植物乳桿菌發(fā)酵對大豆分離蛋白功能性質影響研究

崔　憲,劉容旭,姜　帆,宋蕭蕭,柳佳彤,張莉麗,韓建春,2,*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030;2.國家大豆工程技術研究中心,黑龍江哈爾濱 150000)

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植物乳桿菌發(fā)酵對大豆分離蛋白功能性質影響研究

崔憲1,劉容旭1,姜帆1,宋蕭蕭1,柳佳彤1,張莉麗1,韓建春1,2,*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030;2.國家大豆工程技術研究中心,黑龍江哈爾濱 150000)

以脫脂豆粕為原料,通過植物乳桿菌液態(tài)發(fā)酵后制備大豆分離蛋白,測定所得大豆分離蛋白的溶解性、乳化性、乳化穩(wěn)定性、凝膠強度、持水性和持油性等功能性質。豆粕經(jīng)發(fā)酵后所提大豆分離蛋白的溶解性、乳化性、凝膠強度、持水性和持油性均顯著提高(p<0.05),乳化穩(wěn)定性顯著降低(p<0.05),持水性及持油性變化不大。SDS-PAGE電泳顯示,豆粕經(jīng)發(fā)酵后所提大豆分離蛋白在29.0～44.3 ku出現(xiàn)新條帶,是由于乳酸菌所產(chǎn)蛋白酶的降解作用,大豆分離蛋白中大分子量蛋白被降解成小分子量蛋白,其中發(fā)酵對7S組分影響較大,對11S組分影響較小。經(jīng)實驗表明乳酸菌發(fā)酵可以有效改善大豆分離蛋白的功能性質。

植物乳桿菌,大豆分離蛋白,功能性質,發(fā)酵

脫脂豆粕是大豆油加工的副產(chǎn)物,大豆分離蛋白是以脫脂豆粕為原料通過堿溶酸沉制備的蛋白質含量高達90%以上的產(chǎn)品[1],具有較高的營養(yǎng)價值和較好的功能特性而成為食品配料生產(chǎn)中的重要原料[2]。因采用堿溶酸沉的提取方法[3],容易造成部分蛋白質變性從而使某些功能特性降低或喪失,如溶解性和乳化性等,這在一定程度上限制了它的應用范圍。

對大豆分離蛋白進行功能改性是目前國內(nèi)外研究的熱點之一,主要的改性方法有物理改性、化學改性、酶法改性等[4]。物理改性雖然具有安全性好、作用時間短及對營養(yǎng)性質影響較小等優(yōu)點,但改性效果并不十分明顯;化學改性出于安全性的考慮,多采用基礎理論的分析手段;酶法改性作用效果顯著且安全可靠,但動物酶和植物酶因其提取生產(chǎn)復雜,價格昂貴,不適合工業(yè)化生產(chǎn)。而通過乳酸菌發(fā)酵技術,不僅能提高食品營養(yǎng)價值,改善風味,同時提高食品保藏性和附加值,目前研究表明通過控制乳酸菌在豆乳中的產(chǎn)酸能力,可以有效地改善大豆蛋白的凝膠特性[5],楊小佳等[6]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)豆粕在固態(tài)發(fā)酵過程中,微生物與其所產(chǎn)蛋白酶參與了大豆蛋白的降解活動,游離氨基酸含量增多,而且改變了大豆蛋白的結構,從而改善了大豆蛋白的功能性質。劉佳等[7]使用嗜酸乳桿菌發(fā)酵大豆分離蛋白后,溶解性、吸油率均得到提高。張鵬飛等[8]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)微生物發(fā)酵的豆乳,大豆抗營養(yǎng)因子含量降低,消化性有所提高,并通過改變氨基酸組成改善了大豆蛋白的營養(yǎng)品質。

為了尋求更安全、方便的改善大豆分離蛋白功能性質的方法,使用植物乳桿菌液態(tài)發(fā)酵,研究植物乳桿菌發(fā)酵對大豆分離蛋白功能性質的改變情況,為改善大豆分離蛋白功能性質的研發(fā)和生產(chǎn)提供一定的理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

