解淀粉芽孢桿菌Z16的產(chǎn)酶條件優(yōu)化及應(yīng)用

曾　誠,馬毛毛,肖彥駿,3,*,曾哲靈,余　平,鐘衛(wèi)民

(1.南昌大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院,江西南昌 330031;2.南昌大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,江西南昌 330031;3.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江西南昌 330047;4.南昌大學(xué) 資源環(huán)境與化工學(xué)院,江西南昌 330031;5.撫州職業(yè)技術(shù)學(xué)院,江西撫州344106)

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解淀粉芽孢桿菌Z16的產(chǎn)酶條件優(yōu)化及應(yīng)用

曾誠1,馬毛毛2,肖彥駿2,3,*,曾哲靈3,4,余平4,鐘衛(wèi)民5

(1.南昌大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院,江西南昌 330031;2.南昌大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,江西南昌 330031;3.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江西南昌 330047;4.南昌大學(xué) 資源環(huán)境與化工學(xué)院,江西南昌 330031;5.撫州職業(yè)技術(shù)學(xué)院,江西撫州344106)

本文采用單因素實驗和正交實驗,對解淀粉芽孢桿菌Z16的產(chǎn)酶條件及水酶法提取樟樹仁油工藝條件進行優(yōu)化,并與枯草芽孢桿菌AS1.398的水酶法提取樟樹籽仁油工藝進行比較。結(jié)果表明,解淀粉芽孢桿菌Z16的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為:玉米粉4.5%,麩皮2.5%,豆粕4.0%,CaCl20.2%,KH2PO40.03%,Na2HPO4·12H2O 0.4%,pH7.5,121 ℃滅菌20 min;解淀粉芽孢桿菌Z16的最佳發(fā)酵條件為:接種量2%,37 ℃、220 r/min,搖瓶培養(yǎng)44 h。在最佳產(chǎn)酶工藝條件下,解淀粉芽孢桿菌Z16所產(chǎn)中性蛋白酶活力為6984.3 U/mL,比產(chǎn)酶條件優(yōu)化前提高了54.0%。解淀粉芽孢桿菌Z16水酶法提取樟樹籽仁油的最適酶解時間為4 h、最適加酶量為20%(v/v),相應(yīng)的樟樹籽仁油得率為91.1%、樟樹籽仁油的酸價升高值只有0.3 mg KOH/mL。解淀粉芽孢桿菌Z16的水酶法提取樟樹籽仁油的效果顯著優(yōu)于枯草芽孢桿菌AS1.398(常用的中性蛋白酶生產(chǎn)菌)的效果。

解淀粉芽孢桿菌,中性蛋白酶,樟樹籽仁油,水酶法

樟樹籽仁油的中碳鏈脂肪酸甘油酯含量高于94%,具有減少體內(nèi)脂肪沉積、降低血脂和血糖水平等作用[1-2]。中碳鏈脂肪酸甘油酯對枯草芽孢桿菌AS1.398等革蘭氏陽性菌、霉菌及其所產(chǎn)生物酶具有較強的抑制作用[3-6]。水酶法提取油脂中使用的蛋白酶基本上是枯草芽孢桿菌AS1.398、棲土曲霉3942、放線菌166等菌株所生產(chǎn)的[7-8]。采用這些菌株所產(chǎn)的蛋白酶應(yīng)用于樟樹籽仁油的提取,其得率小于83%,酸價大于5 mg KOH/g。解淀粉芽孢桿菌Z16是產(chǎn)中性蛋白酶能力強、產(chǎn)脂肪酶能力很弱的耐中碳鏈脂肪酸型菌株,該菌株的產(chǎn)中性蛋白酶能力[9],比近年來文獻報道的枯草芽孢桿菌N19[10-11]、枯草芽孢桿菌Bx-4[12]的產(chǎn)蛋白酶能力高很多,也高于國內(nèi)常用于生產(chǎn)中性蛋白酶制劑的出發(fā)菌株——枯草芽孢桿菌AS1.398、棲土曲霉3942、放線菌166的產(chǎn)蛋白酶能力[13]。而解淀粉芽孢桿菌Z16的產(chǎn)脂肪酶活力大幅低于國內(nèi)常用于生產(chǎn)中性蛋白酶制劑的出發(fā)菌株的產(chǎn)脂肪酶能力[9]。因此,解淀粉芽孢桿菌Z16適用于水酶法提取樟樹籽仁油等中碳鏈油脂。本文對解淀粉芽孢桿菌Z16的產(chǎn)酶條件及水酶法提取樟樹籽仁油工藝條件進行優(yōu)化,實現(xiàn)樟樹籽仁油的水酶法提取。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

