橡膠樹白粉病菌分子檢測技術(shù)的建立

毛宇寧,　梁　鵬,　劉文波,　林春花,　繆衛(wèi)國,　鄭服叢

(海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點實驗室/海南大學環(huán)境與植物保護學院, ?？凇?70228)

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實驗方法與技術(shù)

橡膠樹白粉病菌分子檢測技術(shù)的建立

毛宇寧,梁鵬,劉文波,林春花,繆衛(wèi)國*,鄭服叢*

(海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點實驗室/海南大學環(huán)境與植物保護學院, 海口570228)

根據(jù)橡膠樹白粉菌(OidiumheveaeSteinm.)基因組中的特有保守序列OHS,設計兩對特異性引物OHF1/OHR1和OHF2/OHR2。以不同地區(qū)收集的6份O.heveae(OH1～OH6)和橡膠樹膠孢炭疽病菌(ColletotrichumgloeosporioidesPenz.)等5種非靶標病原菌及健康橡膠樹葉片基因組DNA為模板,建立了橡膠樹白粉菌PCR及nested-PCR分子檢測技術(shù),并驗證了檢測體系的特異性和靈敏度。結(jié)果表明,引物OHF1/OHR1和OHF2/OHR2對橡膠樹白粉菌均具有較高的特異性和靈敏度。其中引物OHF2/OHR2能檢測到10 pg/μL的橡膠樹白粉菌DNA,而以OHF1/OHR1和OHF2/OHR2組合進行nested-PCR,其最低DNA檢測濃度達到0.01 fg/μL。人工接種試驗中,當孢子接種量為2×103個/葉時,PCR和nested-PCR檢測體系可分別在接種4 d和24 h后檢測到目的條帶。表明nested-PCR對在葉片組織中處于潛育期的橡膠樹白粉菌的檢測更有效,可為橡膠樹白粉菌的檢測提供一種簡便而準確的檢測方法。

橡膠樹白粉病菌;潛育期;分子檢測

橡膠樹白粉病是由專性寄生的橡膠樹粉孢屬真菌OidiumheveaeSteinm.引起的氣傳性病害[1]。該病在適宜條件下具有發(fā)病快、危害重的特點。病菌主要危害橡膠樹的嫩葉、嫩芽、嫩梢和花序。嚴重感病的葉片會出現(xiàn)畸形、皺縮、變黃甚至脫落[2-3]。早春時病菌還可能造成第二次落葉,使干膠產(chǎn)量明顯減少,帶來重大的經(jīng)濟損失[4]。橡膠樹白粉菌的潛育期一般為5 d左右,期間病原菌已侵入橡膠樹組織但大多數(shù)處于潛伏狀態(tài),因而植株不表現(xiàn)癥狀,這直接影響到對病害的準確估計和預測[5-9]。

目前,橡膠樹白粉菌的鑒定主要是依據(jù)其引起癥狀、病菌形態(tài)和生理生化反應來完成[10-11]。在發(fā)病前或初期快速、準確地對病菌進行檢測,對及時采取有效的防治措施,控制病害在膠林的擴散、減少經(jīng)濟損失具有十分重要的意義。關(guān)于橡膠樹白粉病菌的分子檢測技術(shù)報道甚少,根據(jù)真菌通用引物ITSl/ITS4可擴增出ITSI和ITS2及5.8S rDNA全序列[12],但不能通過擴增結(jié)果將橡膠樹白粉菌與其他參比菌及健康橡膠樹區(qū)分開,需經(jīng)過進一步測序比對才能確定。

本研究團隊前期完成了橡膠樹白粉病菌全基因組測序,經(jīng)比對分析找到一條橡膠樹白粉菌特有的特異性保守序列OHS(專利申請?zhí)枺?01510577343.9)。本文根據(jù)該序列設計特異引物,建立橡膠樹白粉菌PCR及nested-PCR分子檢測技術(shù),旨在開發(fā)出針對橡膠樹葉片組織中處于潛育狀態(tài)白粉病菌的分子檢測技術(shù),為該病害的早期診斷、防治方案的制訂提供科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1供試菌株、植物材料和試劑