植物乳桿菌(Lactobacillusplantrum)東北農(nóng)業(yè)大學食品學院實驗室保存菌種;脫脂豆粕哈高科大豆食品有限公司;MRS培養(yǎng)基天津市津東天正精細化學試劑廠;鹽酸、氫氧化鈉、牛血清蛋白、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS)、Tris(三羥甲基氨基甲烷)均為分析純。

PB-10型精密酸度計 上海儀電科學儀器股份有限公司;UV-8000A紫外分光光度計上海市元析儀器有限公司;HZQ-X100振蕩培養(yǎng)箱哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司;TA-XT plus型質構儀北京恒峰瑞創(chuàng)科技發(fā)展有限公司;ALPHAL-2 LD plus冷凍干燥德國Martin Christ公司;BIO-RAD電泳儀美國BIO-RAD公司;KJELTEC 8400型全自動凱氏定氮儀丹麥FOSS公司。

1.2實驗方法

1.2.1工藝流程脫脂豆粕→粉碎→過篩(80目標準篩)→磨漿去渣(按1∶12的料液比與水混合)→殺菌(95 ℃,10 min)→冷卻→接入發(fā)酵劑→每隔2 h取樣→堿溶酸沉[3]→透析除鹽→冷凍凍干→大豆蛋白粉

1.2.2乳酸菌發(fā)酵脫脂豆乳樣品制備(1)菌種活化:將乳酸菌按3%(體積比)接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng),活化1～3次,使培養(yǎng)時間在12～18 h內(nèi)活菌數(shù)達到1×108cfu/mL以上。(2)菌種擴大培養(yǎng):取MRS液體培養(yǎng)基中的菌種接種于脫脂豆乳培養(yǎng)基中,37 ℃靜止培養(yǎng)18 h得到乳酸菌發(fā)酵種子液。(3)發(fā)酵樣品的制備:經(jīng)粉碎過篩后的脫脂豆粉按1∶12的料液比加入蒸餾水,打漿過濾后95 ℃滅菌10 min,接種5%(體積比)的上述乳酸菌發(fā)酵種子液,37 ℃培養(yǎng),每隔2 h取樣。

1.2.3測定方法

1.2.3.1基本指標蛋白質含量的測定:依據(jù)GB/T 5009.5-2010。水分含量的測定:依據(jù)GB/T 5009.3-2010?；曳值臏y定:依據(jù)GB/T 5009.4-2010。粗脂肪的測定:依據(jù)GB/T 14772-2008。粗纖維的測定:依據(jù)GB/T 5009.10-2003。

1.2.3.2測定pH測定PB-10酸度計直接測定。

1.2.3.3活菌計數(shù)將發(fā)酵樣品用滅菌生理鹽水梯度稀釋至一定倍數(shù)后采用MRS瓊脂培養(yǎng)基平板傾注法,37 ℃培養(yǎng)72 h計菌落總數(shù),測定活菌數(shù)。

1.2.3.4溶解性測定參考文獻[9]，將凍干后的蛋白粉20 mg溶解于10 mL去離子水中,室溫下攪拌1 h,10000×g離心20 min。采用Lowry法測定上清液中蛋白質含量,以牛血清白蛋白為標準物繪制標準曲線。蛋白質的溶解度表示為上清液蛋白含量占總蛋白含量的百分比。

1.2.3.6持水性和持油性的測定方法準確稱取蛋白樣品0.2 g置于離心管中,記錄離心管和蛋白的總質量為m1,緩慢加入4 g的去離子水或4 g大豆油,漩渦震蕩,靜止放置30 min后,1600×g離心20 min,去除上清液,記錄離心管、蛋白及水(或油)的總重量為m2(m3)。

持水性或持油性按下式計算:

1.2.3.7凝膠強度的測定配制12%(v/w)的蛋白溶液,90 ℃水浴加熱30 min后,冷卻至室溫,在4 ℃冰箱內(nèi)放置12 h,制得凝膠用于測定凝膠強度。用質構儀測定凝膠強度。測定模式為T.P.A,參數(shù)設置:測試前探頭速度:5.0 mm/s,探頭測試速度:2.0 mm/s,測試后探頭速度:5.0 mm/s,選用的探頭為p 0.5,下壓距離為凝膠高度的50%,引發(fā)力為5 g。