解淀粉芽孢桿菌Z16課題組篩選獲得;枯草芽孢桿菌AS1.398中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;肉湯培養(yǎng)基蛋白胨1 g,牛肉膏0.3 g,NaCl 0.5 g,蒸餾水100 mL,pH(7.0±0.2),121 ℃滅菌20 min;基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基[14-15]玉米粉4 g,麩皮2.5 g,豆粕3 g,KH2PO40.03 g,Na2HPO4·12H2O 0.4 g,蒸餾水100 mL,pH(7.0±0.2),121 ℃滅菌20 min;樟樹籽仁(含油量57.96%)、玉米粉、麩皮、豆粕市售;Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、Na2CO3、NaCl、葡萄糖、三氯乙酸、乙醚分析純,西隴化工有限公司;瓊脂、干酪素、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉分析純,天津大茂化學(xué)試劑廠;福林酚分析純,上海荔達生物科技有限公司。

FA1604電子天平德國賽多利斯有限公司;XMT1-8112電熱恒溫水浴鍋、TQZ-312型臺式全溫振蕩器、全自動高壓滅菌鍋、SKP-02420型電熱恒溫培養(yǎng)箱上海精宏實驗設(shè)備有限公司;超凈工作臺吳江市凈化設(shè)備總廠;HS-2F型pH儀上海精密科學(xué)儀器有限公司雷磁儀器廠;TGL-16G高速離心機上海安亭科學(xué)儀器廠;WFZ765PC型紫外可見分光度計上海光譜儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

1.2.1.1酶液的制作取一環(huán)活化好的菌株接種到肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃、220 r/min 搖床培養(yǎng)24 h制得種子液。以4%的接種量將種子液加入到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中,37 ℃、220 r/min搖瓶培養(yǎng)48 h后,8000 r/min離心10 min,上清液即為酶液。

1.2.1.2蛋白酶活力測定方法采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23527-2009《蛋白酶制劑》中規(guī)定的福林酚法檢測樣品中的中性蛋白酶活力[16]。

1.2.1.3碳源和氮源種類對菌株產(chǎn)蛋白酶能力的影響將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源(玉米粉)分別替換為葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、甘油、檸檬酸鈉;將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源(豆粕)分別替換為蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、硝酸鈉、硫酸銨,其他條件同1.2.1.1,以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為對照,分別測定各酶液的中性蛋白酶活力。

1.2.1.4玉米粉、麩皮、豆粕含量對菌株產(chǎn)蛋白酶能力的影響將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米粉的含量分別調(diào)整為3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%;麩皮含量分別調(diào)整為1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4.5%;豆粕的含量分別調(diào)整為2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%,其他條件同1.2.1.1,分別測定各酶液的中性蛋白酶活力。

1.2.1.5金屬離子對菌株產(chǎn)蛋白酶能力的影響在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加0.1%(w/w)的CaCl2、ZnCl2、MgSO4·7H2O、FeSO4、Fe2(SO4)3、MnCl2,其他條件同1.2.1.1,以不添加任何金屬離子的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為對照,比較各組酶液中性蛋白酶活力。

1.2.2發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.2.1培養(yǎng)基pH對菌株產(chǎn)蛋白酶能力的影響用HCl和NaOH分別將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)至5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9,其他條件同1.2.1.1,分別測定各酶液的中性蛋白酶活力。

1.2.2.2發(fā)酵溫度對菌株產(chǎn)蛋白酶能力的影響將搖床溫度分別調(diào)節(jié)為29、31、33、35、37、39、41 ℃,其他條件同1.2.1.1,分別測定各酶液的中性蛋白酶活力。

1.2.2.3接種量對菌株產(chǎn)蛋白酶能力的影響將接種量分別調(diào)整為1%、2%、3%、4%、5%、6%,其他條件同1.2.1.1,分別測定各酶液的中性蛋白酶活力。