橡膠樹白粉菌(OidiumheveaeSteinm.)OH1～OH6分別從海南大學環(huán)境與植物保護學院分子植物病理學實驗室、海南西聯(lián)農(nóng)場、海南紅光膠林、海南邦溪膠林、海南大豐農(nóng)場、海南保顯農(nóng)場膠林的感病葉片上收集。橡膠樹膠孢炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、橡膠樹棒孢霉落葉病菌(Corynesporacassiicola)、橡膠樹莖桿潰瘍病菌(Phytophthoracapsici)、香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.cubense)、芒果露水斑病菌(Cladosporiumcladosporioides)由海南大學環(huán)境與植物保護學院分子植物病理學實驗室提供;健康的橡膠樹苗及葉片(‘熱研7-33-97’)由海南大學環(huán)境與植物保護學院分子植物病理學組培室提供。Omega真菌DNA提取試劑盒、Omega植物DNA提取試劑盒、Omega PCR擴增產(chǎn)物回收純化試劑盒、TaqDNA聚合酶、dNTPs、2 000 bp DNA Ladder Marker購自天根生化科技(北京)有限公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2供試菌株及橡膠樹葉片基因組DNA提取

由于橡膠樹白粉菌不能離體培養(yǎng),故OH1～OH6均需直接從感病橡膠樹葉片上用軟毛刷將白粉菌收集至無菌硫酸紙上,再進行DNA提取。其他供試菌株預先接種于PDA培養(yǎng)基中,于28℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～10 d后提取DNA。各菌株和橡膠樹葉片基因組DNA的提取步驟參照試劑盒說明書。

1.3特異性引物設計與合成

根據(jù)橡膠樹白粉菌保守序列OHS(GenBank登錄號：KP171513.1;專利號：201510577343.9),利用Primer Premier 5.0 設計檢測橡膠樹白粉菌的特異性引物OHF1/OHR1和OHF2/OHR2(表1)。引物由北京華大基因公司合成。OHF1/OHR1的產(chǎn)物長度為666 bp;OHF2/OHR2的產(chǎn)物長度為538 bp。

表1　引物序列

1.4PCR反應體系的優(yōu)化

參考引物理論退火溫度,對OHF1/OHR1、OHF2/OHR2引物退火溫度進行優(yōu)化,溫度梯度設置為52、53、54、55、56、57、58℃。

1.5引物的特異性檢測和序列測定

采用超微量光吸收檢測儀Nano Drop (ND-1000)測量供試菌株基因組及橡膠樹葉片基因組DNA濃度,并稀釋成1 ng/μL。用OHF1/OHR1、OHF2/OHR2分別進行PCR擴增,以滅菌的ddH2O為陰性對照。PCR 反應體系為：10×Taqbuffer 2.5 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2 μL,正向和反向引物 (10 μmol/L) 各2.5 μL,模板DNA 1 μL,2.5 U/μLTaqDNA 聚合酶0.5 μL;ddH2O 補充至25 μL。反應程序：94℃預變性4 min;94℃變性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸1 min, 35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后進行回收、克隆和測序。

1.6常規(guī)PCR靈敏度檢測

以橡膠樹白粉菌OH1為代表,將濃度為1 ng/μL的白粉菌DNA進行10倍梯度稀釋,得到1 ng/μL、100 pg/μL 等9種不同濃度梯度。為減少稀釋時加樣誤差,分別進行3個系列的梯度稀釋,再將相同梯度的稀釋液混合,取1 μL各濃度梯度的基因組DNA,分別用OHF1/OHR1、OHF2/OHR2進行PCR擴增,反應完成后電泳檢測。

1.7Nested-PCR靈敏度檢測

DNA濃度梯度設置同1.6。取1 μL各濃度 DNA,用OHF1/OHR1進行第一輪PCR擴增,取第一輪PCR產(chǎn)物1 μL作為模板用OHF2/OHR2進行第二輪PCR擴增。反應體系、程序及電泳檢測方法同1.5。

1.8用PCR和nested-PCR檢測橡膠樹葉片中白粉病菌

將橡膠樹白粉菌OH1接種于古銅期的橡膠樹葉片, 12 d 后將橡膠樹病葉表面的白粉菌采用軟毛筆刷取法[13]收集至硫酸紙上,隨后轉(zhuǎn)入 2 mL無菌的離心管中配制成孢子懸浮液,利用血球計數(shù)板將孢子濃度調(diào)整為2×104個/mL。將健康橡膠樹組培苗移栽于溫室花盆中,當橡膠樹葉片長至古銅期時,挑選長勢一致的橡膠樹苗(古銅期橡膠樹苗葉片數(shù)大約15～18片),將孢子懸浮液均勻涂抹于葉片上,每片葉的接種量為100 μL,約含2×103個孢子,每盆苗所有古銅期葉片均接種,為1個重復,共3個重復。將接種后的橡膠樹苗置于溫度23℃、L∥D= 16 h∥8 h、濕度為80%的環(huán)境下培養(yǎng)。接種后每隔24 h從橡膠樹苗上取樣1次,當葉片上出現(xiàn)肉眼可見的白色粉層時停止取樣。每次從每株苗上取1片葉,按1.2的方法提取葉片總DNA,取1 μL DNA為模板,分別用PCR和nested-PCR進行檢測,以健康葉片DNA為對照。反應體系和程序同1.5。

