查,采集表現(xiàn)為疑似病毒病癥狀的樣本65份,利用7種病毒引物進(jìn)行RT-PCR檢測。5種病毒檢測結(jié)果呈陽性,分別是李屬壞死環(huán)斑病毒(Prunusnecroticringspotvirus, PNRSV)、李矮縮病毒(Prunedwarfvirus, PDV)、櫻桃綠環(huán)斑駁病毒(Cherrygreenringmottlevirus, CGRMV)、櫻桃壞死銹斑病毒(Cherrynecroticrustymottlevirus, CNRMV)及櫻桃病毒A(CherryvirusA, CVA);序列分析結(jié)果表明,5種病毒擴(kuò)增片段與GenBank中注冊(cè)的相應(yīng)病毒核苷酸序列均具有較高的一致性;樣本病毒檢出率為100%,其中13份樣本為單獨(dú)侵染,其余52份樣本均為多病毒復(fù)合侵染,占比高達(dá)80%,復(fù)合侵染比例隨著侵染病毒種類的增多逐漸降低;病毒侵染組合與葉片表型癥狀無明顯對(duì)應(yīng)關(guān)系。

甜櫻桃;病毒病;病原檢測;復(fù)合侵染

甜櫻桃種植業(yè)歷來享有“黃金種植業(yè)”的美譽(yù),近年來甜櫻桃栽培面積和總產(chǎn)量均穩(wěn)定增長。截至2013年,我國甜櫻桃栽培面積已達(dá)13.48萬hm2,較2001年增加了近10倍[1]。隨著甜櫻桃栽培規(guī)模不斷擴(kuò)大,其病毒病的危害在生產(chǎn)中亦逐年顯現(xiàn),已逐步成為影響甜櫻桃產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一。

目前已知侵染甜櫻桃的病毒約34種,較常見的有20種[2]。王文文等[3]、盧美光等[4]先后對(duì)環(huán)渤海灣地區(qū)和北京的櫻桃病毒病發(fā)生情況進(jìn)行了調(diào)查和鑒定,初步明確了我國甜櫻桃主產(chǎn)區(qū)病毒病病原主要有:李屬壞死環(huán)斑病毒(Prunusnecroticringspotvirus, PNRSV)、李矮縮病毒(Prunedwarfvirus, PDV)、櫻桃綠環(huán)斑駁病毒(Cherrygreenringmottlevirus, CGRMV)、櫻桃壞死銹斑病毒(Cherrynecroticrustymottlevirus, CNRMV)、櫻桃病毒A(CherryvirusA,CVA)、蘋果褪綠葉病毒(Applechloroticleafspotvirus,ACLSV)及櫻桃小果病毒(Littlecherryvirus,LChV)。宗曉娟等[5]建立和完善了幾種主要病毒的單重RT-PCR、多重RT-PCR、納米磁珠技術(shù)結(jié)合多重RT-PCR的檢測方法,為高效、準(zhǔn)確檢測甜櫻桃病毒病病原提供了技術(shù)保證。盡管目前侵染甜櫻桃的病毒種類已初步明確,其相關(guān)病毒檢測技術(shù)也逐步健全,但關(guān)于我國甜櫻桃病毒病的危害特點(diǎn)尚未有系統(tǒng)報(bào)道,尤其是侵染甜櫻桃的病毒中,單獨(dú)侵染或多病毒復(fù)合侵染的比例,以及多病毒復(fù)合侵染的類型尚不明晰。本研究利用單重RT-PCR技術(shù),對(duì)來源于河南、遼寧、山東、陜西等地的甜櫻桃生產(chǎn)園中表現(xiàn)疑似病毒病癥狀的苗木樣本進(jìn)行病原檢測,以期為明確我國甜櫻桃病毒病的危害特點(diǎn),為甜櫻桃病毒病診斷和病原檢測提供數(shù)據(jù)支持。

1　材料與方法

1.1材料

于2013年4月-6月,在河南省鄭州市、鞏義市、滎陽市、新鄭市選擇具有代表性的甜櫻桃生產(chǎn)園進(jìn)行病毒病害分布調(diào)查并采集樣本。采樣果園為成齡園或老齡園,所選苗木分別來源于河南、陜西、大連、山東等地。共采集表現(xiàn)疑似病毒病癥狀的樣本65份,每株樹作為1份樣本,每份樣本采集病葉5片,記錄癥狀并拍照保存。隨后將樣本密封(塑料自封袋),編號(hào)后放入液氮罐,帶回實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2總RNA提取和cDNA第一鏈的合成