1.2.2.4發(fā)酵時間對菌株產(chǎn)蛋白酶能力和菌體濃度的影響在發(fā)酵過程中每隔2 h檢測發(fā)酵液的中性蛋白酶活力、菌體濃度。菌體濃度以稀釋10倍的發(fā)酵液OD600計算。

1.2.3發(fā)酵培養(yǎng)基配方的正交實驗優(yōu)化以玉米粉、麩皮、豆粕和氯化鈣含量為影響因子,設(shè)計L9(34)正交實驗,以確定菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配比,其他條件選取以上單因素實驗的最優(yōu)結(jié)果。正交實驗因子與水平表列于表1中。

表1　培養(yǎng)條件正交實驗因素水平表Table 1　Factors and levels of orthogonal test for medium

1.2.4解淀粉芽孢桿菌Z16的水酶法提取樟樹籽仁油取干燥至恒重的樟樹籽仁與去離子水1∶4(w/w)加入到膠體磨中,濕法粉碎5 min,獲得水乳液。以10%(v/v)的加酶量,將解淀粉芽孢桿菌Z16所產(chǎn)酶液加入到水乳液中,45 ℃保溫4 h。將上述發(fā)酵液90 ℃保溫10 min滅活,5000 r/min離心分離20 min。搜集下層渣相,70 ℃烘干至恒重,稱重,并用索氏提取法測定其含油率。吸取上層油乳相,經(jīng)冷凍解凍法破乳化后獲得樟樹籽仁油。采用國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 5530-2005)《動植物油脂酸價測定方法》測定樟樹籽仁油的酸價[17]。以滅活的淀粉芽孢桿菌Z16所產(chǎn)酶液為空白對照,以枯草芽孢桿菌AS1.398所產(chǎn)酶液為陽性對照。

樟樹籽仁油得率計算方法:

式中,X為樟樹籽仁油得率;M1和M2分別為樟樹籽仁質(zhì)量與殘渣質(zhì)量;C1和C2分別為樟樹籽仁含油率和殘渣含油率。

1.2.5解淀粉芽孢桿菌Z16的水酶法提取樟樹籽仁油工藝條件優(yōu)化

1.2.5.1酶解時間對樟樹籽仁油得率的影響將1.2.4中的酶解時間分別調(diào)整為1、2、3、4、5、6 h,其他條件及操作步驟同1.2.4。每組做4個平行實驗,分別檢測各組樟樹籽仁油得率。

1.2.5.2加酶量對樟樹籽仁油得率的影響將1.2.4中的酶液添加量分別調(diào)整為5%、10%、15%、20%、25%,其他條件及操作同1.2.4。每組做4個平行實驗,分別檢測各組樟樹籽仁油得率。

1.2.6數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)表示采用四次測試所獲的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。通過使用統(tǒng)計程序軟件(SPSS 19.0)方差分析法(ANOVA分析)與隨后的單獨樣品抽樣t檢測用來進行比較。如果p<0.05,則差異被認(rèn)為是系統(tǒng)上顯著。

2　結(jié)果與討論

2.1解淀粉芽孢桿菌 Z16產(chǎn)酶條件優(yōu)化

不同碳源和氮源對解淀粉芽孢桿菌Z16發(fā)酵產(chǎn)酶的影響結(jié)果如圖1所示,由圖1A可知,菌株產(chǎn)中性蛋白酶的最適碳源為玉米粉,當(dāng)以蔗糖、淀粉等為碳源時菌株產(chǎn)酶能力較低。這是因為易于被微生物利用的碳源或氮源有助于細(xì)胞生長,難以被微生物直接利用的碳源或氮源則有助于產(chǎn)酶[13]。由圖1B可知,培養(yǎng)基中的有機氮源較無機氮源更有利于菌株產(chǎn)酶,難以被利用的有機氮源比易于被利用的有機氮源更有利于菌株產(chǎn)酶。其中,菌株產(chǎn)中性蛋白酶的最適氮源為豆粕。

圖1　碳源和氮源種類對解淀粉芽孢桿菌 Z16產(chǎn)中性蛋白酶能力的影響Fig.1　The effects of carbon resources and nitro resource on proteinase producing