2　結(jié)果與分析

2.1擴增體系的優(yōu)化

根據(jù)OHF1/OHR1和OHF2/OHR2的理論退火溫度,設置溫度梯度進行PCR擴增。電泳結(jié)果(圖1～2)表明：引物OHF1/OHR1在57℃時擴增出的條帶很亮;引物OHF2/OHR2在55、56、57、58℃均擴增出明亮條帶。因此,最佳退火溫度確定為57℃,基于操作便利性,將 nested-PCR 的退火溫度也設置為57℃。

2.2引物特異性檢測與序列比對

用OHF1/OHR1和OHF2/OHR2分別對供試菌株及健康橡膠樹葉片基因組DNA(全部稀釋為1 ng/μL)進行PCR擴增。電泳結(jié)果(圖3～4)表明,兩對引物均能從6份橡膠樹白粉菌(OH1～OH6) DNA中擴增出穩(wěn)定均一的條帶,而其他非靶標菌、健康橡膠樹葉片及雙蒸水對照均無任何條帶。將擴增產(chǎn)物進行回收、測序和Blastn同源比對,結(jié)果表明,OHF1/OHR1擴增條帶約666 bp,OHF2/OHR2擴增條帶約538 bp,與預期大小一致,說明OHF1/OHR1和OHF2/OHR2對橡膠樹白粉菌具有較強的特異性,能夠用于區(qū)別橡膠樹白粉菌與非靶標菌。

圖1　不同溫度對引物OHF1/OHR1的影響Fig.1　Effects of temperature on the primers OHF1/OHR1

圖2　不同溫度對引物OHF2/OHR2的影響Fig.2　Effects of temperature on the primers OHF2/OHR2

圖3　引物OHF1/OHR1的特異性檢測Fig.3　Specificity test of primers OHF1/OHR1

圖4　引物OHF2/OHR2的特異性檢測Fig.4　Specificity test of primers OHF2/OHR2

2.3引物的靈敏度檢測

以不同濃度梯度的橡膠樹白粉菌OH1的DNA為模板,分別用引物OHF1/OHR1和OHF2/OHR2進行PCR擴增,電泳結(jié)果(圖5～6)表明： OHF1/OHR1的檢測靈敏度為100 pg/μL,OHF2/OHR2的檢測靈敏度為10 pg/μL。OHF2/OHR2的檢測靈敏度比OHF1/OHR1高10倍。

圖5　OHF1/OHR1的靈敏度檢測Fig.5　Sensitivity test of primers OHF1/OHR1

圖6　OHF2/OHR2的靈敏度檢測Fig.6　Sensitivity test of primers OHF2/OHR2

2.4Nested-PCR的靈敏度檢測

分別以10倍濃度梯度的橡膠樹白粉菌OH1的DNA為模板,用OHF1/OHR1進行第一輪PCR擴增,以第一輪PCR 產(chǎn)物為模板,用OHF2/OHR2進行第二輪PCR擴增。電泳結(jié)果(圖7)表明,nested-PCR可檢測到的橡膠白粉菌DNA的最低濃度為0.01 fg/μL。

圖7　Nested-PCR的靈敏度Fig.7　Sensitivity of nested-PCR

2.5橡膠樹葉片中白粉病菌的分子檢測

以接種后不同時間提取的橡膠樹葉片基因組 DNA為模板,以引物OHF2/OHR2進行PCR檢測,同時以OHF1/OHR1及OHF2/OHR2進行nested-PCR檢測。 結(jié)果(圖8～9)顯示, 利用OHF2/OHR2進行PCR,在接種后第4天方可檢測到目的條帶,而利用nested-PCR可從接種后 24 h的橡膠樹葉片中檢測到目的條帶。所有條帶經(jīng)測序比對證明結(jié)果正確。

圖8　常規(guī)PCR檢測橡膠樹葉片中白粉病菌Fig.8　Conventional PCR amplification of Oidium heveae on rubber tree leaves

圖9　Nested-PCR檢測橡膠樹葉片中白粉病菌Fig.9　Nested-PCR amplification of Oidium heveae on rubber tree leaves