1.2.3.8SDS-PAGE凝膠電泳的測定參考Laemmli[11]的SDS不連續(xù)電泳方法并做了一定程度修改。分離膠濃度12%(w/v),濃縮膠5%(w/v)。樣品濃度為2 mg/mL,樣品加樣量為10 μL。電泳進行時恒壓,濃縮膠內(nèi)電壓80 V,樣品進入分離膠后將電壓改為120 V:固定,染色,脫色,電泳成像儀拍照分析。

1.2.3.9統(tǒng)計分析方法所有實驗重復3次,結果表示為均值±標準偏差。采用SPSS 15.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。3組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)的Duncan’s 法進行兩兩比較分析,顯著性水平同樣設定為0.05。

表1　脫脂豆粕基本指標Table 1　The basic indicators of defatted soybean flakes

2　結果與討論

2.1脫脂豆粕基本指標

脫脂豆粕基本指標如表1所示，其中粗蛋白質含量達55.52%。

2.2發(fā)酵過程中pH變化和生長性能

將植物乳桿菌菌株活化,擴大培養(yǎng)后,以5%的接種量接種于脫脂豆乳中,于37 ℃的條件下培養(yǎng),每隔2 h進行pH和活菌數(shù)的測定,結果見圖1。研究表明,大豆制品特別是豆乳是乳酸菌生長的完全培養(yǎng)基[12],其中一些成分,例如低聚糖、氨基酸等均可促進乳酸菌的生長[13]。由圖1表明,植物乳桿菌隨著發(fā)酵時間的延長,pH不斷降低,在發(fā)酵8 h時pH達到4.6,隨后pH降低緩慢。植物乳桿菌在脫脂豆乳中達到了較高的活菌數(shù),活菌數(shù)在8 h達到最高值,隨著發(fā)酵時間的延長,活菌數(shù)有所下降,其活菌數(shù)最高達到8.85×108cfu/mL。

圖1　脫脂豆粕乳酸菌發(fā)酵過程中pH和活菌數(shù)的變化Fig.1　Changes of pH and the viable counts basis of lactic acid bacteria in defatted soybean flakes during fermentation注：標注不同字母表示有顯著性差異 (p<0.05)，圖2～圖5同。

2.3發(fā)酵對大豆分離蛋白溶解性的影響

蛋白含量標準曲線的線性方程為y=0.0391x-0.0403,回歸系數(shù)R2=0.9992,線性良好,因此可通過該標準曲線計算出SPI溶液中蛋白質的濃度。

以脫脂豆粕為原料,經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵,每隔2 h取樣提取大豆分離蛋白,對所提蛋白測定其溶解性。結果如圖2。研究表明,在豆粕發(fā)酵過程中,由于乳酸菌所產(chǎn)蛋白酶的酶解作用,部分大豆蛋白被降解,形成了分子量較小的肽類物質,所以其蛋白溶解性比原始豆粕中大豆蛋白的高[6]。由圖2表明,豆粕經(jīng)發(fā)酵后,大豆蛋白的溶解性均高于原始豆粕中大豆蛋白,在發(fā)酵達到8 h時,蛋白溶解性顯著高于其他組(p<0.05),即使在發(fā)酵10 h時,發(fā)酵液pH達到大豆蛋白的等電點(pH4.5左右),其溶解性也遠高于原始豆粕中大豆蛋白。隨發(fā)酵時間延長,大豆蛋白溶解性有下降的趨勢,這是由于當乳酸菌生長到一定時間后,菌群大量繁殖,所消耗的營養(yǎng)物質的速度增大,到發(fā)酵后期,豆粕中的營養(yǎng)物質不足以使乳酸菌產(chǎn)蛋白酶,蛋白酶活力也相對減少所導致的,這與吳暉[14]等人研究結果一致。

圖2　發(fā)酵過程中大豆分離蛋白的溶解性Fig.2　The solubility of soybean protein during fermentation