采用生物工程(上海)股份有限公司的柱式植物總RNA提取純化試劑盒提取總RNA,用紫外分光光度計(jì)檢測RNA濃度,瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。采用Fermentas公司的First Strand cDNA Systhesis Kit反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈。取上述RNA 5 μg,0.2 μg/μL隨機(jī)引物1 μL,加適量ddH2O 至12 μL,70℃溫浴5 min后置于冰上冷卻,依次加入20 U/μL RNA酶抑制劑1 μL、10 mmol/L dNTPs 2 μL、5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μL,25℃溫浴5 min,加入200 U/μL反轉(zhuǎn)錄酶1 μL,42℃溫浴1 h,70℃ 10 min,終止反應(yīng)后離心,-20℃保存,即為cDNA模板,稀釋8倍后用于PCR擴(kuò)增。

1.3PCR擴(kuò)增和目的片段克隆

選用國內(nèi)外已報(bào)道的李屬壞死環(huán)斑病毒(PNRSV)、李矮縮病毒(PDV)、蘋果褪綠葉斑病毒(ACLSV)、櫻桃壞死銹斑病毒(CNRMV)、櫻桃病毒A (CVA)、櫻桃綠環(huán)斑駁病毒(CGRMV)、櫻桃小果病毒2(LChV2)特異引物[6-9](表1)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。從65個(gè)樣本中優(yōu)先挑選5個(gè)病毒危害癥狀較為嚴(yán)重的樣本進(jìn)行檢測。

表1　7種病毒RT-PCR檢測特異性引物

0.2 mL PCR管中依次加入cDNA 1 μL,dNTPs(10 mmol/L)0.4 μL,10×PCR buffer (含Mg2+) 2 μL,Pfu DNA聚合酶(5U/μL)0.2 μL,上游和下游引物(10 μmol/L) 各1 μL,加dd H2O補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性4 min;95℃ 45 s,63℃ 45 s,72℃ 1 min,35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色,DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)指示病毒特異性擴(kuò)增片段,紫外燈下觀察電泳結(jié)果并照相記錄。

電泳結(jié)束后在紫外透射儀上分別切下相應(yīng)條帶,采用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化。將純化后的PCR產(chǎn)物連接到pGEM-Easy載體上,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)菌落PCR篩選陽性克隆,提取質(zhì)粒,選取2～3個(gè)陽性克隆送公司測序,所得到的序列與GenBank中注冊(cè)的序列進(jìn)行比對(duì)。以經(jīng)過上述過程驗(yàn)證的包含病毒目標(biāo)片段的重組質(zhì)粒作為RT-PCR檢測的陽性對(duì)照, ddH2O作為陰性對(duì)照,對(duì)其余樣本進(jìn)行RT-PCR檢測。

2　結(jié)果與分析

2.1甜櫻桃病毒病的危害調(diào)查

對(duì)4個(gè)甜櫻桃生產(chǎn)園中的病毒病癥狀進(jìn)行觀察,結(jié)果表明,各果園均有表現(xiàn)病毒病癥狀的植株,主要癥狀為葉片皺縮、黃化花葉、壞死環(huán)斑、濃綠細(xì)長、畸形、邊緣缺損、葉背耳突、植株矮縮等(圖1)。其中早熟品種‘紅燈’最為敏感,感染嚴(yán)重的植株只開花不結(jié)果。調(diào)查發(fā)現(xiàn),大部分感病植株只是部分葉片表現(xiàn)癥狀,其開花結(jié)果沒有受到嚴(yán)重影響。

圖1　甜櫻桃病毒病樹的癥狀表現(xiàn)Fig.1　Symptoms of virus disease in sweet cherry

2.2甜櫻桃病毒病原RT-PCR檢測結(jié)果分析

利用7種病毒的特異性引物對(duì)65份樣本進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,將檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì),結(jié)果如圖2所示,7種待檢病毒中5種病毒檢測結(jié)果呈陽性,其檢出率分別為PNRSV 46.2%、PDV 60%、CGRMV 43.1%、CVA 73.8%、CNRMV 27.7%。