3　討論

PCR技術(shù)因其具有快速、準確、靈敏的特點,已被廣泛應用于病原微生物的檢測鑒定,但當病原菌在植物組織或土壤中的含量非常低時,采用常規(guī)PCR有時很難檢測到目標病原菌。目前廣泛使用的nested-PCR技術(shù)能大幅度地提高病原菌的檢測靈敏度,已廣泛應用于真菌、病毒、寄生蟲等病原微生物的檢測,顯示了較好的應用價值[14-16,17-19]。

本研究設計的OHF1/OHR1、OHF2/OHR2與ITS通用引物相比,對橡膠樹白粉菌具有更高的特異性及更強的靈敏度。以OHF2/OHR2為引物進行常規(guī)PCR,可以檢測到的橡膠樹白粉菌DNA的濃度為10 pg/μL,而用nested-PCR可檢測到的橡膠樹白粉菌DNA的濃度為0.01 fg/μL,是常規(guī)PCR的106倍。采用建立的方法對室內(nèi)人工接種橡膠樹白粉菌進行檢測,常規(guī)PCR在接種后4 d才可檢測到目的條帶,而nested-PCR在接種24 h 后就可檢測到目的條帶。nested-PCR的檢測靈敏度遠遠高于PCR,對在葉片組織中處于潛育期的橡膠樹白粉菌具有很好的檢測效果。

橡膠樹白粉菌的潛育期為5 d左右,陰雨、冷涼氣候有利于橡膠樹白粉菌的暴發(fā)[20],若能提前3～4 d檢測到橡膠樹白粉菌,分析侵染程度,結(jié)合氣象、環(huán)境條件,就能夠?qū)ο鹉z樹白粉病進行早期診斷,采取相應的防治對策,減少由該病害帶來的經(jīng)濟損失。本研究團隊在建立橡膠樹白粉菌預測預報體系過程中,針對不同接種量、不同潛育侵染階段分別取樣測定,分析感病后橡膠樹葉片中的病原菌。用最低孢子接種量2×103個/葉接種時,5 d后在橡膠樹葉片表面形成肉眼可見病斑,7～8 d后白粉病就大面積發(fā)生,采用常規(guī)PCR僅能從接種后4 d的橡膠樹葉片中檢測到白粉菌,而nested-PCR能從接種1 d后的橡膠樹葉片中檢測到潛伏侵染的白粉菌,說明nested-PCR結(jié)合OHF1/OHR1、OHF2/OHR2兩套引物能提前監(jiān)測到病原菌。通過建立的檢測技術(shù),我們已經(jīng)建立了病原菌接種量與病害發(fā)生程度間的關(guān)系(另文發(fā)表)。雖然nested-PCR檢測靈敏度高,但由于其需要做兩輪PCR,并且涉及一些高端儀器設備,不利于田間直觀快速診斷,因此,還需要探討將該方法進一步改進并簡化,以便尋找高效、快速、簡便、特異性強且靈敏度高的分子檢測技術(shù)對處于潛育期的橡膠樹白粉菌進行分子檢測,這對橡膠樹白粉菌的早期診斷、科學防治會具有更大的意義。

[1]李增平, 鄭服叢. 熱區(qū)植物常見病害診斷圖譜[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2009: 160.

[2]余卓桐, 王紹春. 橡膠樹白粉病流行過程和流行結(jié)構(gòu)分析[J]. 熱帶作物學報, 1988, 9(1): 83-89.

[3]范會雄, 譚象生. 橡膠樹白粉病流行規(guī)律與防治技術(shù)[J]. 植物保護, 1997, 23(3): 28-30.

[4]張宇, 王萌, 楊葉, 等. 防治橡膠樹白粉病15%乙嘧酚磺酸酯熱霧劑的研制[J]. 中國熱帶農(nóng)業(yè), 2011(4): 45-47.

[5]Wastie R L, Chee K H, Lim T M. Screening-clones ofHeveaebrasiliensisfor disease resistance-a review [J]. Planter, Kuala Lumpur, 1973, 49(565): 164-169．

[6]Beeley F．Mildew disease ofHevea[J]. Malayan Agricultural Journal, 1930, 18(12): 596-599.

[7]陸大京, 周啟昆, 鄭冠標, 等. 橡膠樹白粉病病原菌生物學研究[J]. 熱帶作物學報, 1982, 3(2): 63-70.

[8]余卓桐, 王紹春, 周春香, 等．橡膠樹白粉病預測模式的研究[J]. 熱帶作物學報, 1985, 6(2): 57-66.

