響應(yīng)面法優(yōu)化紅樹莓花色苷超聲輔助提取工藝的研究

萬(wàn)　山,楊　喆,朱保慶,歐陽(yáng)杰

(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系,林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100083)

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響應(yīng)面法優(yōu)化紅樹莓花色苷超聲輔助提取工藝的研究

萬(wàn)山,楊喆,朱保慶,歐陽(yáng)杰*

(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系,林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100083)

以紅樹莓為原料,采用超聲輔助法對(duì)其中的花色苷進(jìn)行提取,研究了超聲功率、間歇時(shí)間、提取時(shí)間和提取溫度四個(gè)因素對(duì)花色苷得率的影響。在此基礎(chǔ)上,根據(jù)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,分析了各因素的顯著性和交互作用,優(yōu)化超聲輔助提取參數(shù)。最終得到樹莓花色苷較優(yōu)提取工藝條件:超聲功率900 W,間歇時(shí)間3 s,提取時(shí)間50 min,提取溫度為50 ℃。此條件下樹莓花色苷的提取得率為0.163 mg/g。

紅樹莓,花色苷,超聲輔助提取,響應(yīng)面

紅樹莓(Rubuslambertianus)屬于薔薇科懸鉤子屬灌木、半灌木或匍匐草本植物,主要生長(zhǎng)在北半球溫帶地區(qū)。我國(guó)目前27個(gè)省區(qū)有樹莓栽培,其中在西南地區(qū)分布最為集中[1]。樹莓含有低卡路里、高纖維和多種生物活性物質(zhì),如黃酮類、酚酸類、木脂素類和鞣酸類物質(zhì)。在酚類化合物中,鞣花單寧和花色苷是樹莓顯色和促進(jìn)人體健康的有效物質(zhì),它們具有抗氧化性、抗癌、舒張血管和抗菌等特性[2-3]。研究表明,紅樹莓含有11種花色苷,其中矢車菊素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-槐糖苷含量較高,不同品種樹莓花色苷差異很大,與生長(zhǎng)環(huán)境、采收時(shí)間、成熟度等有較大關(guān)系[4]。

目前,超聲波輔助提取法、超臨界流體萃取法、微波輔助提取法和溶劑萃取法等方法已經(jīng)被應(yīng)用于多種生物活性物質(zhì)的提取,其中超聲波輔助提取法因儀器便宜、操作簡(jiǎn)單、能有效代替?zhèn)鹘y(tǒng)提取工藝等優(yōu)勢(shì)得到廣泛應(yīng)用,它是利用超聲波使溶劑產(chǎn)生聲空化效應(yīng),加速有效成分溶解,縮短提取時(shí)間,進(jìn)而提高有效成分的產(chǎn)量,同時(shí)還能避免高溫對(duì)提取物的影響[5-7]。Kashif Ghafoor[5]利用超聲波輔助法從葡萄籽中提取出花色苷,其提取得率為2.29 mg/mL。李金星[6]以藍(lán)莓果渣為原料,研究超聲輔助提取工藝條件,每克藍(lán)莓果渣能提取出花色苷(9.91±0.05)mg,與浸提法相比,超聲輔助提取時(shí)間較短,提取量大。李雙石[7]研究表明超聲波輔助提取葡萄皮渣花色苷,不僅可以顯著提高花色苷的提取量,還可以增加花色苷的提取類型。目前對(duì)樹莓花色苷溶劑萃取、穩(wěn)定性研究較多,而對(duì)超聲輔助提取樹莓花色苷參數(shù)優(yōu)化研究較少。本研究對(duì)樹莓中的花色苷進(jìn)行超聲波輔助提取,并通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取條件,得出最優(yōu)參數(shù),為樹莓的綜合利用提供研究基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

紅樹莓河南信陽(yáng)雞公山國(guó)家森林公園,采后存放于-20 ℃冰箱中。無(wú)水乙醇、鹽酸等分析純,北京化學(xué)試劑公司。CTXNW-2B超聲循環(huán)提取機(jī)北京弘祥隆生物技術(shù)股份有限公司,T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)北京普析通用儀器責(zé)任有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1提取工藝紅樹莓→解凍→研磨→超聲提取→抽濾→樹莓花色苷提取物