玉米粉含量、麩皮含量和豆粕含量對解淀粉芽孢桿菌Z16產(chǎn)中性蛋白酶能力的影響如圖2所示。由圖2可知,玉米粉含量與豆粕含量對菌株產(chǎn)中性蛋白酶能力的影響較大,當(dāng)玉米粉含量為4.0%～4.5%時,菌株產(chǎn)中性蛋白酶活力達到4600 U/mL以上;當(dāng)豆粕含量為3.5%時,菌株產(chǎn)中性蛋白酶活力最高,為5822.2 U/mL。麩皮含量對菌株產(chǎn)中性蛋白酶能力的影響不大,當(dāng)麩皮含量為3.0%時,菌株產(chǎn)中性蛋白酶活力最高,為5089.4 U/mL。這是因為玉米粉和豆粕分別是培養(yǎng)基中的主要碳源與主要氮源,兩者含量的變化,都會對培養(yǎng)基的C/N產(chǎn)生較大的影響,從而影響菌株的產(chǎn)中性蛋白酶能力。麩皮含量對培養(yǎng)基C/N的影響不大,因而對菌株產(chǎn)中性蛋白酶能力影響也不大。

圖2　豆粕、玉米粉、麩皮含量對解淀粉芽孢桿菌 Z16產(chǎn)中性蛋白酶能力的影響Fig.2　The effects of soybean meal,corn meal and wheat bran content on proteinase producing

金屬離子、培養(yǎng)基pH、發(fā)酵溫度和接種量對解淀粉芽孢桿菌Z16產(chǎn)中性蛋白酶能力的影響繪于圖3中。由圖3A可知,Ca2+、Mn2+有激活菌株產(chǎn)酶的作用,分別較空白組提高了17.7%和5.1%。因為Ca2+有促進菌體生長、增加中性蛋白酶的穩(wěn)定性而減少中性蛋白酶自溶的作用[13],Mn2+是該中性蛋白酶中的活性中心。

由圖3B可知,當(dāng)培養(yǎng)基的pH低于7或者超過7.5時,菌株的產(chǎn)中性蛋白酶能力顯著下降,培養(yǎng)基pH為7.5時菌株產(chǎn)酶能力最高,達5250.4 U/mL。因為培養(yǎng)基的pH會影響菌體的形態(tài)和代謝產(chǎn)物的合成途徑,從而影響菌體的產(chǎn)酶量。由圖3C可知,發(fā)酵溫度為37 ℃時,菌株產(chǎn)中性蛋白酶能力最高,為5593.4 U/mL。發(fā)酵溫度過低,不利于菌株生長;發(fā)酵溫度過高,菌株衰老加快、蛋白酶穩(wěn)定性變差、蛋白酶自溶增加,酶活力迅速降低。由圖3D可知,接種量為2%時,菌株產(chǎn)酶能力最高,為5826.2 U/mL。通常情況下,接種量越大,延滯期越短,然而接種量過大使得培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)過快地被消耗,代謝廢物增多,抑制菌株產(chǎn)酶[13]。

圖3　金屬離子、培養(yǎng)基pH、發(fā)酵溫度、接種量 對解淀粉芽孢桿菌Z16產(chǎn)中性蛋白酶能力的影響Fig.3　The effects of meal icons,pH,temperature and inoculum size on protease producing

由圖4中的菌體濃度曲線可以看出,解淀粉芽孢桿菌Z16細(xì)胞生長的遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期分別為0～20,20～30,30～50和50 h之后。由圖4中的酶活力曲線可以看出,解淀粉芽孢桿菌Z16發(fā)酵時間達到12 h后,中性蛋白酶活力開始迅速增高,因為菌體細(xì)胞生長進入遲緩期的后期,菌體開始大量分泌胞外蛋白酶分解環(huán)境中的蛋白質(zhì),以獲得足夠的氨基酸,為細(xì)胞快速分裂做準(zhǔn)備。發(fā)酵時間達到44 h,中性蛋白酶活力達到最大值,為4695.9 U/mL。發(fā)酵時間達到44 h后,中性蛋白酶活力開始降低,因為菌體細(xì)胞生長開始進入穩(wěn)定期的后期,培養(yǎng)基中誘導(dǎo)菌株產(chǎn)蛋白酶的營養(yǎng)物基本被消耗,導(dǎo)致菌株產(chǎn)中性蛋白酶能力降低。發(fā)酵時間達到50 h后,中性蛋白酶活力開始快速降低,細(xì)胞生長進入衰亡期,菌體細(xì)胞死亡加速,影響中性蛋白酶活力的胞內(nèi)物質(zhì)釋放到培養(yǎng)基中,加速了中性蛋白酶的自溶,導(dǎo)致中性蛋白酶活力迅速降低。對比上述兩條曲線也可知,該菌株產(chǎn)胞外中性蛋白酶與細(xì)胞生長是同步進行的。