本研究所選樣本皆為生產(chǎn)園中樹齡較大、葉片表現(xiàn)明顯病毒癥狀的樣本,樣本病毒檢出率為100%,其中，單一病毒侵染的有13份樣本,其余52份樣本均為多病毒復(fù)合感染,占比為80%。多病毒復(fù)合侵染中,PDV和CVA復(fù)合侵染比例最高,達(dá)21.2%;復(fù)合侵染病毒種類為2、3、4、5種不等,侵染比例分別為42.3%、30.8%、23.1%、3.8%,隨著復(fù)合侵染病毒種類的增多而降低(表2)。病毒侵染組合與葉片癥狀表型無明顯對(duì)應(yīng)關(guān)系,如葉片表現(xiàn)壞死環(huán)斑癥狀的植株,感染病毒組合類型包括PNRSV、CNRMV、CVA 3種病毒或PNRSV、PDV、CNRMV、CVA 4種病毒;而同樣感染PNRSV、PDV、CVA 3種病毒的植株則呈現(xiàn)葉片細(xì)長、濃綠或葉片褪綠斑駁的表型。

圖2　5種甜櫻桃病毒的發(fā)生情況統(tǒng)計(jì)圖Fig.2　Statistical graph of the occurrence condition of five viruses infected sweet cherry

復(fù)合侵染病毒數(shù)量/種Co-infectionnumbers病毒名稱VirusPNRSVPDVCGRMVCNRMVCVA復(fù)合侵染Mixedinfection樣本數(shù)量/株Numberofsweetcherrytrees比例/%Percentage-+--+1121.2---++23.82+---+47.7--++-47.7++---11.9++--+713.5+--++11.93-++-+59.6+-+-+11.9--+++23.8+-+++23.84++-++35.8+++-+713.55+++++23.8

1) “+”表示檢測到相應(yīng)病毒; “-”表示未檢測到相應(yīng)病毒; “比例”=每種復(fù)合侵染類型的樣本數(shù)量/52。

“+”indicates the corresponding virus that has been detected； “-” indicates that no virus was detected； “Percentage”=The number of sweet cherry trees for each co-infection/52.

2.3甜櫻桃病毒RT-PCR擴(kuò)增片段序列分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證檢測的準(zhǔn)確性,將上述5種病毒的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測序,獲得序列與GenBank中各病毒基因組序列相應(yīng)區(qū)段比對(duì),結(jié)果表明:PNRSV、PDV、CGRMV、CVA和CNRMV與已知序列相似性較高,為78%～99%。

3　討論

在長期的無性繁殖過程中,甜櫻桃苗木感染并積累了多種病毒或類病毒[9-10],一旦被病毒侵染,樹體終身帶毒,致使樹勢減弱,產(chǎn)量降低,果實(shí)品質(zhì)下降,甚至整株死亡。統(tǒng)計(jì)資料顯示,1992-2007年地中海地區(qū)24 000株核果類果樹的病毒病發(fā)病率高達(dá)23.5%,其中櫻桃感病率最高,達(dá)45.6%,其復(fù)合侵染比例則高達(dá)76.4%[11]。王文文等[12]通過對(duì)表現(xiàn)皺葉病的甜櫻桃品種‘紅燈’樹體內(nèi)的病毒檢測后,發(fā)現(xiàn)多病毒復(fù)合侵染比例較高。本研究中,對(duì)表現(xiàn)疑似病毒病癥狀的65份樣本的病原檢測結(jié)果顯示,樣本病毒檢出率為100%,5種病毒檢測結(jié)果呈陽性,分別為PNRSV、PDV、CGRMV、CVA、CNRMV,多病毒復(fù)合侵染比例高達(dá)80%,與地中海地區(qū)櫻桃病毒復(fù)合侵染比例76.4%差別不大[11]。復(fù)合侵染病毒種類為2、3、4、5種不等,侵染比例隨復(fù)合侵染病毒種類增多而降低。甜櫻桃病毒侵染組合與葉片癥狀表型無明顯對(duì)應(yīng)關(guān)系,這一結(jié)論與王文文等[12]對(duì)表現(xiàn)皺葉病的‘紅燈’樹體內(nèi)病毒檢測結(jié)果一致。

目前我國櫻桃病毒病發(fā)生較為普遍,且復(fù)合侵染比例較高,雖然研究中涉及的樣品數(shù)量及分布地點(diǎn)有限,但這些數(shù)據(jù)基本反映了我國櫻桃病毒病的發(fā)生特點(diǎn),可為后續(xù)調(diào)查提供數(shù)據(jù)支持。由于甜櫻桃復(fù)合侵染病毒組合與葉片癥狀表型無明顯對(duì)應(yīng)關(guān)系,因此建立高效準(zhǔn)確的檢測方法,明確侵染甜櫻桃的病毒種類,才能有針對(duì)性地控制病毒的傳播。而選育抗病性強(qiáng)的優(yōu)良品種、建立無病毒苗木繁育體系,是保證甜櫻桃產(chǎn)量和提高品質(zhì)的基本措施。

[1]黃貞光, 劉聰利, 李明, 等. 近20年國內(nèi)外甜櫻桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展動(dòng)態(tài)及對(duì)未來的預(yù)測[J].果樹學(xué)報(bào), 2014, 31(S1):1-6.