稱取10 g紅樹莓,室溫下解凍后研磨,按照料液比1∶20加入到200 mL的提取溶劑中,設(shè)定不同的超聲輔助提取參數(shù)進(jìn)行提取,然后將提取液抽濾,濾液即為紅樹莓花色苷提取物。

1.2.2最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定取一定量鮮果,解凍后研磨,提取溶劑為體積分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸水溶液,按照料液比1∶20于50 ℃浸提1 h,然后抽濾取濾液,在190～800 nm處進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,確定樹莓花色苷提取液的最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.3提取溶劑的選擇經(jīng)參考大量文獻(xiàn),分別選取不同溶度鹽酸水溶液、不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液及不同體積分?jǐn)?shù)鹽酸酸化乙醇溶液為提取劑,在一定條件下進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn),以樹莓花色苷提取得率為指標(biāo),確定最佳提取溶劑。取一定量鮮果,解凍后研磨,提取溶劑分別為:體積分?jǐn)?shù)為0、1%、2%、3%、4%的鹽酸水溶液,體積分?jǐn)?shù)為0、20%、40%、60%、80%的乙醇水溶液,以及體積分?jǐn)?shù)為0、20%、40%、60%、80%的鹽酸酸化乙醇溶液(pH3),按液料比1∶20于50 ℃浸提1 h,然后抽濾取濾液,在506 nm處測(cè)吸光度值,計(jì)算花色苷含量,重復(fù)三次,確定最佳提取溶劑。

1.2.4花色苷含量的測(cè)定方法參考pH示差法稍作改動(dòng)[2,8]。取1.0 mL紅樹莓花色苷提取液,分別用鹽酸-氯化鈉緩沖液(pH1.0)和醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.5),稀釋至10 mL,室溫下放置15 min,在506和700 nm處測(cè)吸光度值,按以下公式計(jì)算花色苷含量:

其中:X為花色苷含量(mg/g),ΔA=(A506 nm,pH=1.0-A700 nm,pH=1.0)-(A506 nm,pH=4.5-A700 nm,pH=4.5);V為稀釋體積/mL;n為稀釋倍數(shù);M為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量(449 g/mol);ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)[26900 L/(mol·cm)];m為樹莓質(zhì)量/g;L為比色皿厚度(1 cm)。

1.2.5單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以超聲功率、間歇時(shí)間、提取時(shí)間、提取溫度四個(gè)因素為研究對(duì)象,以提取液中花色苷含量為指標(biāo),進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。其中間歇時(shí)間是指超聲儀休息時(shí)間,提取時(shí)間為超聲儀間歇時(shí)間和工作時(shí)間總和。選取間歇時(shí)間為3 s,提取時(shí)間為50 min,提取溫度為50 ℃,研究不同超聲功率對(duì)花色苷含量的影響;選取超聲功率為900 W,提取時(shí)間為50 min,提取溫度為50 ℃,研究不同間歇時(shí)間對(duì)花色苷含量的影響;選取超聲功率為900 W,間歇時(shí)間為3 s,提取溫度為50 ℃,研究不同提取時(shí)間對(duì)花色苷含量的影響;選取超聲功率為900 W,間歇時(shí)間為3 s,提取時(shí)間為50 min,研究不同提取溫度對(duì)花色苷含量的影響。各因素水平見表1。

表1　單因素水平設(shè)計(jì)表Table 1　Horizontal design of single factor

1.2.6響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,運(yùn)用Design Expert 7.0軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),設(shè)計(jì)樹莓花色苷提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平表,進(jìn)行了29組響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,確定最佳實(shí)驗(yàn)條件[5,9]。實(shí)驗(yàn)因素及水平見表2。

表2　樹莓花色苷提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 2　Factors and levels of response surface methodology

2　結(jié)果與分析

2.1最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定

由圖1可知,樹莓花色苷可見光區(qū)的最大吸收波長(zhǎng)在506 nm處,實(shí)驗(yàn)中測(cè)定樹莓花色苷含量均采用此波長(zhǎng),與肖軍霞等研究的510 nm略有差異[8,10],可能是因?yàn)榧t樹莓的品種不同導(dǎo)致的。