圖4　解淀粉芽孢桿菌Z16發(fā)酵曲線Fig.4　The fermentation curve of Bacillus amlollquefaciens Z16

由表2可知,各因素影響作用按大小排列為:A>D>C>B。對正交實驗結(jié)果方差分析可知,FA>FD>FC>FB,即培養(yǎng)基中玉米粉含量對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)酶量的影響最大,麩皮含量對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)酶量影響最小,但在α=0.05水平上都不顯著,這可能是由于各因素水平間距較小造成的。理論優(yōu)化組合為A3B1C3D2,即玉米粉4.5%、麩皮2.5%、豆粕4.0%、CaCl20.2%。在該條件下,解淀粉芽孢桿菌Z16的產(chǎn)中性蛋白酶活力為6984.3 U/mL,比產(chǎn)酶條件優(yōu)化前提高了54.0%(產(chǎn)酶條件優(yōu)化前為4536.5 U/mL)[9]。

2.2解淀粉芽孢桿菌Z16水酶法提取樟樹籽仁油及其工藝條件優(yōu)化

由表3可知,在相同提取條件下(加酶量10%、酶解時間4 h),解淀粉芽孢桿菌Z16組的樟樹籽仁油得率為87.9%,顯著高于空白組(75.8%)、枯草芽孢桿菌AS1.398組(陽性對照組)(79.5%),說明解淀粉芽孢桿菌Z16所產(chǎn)酶液耐受中碳鏈脂肪酸的能力強、對樟樹籽仁蛋白有很好的水解作用。解淀粉芽孢桿菌Z16組所得樟樹籽仁油的酸價較空白組有所升高,但大幅低于枯草芽孢桿菌AS1.398組(陽性對照組),即相對于空白組,解淀粉芽孢桿菌Z16組所得樟樹籽仁油的酸價升高值只有0.3 mg KOH/g,枯草芽孢桿菌AS1.398組(陽性對照組)酸價升高值達16.0 mg KOH/g?？赡苁且驗榭莶菅挎邨U菌AS1.398所產(chǎn)酶液中脂肪酶活力(實測2.9 U/mL)比解淀粉芽孢桿菌Z16所產(chǎn)酶液中脂肪酶活力(0.088U/mL)高很多[9],致使水酶法提取樟樹籽仁油過程中的樟樹籽仁油水解率大幅提高,進而大幅提高樟樹籽仁油的酸價,降低樟樹籽仁油的質(zhì)量。

表2　正交實驗結(jié)果Table 2　Rang analysis of orthogonal test for medium

注：*ki為各因素i水平所在實驗組對應(yīng)實驗結(jié)果的平均值;極差R為各因素ki最大值與最小值之差。

表3　不同菌株的水酶法提取樟樹籽仁油結(jié)果比較Table 3　Comparison on results of aqueous enzymatic extraction camphor tree seed kernel oil with different strains

注：同一行字母相同為無顯著差異,字母不同為顯著差異。

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由圖5A可知,延長酶解時間可提高樟樹籽仁油得率,但酶解4 h后,樟樹籽仁油得率幾乎不再增加。因此,確定4 h為最適酶解時間,此時樟樹籽仁油得率為87.9%。由圖5B可知,增加加酶量可提高樟樹籽仁油得率,但當(dāng)加酶量超過20%時,樟樹籽仁油得率增加不明顯。因此,確定20%為最適加酶量,在該條件下樟樹籽仁油得率為91.1%。

圖5　解淀粉芽孢桿菌Z16所產(chǎn)酶液的酶解時間 和添加量對樟樹籽仁油得率的影響Fig.5　The effects of enzymolysis time and addition enzyme produced by Bacillus amyloliquefaciens Z16 on extraction rate of camphor tree seed kernel oil