2.4發(fā)酵對分離蛋白乳化性EAI和乳化穩(wěn)定性ESI的影響

以脫脂豆粕為原料,通過植物乳桿菌發(fā)酵,每隔2 h取樣提取蛋白,對所提蛋白分別測量了乳化性EAI和乳化穩(wěn)定性ESI,結果如圖3所示。從圖3中可以看出,經(jīng)發(fā)酵后提取的蛋白乳化性顯著高于原始豆粕中的蛋白(p<0.05)。當發(fā)酵6 h左右時,所提蛋白的乳化性達到最高,但在發(fā)酵6～10 h之間，蛋白的乳化性差異不顯著(p>0.05)。乳化性在一定程度上隨發(fā)酵時間增長而有所增加,之后乳化性趨于穩(wěn)定?？赡苁且驗橥ㄟ^微生物的代謝作用,對氨基酸和小肽進行移接、重排和分泌[15],多肽數(shù)量增加,蛋白中疏水性氨基酸側鏈外露,蛋白質分子靜電荷數(shù)量上升[16]。

而原始豆粕中蛋白乳化穩(wěn)定性顯著高于發(fā)酵后提取的蛋白(p<0.05),豆粕經(jīng)發(fā)酵后提取的蛋白乳化穩(wěn)定性不好。未發(fā)酵豆乳未經(jīng)過微生物發(fā)酵改性,所以分子中疏水區(qū)域結構更穩(wěn)定,而經(jīng)過改性后大豆蛋白的分子中疏水區(qū)域結構遭到破壞,乳化穩(wěn)定性不高[17]。

圖3　發(fā)酵過程中大豆分離蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性Fig.3　The EAI and ESI of soybean protein during fermentation

2.5發(fā)酵對分離蛋白凝膠強度的影響

以脫脂豆粕為原料,通過植物乳桿菌發(fā)酵,每隔2 h取樣提取蛋白,對所提蛋白測量了凝膠強度,結果如圖4所示。從圖中可以看出發(fā)酵2 h時所提的蛋白凝膠強度顯著高于其他組(p<0.05),經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后提取的蛋白能快速到達凝膠點[5],并隨發(fā)酵時間增長凝膠強度有所降低。可能是由于乳酸菌發(fā)酵,產(chǎn)生大量有機酸,破壞蛋白質結構,導致三維網(wǎng)狀結構不穩(wěn)定[18]。

圖4　發(fā)酵過程中大豆分離蛋白的凝膠強度Fig.4　The gel strength of soybean protein during fermentation

2.6發(fā)酵對分離蛋白持水性及持油性的影響

以脫脂豆粕為原料,通過植物乳桿菌發(fā)酵,每隔2 h取樣提取蛋白,對所提蛋白測量了持水性及持油性。與未發(fā)酵提取的蛋白相比,發(fā)酵2 h時提取的蛋白持水性顯著提高，持水性是蛋白與水相互作用的一個重要體現(xiàn),發(fā)酵可能降低了蛋白粒度,有利于對水分子的捆綁,隨發(fā)酵時間的延長，持水性有所下降,可能是發(fā)酵導致蛋白質分子結構變化,持水能力下降導致。與未經(jīng)發(fā)酵所提取的蛋白相比，發(fā)酵8 h時提取的蛋白持油性顯著提高(p<0.05)。但經(jīng)發(fā)酵后的蛋白持水性和持油性提高幅度不大。

圖5　發(fā)酵過程中大豆分離蛋白的持水性和持油性Fig.5　The water retention and oil retention of soybean protein during fermentation

2.7發(fā)酵對分離蛋白樣品的SDS-PAGE分析

原始豆粕提取的大豆分離蛋白和經(jīng)發(fā)酵后提取的蛋白以及標準蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜見圖6。根據(jù)電泳圖譜反映發(fā)酵處理對大豆分離蛋白亞基組成的影響。左數(shù)第二條泳道(0 h)是原始豆粕提取的大豆分離蛋白,可見蛋白結構比較完整,其中α′、α和β是7S亞基,A和B分別是11S的酸性亞基和堿性亞基[19]。