圖1　紅樹莓花色苷全掃描圖譜Fig.1　The full scanning spectrum of red raspberry anthocyanin

2.2提取溶劑的選擇

花色苷屬于水溶性多酚類化合物,可溶于水、乙醇等極性溶劑中,在酸性條件下穩(wěn)定[6]。由圖2可知,樹莓花色苷在鹽酸水溶液中提取效果最好,當(dāng)鹽酸濃度為1%時(shí),提取液中花色苷含量為0.158 mg/g,顯著(p<0.05)高于20%酸化乙醇的0.147 mg/g。而乙醇溶液的提取效果比水更差些,這是因?yàn)樗臉O性比乙醇強(qiáng),而酸溶液的極性更強(qiáng),因此本實(shí)驗(yàn)選用體積分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸水溶液作為提取溶劑。

圖2　不同提取溶劑對(duì)樹莓花色苷提取含量的影響Fig.2　Effects of solvents on the extraction yield of raspberry anthocyanins

2.3單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

超聲功率、間歇時(shí)間、提取時(shí)間和溫度對(duì)樹莓花色苷含量的影響如圖3。結(jié)果表明,隨著超聲功率的增大空化效應(yīng)增強(qiáng),樹莓細(xì)胞壁破裂速度加快,花色苷不斷溶出[2],當(dāng)超聲功率達(dá)到900 W時(shí),樹莓提取液中的花色苷含量最高,達(dá)到0.161 mg/g,顯著(p<0.01)高于600～800 W時(shí)的花色苷含量。之后隨著超聲功率的升高,花色苷含量不斷下降,這可能是由于超聲功率過大破壞了花色苷的穩(wěn)定[11],因此,選擇最佳超聲功率為900 W。當(dāng)總時(shí)間一定時(shí),間歇時(shí)間越長(zhǎng),表示工作時(shí)間越短,間歇時(shí)間低于3 s時(shí),花色苷含量隨間歇時(shí)間的增加而增加,3 s時(shí)含量達(dá)到最高,超過3 s后略有降低,可能是因?yàn)殚g歇時(shí)間過長(zhǎng),樹莓花色苷提取不夠充分,從而使含量下降[12],因此選擇最佳間歇時(shí)間為3 s。

隨著提取時(shí)間的增加,樹莓花色苷含量不斷上升,當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到50 min時(shí)含量達(dá)到最大,繼續(xù)增大提取時(shí)間可能會(huì)使花色苷分解[13],因此實(shí)際操作中的最佳提取時(shí)間為50 min。隨著溫度的上升,樹莓花色苷含量不斷提高,當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)含量達(dá)到最高,繼續(xù)升高溫度含量略有下降,可能是由于過高的溫度會(huì)對(duì)花色苷的結(jié)構(gòu)造成破壞[11,14-15],因此,選擇最佳提取溫度為50 ℃。

圖3　不同參數(shù)對(duì)樹莓花色苷提取含量的影響 Fig.3　Effects of different parameters on the yield of raspberry anthocyanins

表3　響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 3　Desiging scheme and results of response surface methodology

表4　回歸方程的方差分析表Table 4　Variance analysis of regression equation by response surface

注:*代表0.05顯著水平;**代表0.01顯著水平。

2.4響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1樹莓花色苷超聲輔助提取工藝回歸模型的建立及方差分析根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以超聲功率(A)、間歇時(shí)間(B)、提取時(shí)間(C)、提取溫度(D)為自變量,以樹莓花色苷含量(Y)為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)[16-18],結(jié)果如表3所示。

根據(jù)軟件結(jié)果,樹莓花色苷含量的回歸方程如下:

Y=0.16-2.000A+1.750B+9.167C+3.000D-2.500AB-3.250AC-6.000AD+3.750BC-4.250BD-2.750CD-0.024A2-4.500B2-0.032C2-0.011D2

其中Y為樹莓花色苷含量的預(yù)測(cè)值,A、B、C、D分別為以上四個(gè)自變量的值。對(duì)上述方程進(jìn)行方差分析,結(jié)果如表4所示。