[9]曾士邁. 宏觀植物病理學[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2005: 150.

[10]萬三連, 梁鵬, 劉文波, 等．橡膠樹與Oidiumheveae親和互作組織細胞學研究[J]. 植物保護, 2014, 40(3): 26-36.

[11]張新春, 劉祥民, 王家保. 橡膠白粉病菌與寄主互作的超微結(jié)構(gòu)觀察[J]. 熱帶作物學報, 2010, 31(12): 2250-2254.

[12]劉先寶,高宏華,蔡吉苗,等.橡膠樹白粉病菌rDNA-ITS序列及其系統(tǒng)發(fā)育分析[J].熱帶作物學報,2008,29(2):215-219.

[13]萬三連,梁鵬, 宋風雅, 等. 橡膠樹白粉菌收集及 DNA 和 RNA 提取方法比較[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學, 2013(11): 134-139.

[14]Ippolito A, Schena L, Nigro F. Detection ofPhytophthoranicotianaeandP.citrophthorain citrus roots and soils by nested-PCR [J]. European Journal of Plant Pathology, 2002, 108(9): 855-868.

[15]Mercado-Blanco J, Rodriguez-Jurado D, Pérez-Artés E, et al. Detection of the nondefoliating pathotype ofVerticilliumdahliaein infected olive plants by nested-PCR [J]. Plant Pathology, 2001, 50(5): 609-619.

[16]Foster S J, Ashby A M, Fitt B D L. Improved PCR-based assays for pre-symptomatic diagnosis of light leaf spot and determination of mating type ofPyrenopezizabrassicaeon winter oilseed rape [J]. European Journal of Plant Pathology, 2002, 108(4): 379-383.

[17]陳慶河, 李本金, 蘭成忠, 等. 雙重PCR檢測馬鈴薯晚疫病菌和青枯病菌方法的建立及應用[J]. 植物病理學報, 2009, 39(6): 578-583.

[18]Zhou Yongli. Specific and sensitive detection of the fungal pathogenUstilaginoideavirensby nested-PCR [J]. Mycosystema, 2004, 23(l): 102-108.

[19]Porter-Jordan K, Rosenberg E I, Keiser J F, et al. Nested polymerase chain reaction assay for the detection of cytomegalovirus overcomes false positive caused by contamination with fragment DNA [J]. Journal of Medical Virology, 1990, 30(2): 85-89.

[20]余卓桐, 羅大全, 謝藝賢, 等. 橡膠樹主要病害防治決策模型研究[J]. 中國熱帶農(nóng)業(yè), 2006(3): 26-29.

(責任編輯：楊明麗)

PCR and nested-PCR for the molecular detection of Oidium heveae Steinm.

Mao Yuning,Liang Peng,Liu Wenbo,Lin Chunhua,Miao Weiguo,Zheng Fucong

(Hainan Key Laboratory for Sustainable Utilization of Tropical Bio-Resources, College of Enviromental and Plant Protection, Hainan University, Haikou570228, China)

To establish methods for detection of powdery mildew of rubber tree by using conventional PCR and nested-PCR, two sets of specific primers OHF1/OHR1 and OHF2/OHR2 were designed respectively based on unique conserved sequence OHS ofOidiumheveae. SixO.heveaesamples (OH1-OH6) from different region, five strains of non-target pathogenic fungi and healthy rubber tree leaves were used to evaluate the specificity and sensitivity of conventional PCR and nested-PCR detection system. The results revealed that both OHF1/OHR1 and OHF2/OHR2 have high specificity and sensitivity. The detection limit is 10 pg/μL and 0.01 fg/μL DNA, respectively for conventional PCR (using primer OHF2/OHR2) and nested-PCR (using OHF1/OHR1 and OHF2/OHR2). Artificial inoculation test ofO.heveaeon rubber tree indicated that target band can be detected by PCR and nested-PCR at 4th day and 24 h after inoculation, respectively. These results suggested that the nested-PCR is more efficient than the conventional PCR forO.heveaein incubation period and provide an easy and accurate way forO.heveaedetection.

Oidiumheveae;incubation period;molecular detection

2015-10-30

2016-03-03

國家“973”計劃項目(2011CB111612);國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-34-GW8);國家自然科學基金(31160359);教育部博士點基金(20104601110004);海南大學科研啟動資金(kyqd1006)

E-mail: weiguomiao1105@126.com; zhengfucong@126.com

S 763.1

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.04.019

Experimental Method & Technology