經(jīng)乳酸菌液態(tài)發(fā)酵后,大豆分離蛋白分子量分布有明顯的變化,原始豆粕中的蛋白質分子量主要分布在44.3～97.2 ku的范圍內(nèi),經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后,大分子量蛋白質被降解后,分子量主要分布在29～44.3 ku的范圍內(nèi),并且在44.3～66.4 ku的范圍內(nèi),蛋白質分子幾乎被完全降解,在29 ku和44.3 ku之間出現(xiàn)新條帶。說明乳酸菌所產(chǎn)蛋白酶具有一定的降解能力。在乳酸菌發(fā)酵過程中,大豆蛋白中7S亞基在6 h和8 h條帶較淺,其中β-亞基幾乎消失,而11S條帶幾乎無變化,這說明豆粕中7S球蛋白比11S蛋白更易于降解[6],這與石慧[20]等人研究結果基本一致。

圖6　發(fā)酵過程中大豆分離蛋白的 SDS-PAGE電泳圖譜Fig.6　SDS-PAGE electrophoresis patterns of soybean protein during fermentation注:M為標準蛋白,0 h為未經(jīng)發(fā)酵處理樣品, 2、4、6、8、10 h為發(fā)酵處理樣品。

3　結論

以脫脂豆粕為原料,通過植物乳桿菌液態(tài)發(fā)酵,經(jīng)研究表明脫脂豆粕乳適宜乳酸菌生長,發(fā)酵周期短,活菌數(shù)最高達到8.85×108cfu/mL。發(fā)酵0、2、4、6、8、10 h后提取大豆分離蛋白進行功能性質比較,結果表明,蛋白溶解度隨發(fā)酵時間增長而增大,在發(fā)酵8 h時,溶解度顯著性高于其他組(p<0.05)，豆粕經(jīng)發(fā)酵處理的蛋白乳化性均顯著性高于未發(fā)酵處理的蛋白乳化性(p<0.05)，而未發(fā)酵處理的蛋白乳化穩(wěn)定性顯著高于發(fā)酵后提取的蛋白乳化穩(wěn)定性(p<0.05)。蛋白質凝膠強度在發(fā)酵2 h顯著性高于其他組(p<0.05)，之后隨發(fā)酵時間的延長有所降低。經(jīng)發(fā)酵后蛋白的持水性在發(fā)酵2 h時達到最高，持油性在發(fā)酵8 h時達到最高，經(jīng)發(fā)酵后的蛋白持水性和持油性與未發(fā)酵蛋白相比提高幅度不大。經(jīng)電泳分析發(fā)酵作用對分離蛋白7S組分影響較大,對11S組分影響較小,在29.0～44.3 ku出現(xiàn)新條帶,說明發(fā)酵作用使蛋白中大分子量蛋白降解成小分子量蛋白。

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Effect of fermentation by lactobacillus plantrum on functional properties of soybean protein

CUI Xian1,LIU Rong-xu1,JIANG Fan1,SONG Xiao-xiao1,LIU Jia-tong1,ZHANG Li-li1,HAN Jian-chun1,2,*

(1.College of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.The National Research Center of Soybean Engineering and Technology,Harbin 150000,China)

The defatted soybean meal was used as raw materials,and suffered liquid fermentation byLactobacillus. Then soybean protein was extracted from fermented solubility. The emulsification,emulsion stability,gel strength,water holding capacity,oil holding capacity and some other functional properties of soybean protein were determined. The results indicated that the solubility,EAI,gel strength,water holding capacity and oil holding capacity were significantly improved after fermentation(p<0.05),ESI was significantly lower(p<0.05) while the water holding capacity and the oil holding capacity had little changes during this process. SDS-PAGE electrophoresis demonstrated that soy protein after fermentation emergence of new bangs between 29.0～44.3 ku,high molecular weight proteins of soybean were degraded into small molecular weight proteins,among which fermentation had a greater impact on the 7S component and less impact on the 11S component. The test showed that lactobacillus can effectively improve the functional properties of soy protein.

lactobacillusplantrum;soybean protein;functional properties;fermentation

2015-05-19

崔憲(1989-)，男，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏，E-mail：cuixianneau@163.com。

韓建春(1973-)，男，博士，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工，E-mail：hanjianchun@hotmail.com。

國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃)項目(2013AA102208)，東北農(nóng)業(yè)大學“青年才俊”項目(14QC42)。

TS229

A

1002-0306(2016)03-0177-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.029