2.4.2響應(yīng)面分析根據(jù)回歸方程,各因素間交互作用的三維曲面見圖4～圖9。三維曲面反映每?jī)蓚€(gè)影響因素之間的交互作用,等高線形狀越趨向于橢圓形交互作用越顯著[2,18-19],由圖可以看出,四個(gè)因素的交互作用均不顯著。

圖4　Y=f(A,B)的響應(yīng)面Fig.4　Responsive surface graph of Y=f(A,B)

圖5　Y=f(A,C)的響應(yīng)面Fig.5　Responsive surface graph of Y=f(A,C)

圖6　Y=f(A,D)的響應(yīng)面Fig.6　Responsive surface graph of Y=f(A,D)

圖7　Y=f(B,C)的響應(yīng)面Fig.7　Responsive surface graph of Y=f(B,C)

圖8　Y=f(B,D)的響應(yīng)面Fig.8　Responsive surface graph of Y=f(B,D)

圖9　Y=f(C,D)的響應(yīng)面Fig.9　Responsive surface graph of Y=f(C,D)

2.4.3最佳超聲波輔助提取工藝條件的確定為進(jìn)一步確定最佳提取條件,利用Design Expert 7.0軟件對(duì)提取的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,提取較優(yōu)工藝參數(shù)為:超聲功率為894.15 W,間歇時(shí)間3.15 s,提取時(shí)間50.21 min,提取溫度為51.23 ℃,此條件下,樹莓花色苷含量的預(yù)測(cè)值為0.162 mg/g。為方便實(shí)際操作,將提取工藝參數(shù)調(diào)整為:超聲功率900 W,間歇時(shí)間3 s,提取時(shí)間50 min,提取溫度50 ℃,在此條件下進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn),實(shí)際測(cè)得樹莓花色苷的平均提取得率為0.163 mg/g,接近軟件分析得到的預(yù)測(cè)值,說明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂尚卸雀?與實(shí)際情況擬合度好。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助提取法,選取了超聲功率、間歇時(shí)間、提取時(shí)間、提取溫度4個(gè)因素,研究其對(duì)樹莓花色苷產(chǎn)量的影響,通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)原理建立了提取工藝的回歸方程模型,經(jīng)方差分析該模型擬合度良好。得到最佳提取工藝參數(shù)為:超聲功率為894.15 W,間歇時(shí)間3.15 s,提取時(shí)間50.21 min,提取溫度為51.23 ℃,實(shí)際實(shí)驗(yàn)參數(shù)為功率900 W，間歇時(shí)間3 s,提取50 min，溫度50 ℃,樹莓花色苷預(yù)測(cè)值為0.162 mg/g,調(diào)整參數(shù)后經(jīng)實(shí)驗(yàn)得出實(shí)際值為0.163 mg/g,接近預(yù)測(cè)值。

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Parameters optimization of ultrasound-assisted extraction of anthocyanins from red raspberry by response surface methodology

WAN Shan,YANG Zhe,ZHU Bao-qing,OUYANG Jie*

(Department of Food Science and Engineering,College of Biological Science and Technology,Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)

Anthocyanins were ultrasound-assisted extracted with red raspberry used as raw material. The effects of four factors including ultrasonic power,internal time,extraction time and temperature on the yield of anthocyanins were investigated. Based on above results,the significance and interaction of each factor were analyzed in accordance with Box-Behnken. Extraction parameters of anthocyanins from red raspberry were optimized by response surface methodology,which were determined as follows:ultrasonic power of 900 W,internal time of 3 s,extraction time of 50 min and extraction temperature of 50 ℃. Under the above conditions,the extraction yield of anthocyanins was 0.163 mg/g.

Red raspberry;anthocyanins;ultrasound-assisted extraction;response surface methodology

2015-06-05

萬(wàn)山(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物提取，E-mail:348173528@qq.com。

歐陽(yáng)杰(1971-)，男，博士，副教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程，E-mail:ouyangjie@bifu.edu.cn。

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(2015ZCQ-SW-04)；第44批“留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金”資助項(xiàng)目。

TS255.1

B

1002-0306(2016)03-0220-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.038