[2]董薇, 宋雅坤, 吳明勤, 等. 大櫻桃病毒病研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2005, 21(5): 332-336.

[3]王文文,宗曉娟,王甲威,等.環(huán)渤海灣地區(qū)甜櫻桃小果病毒及櫻桃病毒A的鑒定與調(diào)查[J].植物保護(hù),2013,39(2):128-133.

[4]盧美光,吳冰, 高蕊, 等. 我國部分地區(qū)櫻桃病毒病害初步調(diào)查和病原檢測[J].植物保護(hù), 2015, 41(1):98-103.

[5]宗曉娟,王文文,王甲威, 等. 甜櫻桃病毒病分子檢測技術(shù)的研究[J].果樹學(xué)報(bào), 2014, 31(S1):164-168.

[6]侯義龍,張開春,楊俊玲.應(yīng)用RT-PCR方法檢測桃和櫻桃及其組培苗上的PNRSV和PDV[J].果樹學(xué)報(bào),2005,22(3):292-293.

[7]宗曉娟,王文文,魏海蓉,等.3種甜櫻桃病毒PNRSV、PDV及LChV-2的多重RT-PCR檢測方法的建立與應(yīng)用[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,47(6):1111-1118.

[8]Li Ruhui, Mock R. An improved reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay for the detection of two cherry flexiviruses inPrunusspp. [J]. Journal of Virological Methods, 2005, 129(2): 162-169.

[9]Osman F, Al Rwahnih M, Golino D, et al. Evaluation of the phytosanitary status of thePrunusspecies in the national clonal germplasm repository in California: Survey of viruses and viroids [J].Journal of Plant Pathology, 2012, 94(1): 249-253.

[10]Kaponi M, Luigi M, Kyriakopoulou P E. Mixed infections of pome and stone fruit viroids in cultivated and wild trees in Greece [J].New Disease Reports, 2012, 26(8): 8.

[11]Pallas V, Aparicio F, Herranz M C, et al. Ilarviruses ofPrunusspp: A continued concern for fruit trees [J].Phytopathology, 2012, 102(12):1108-1120.

[12]王文文, 宗曉娟, 魏海蓉, 等. 不同砧木甜櫻桃品種‘紅燈’皺葉病樹體內(nèi)的病毒檢測[J].果樹學(xué)報(bào), 2014, 31(S1):159-163.

(責(zé)任編輯：楊明麗)

Investigation and pathogen detection of sweet cherry virus disease in Henan

Liu Congli,Li Ming,Zhao Gairong,Li Yuhong

(Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou450009, China)

Several representative sweet cherry orchards were selected to investigate the occurrence condition of virus disease in Zhengzhou, Gongyi, Xingyang and Xinzheng cities of Henan Province, from which sixty-five samples with suspected virus symptoms were collected. Seven pairs of specific primers were used to detect viruses infected sweet cherry by RT-PCR. RT-PCR results and sequence analysis showed that five viruses were found positive, includingPrunusnecroticringspotvirus(PNRSV),Prunedwarfvirus(PDV),Cherrygreenringmottlevirus(CGRMV),Cherrynecroticrustymottlevirus(CNRMV),CherryvirusA (CVA). The amplified fragments had high identity with the corresponding nucleotide sequence reported in GenBank. The positive rate of viruses was 100%, among all 65 samples tested, 13 were of single infection, and the rest 52 samples were of mixed infection which account for more than 80%.The proportion of mixed infection gradually decreased along with ascending of the virus types. No significantly comparable relations were found between types of mixed infection and virus disease symptoms.

sweet cherry;virus disease;pathogen detection;mixed infection

2015-08-24

2015-10-10

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(CAAS-ASTIP-2015-ZFRI)；鄭州市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程(131PZDGC113)

E-mail:limingzhengzhou@hotmail.com

S 436.629

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.04.034