3　結(jié)論

解淀粉芽孢桿菌Z16的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為:玉米粉4.5%,麩皮2.5%,豆粕4%,CaCl20.2%,KH2PO40.03%,Na2HPO4·12H2O 0.4%,pH7.5,121 ℃滅菌20 min;解淀粉芽孢桿菌Z16的最佳發(fā)酵條件為:接種量2%,37 ℃、220 r/min,搖瓶培養(yǎng)44 h。在最佳產(chǎn)酶工藝條件下,解淀粉芽孢桿菌Z16所產(chǎn)中性蛋白酶活力為6984.3 U/mL,比產(chǎn)酶條件優(yōu)化前提高了54.0%。

將解淀粉芽孢桿菌Z16所產(chǎn)酶液應(yīng)用于水酶法提取樟樹籽仁油,可顯著提高樟樹仁油得率,而所得樟樹籽仁油的酸價升高很小。解淀粉芽孢桿菌Z16的水酶法提取樟樹籽仁油的效果顯著優(yōu)于國內(nèi)常用的中性蛋白酶生產(chǎn)菌(AS1.398)的效果,非常適用于水酶法提取樟樹籽仁油等中碳鏈油脂。

解淀粉芽孢桿菌Z16水酶法提取樟樹籽仁油的最適酶解時間為4 h、最適加酶量為20%(v/v)。在最佳提取條件下,解淀粉芽孢桿菌Z16水酶法提取樟樹籽仁油的樟樹籽仁油得率為91.1%。

Culture optimizations and application forBacillusamyloliquefaciensZ16 to produce neutral protease

ZENG Cheng1,MA Mao-mao2,XIAO Yan-jun2,3,*,ZENG Zhe-ling3,4,YU Ping4,ZHONG Wei-min5

(1.School of Medicine,The First Medical College,Nanchang University,Nanchang 330031,China;2.School of Life Science,Nanchang University,Nanchang 330031,China;3.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China;4.School of Environmental and Chemical Engineering,Nanchang University,Nanchang 330031,China;5. Fuzhou Vocational Technical College,Fuzhou 344106,China)

The enzyme-producing conditions ofBacillusamyloliquefaciensZ16 and the technological conditions of aqueous enzymatic extraction of camphor tree seed kernel oil were optimized by using single-factor experiment and orthogonal experiment,meanwhile,compared with theBacillussubtilisAS1.398. The best fermentation medium composition ofBacillusamyloliquefaciensZ16 was corn meal 4.5%,wheat bran 2.5%,soya bean meal 4.0%,CaCl20.2%,KH2PO40.03%,Na2HPO4·12H2O 0.4%,pH7.5,and the best fermentation conditions ofBacillusamyloliquefaciensZ16 were inoculation amount 2%,temperature 37 ℃,rate 220 r/min,shake flask culture 44 h. Under the best enzyme-producing technological conditions,the activity of neutral protease produced byBacillusamyloliquefaciensZ16 was 6984.3 U/mL,which was raised by 54.0% after the optimization. The optimum conditions of ofBacillusamyloliquefaciensZ16 aqueous enzymatic extraction of camphor tree seed kernel oil were enzyme adding proportion 20%(v/v),enzymolysis time 4 h. The corresponding camphor tree seed kernel oil yield was 91.1%,and its acid value only rose by 0.3 mg KOH/mL. The effect ofBacillusamyloliquefaciensZ16 on aqueous enzymatic extraction of camphor tree seed kernel oil was obviously superior toBacillussubtilisAS1.398 commonly used to produce neutral protease.

Bacillusamyloliquefaciens;neutral proteinase;camphor tree seed kernel oil;aqueous enzymatic extraction

2015-04-23

曾誠(1993-),男,本科,研究方向：應(yīng)用微生物學(xué),E-mail:18607080355@163.com。

肖彥駿(1990-),男,碩士,研究方向:應(yīng)用微生物學(xué),E-mail:thinkreed@126.com。

國家國際科技合作專項項目(2011DFA32770);江西省國際科技合作項目(20112BDH80004,20123BDH80011);南昌市對外科技合作項目(211-DWHZ-SWYY-001);江西省科技支持計劃重大項目(20143ACG70015);江西省高等學(xué)?？萍悸涞赜媱濏椖?KJLD12012);江西省教育廳產(chǎn)學(xué)研合作項目(GJJ11003);江西省科技支撐計劃項目(GJJ11003)。

TS201.3

B

1002-0306(2016)03-0196-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.033