一株產(chǎn)藍色素菌株的篩選及初步鑒定

左　勇,江　鵬,葉碧霞,王小龍,傅　彬,楊小龍,張　晶

(四川理工學院生物工程學院,四川自貢 643000)

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一株產(chǎn)藍色素菌株的篩選及初步鑒定

左勇,江鵬,葉碧霞,王小龍,傅彬,楊小龍,張晶

(四川理工學院生物工程學院,四川自貢 643000)

從自貢地區(qū)土壤中分離得到一株產(chǎn)藍色素細菌,編號為T2013。通過形態(tài)特征觀察、生理生化實驗分析和全細胞脂肪酸檢測以及16S rDNA比對分析,確定了該細菌為杜搟氏菌屬的一種。通過系統(tǒng)進化樹顯示該細菌與菌株Duganellanigrescensstrain YIM H16(EF584756)具有較高的同源性。T2013可能為新種,命名為Duganellasp.T2013。

細菌,鑒定,藍色素,16S rDNA

色素作為一種食品添加劑,必須嚴格保證無毒(低毒)和安全。如今,大多數(shù)合成色素因有致癌、致畸的作用,其使用受到限制,開發(fā)天然、綠色、無毒、營養(yǎng)的天然色素,將成為食品科技工作者的重要任務(wù)之一。

微生物色素是一種由微生物代謝產(chǎn)生的天然色素,其生產(chǎn)具有不受環(huán)境、空間和季節(jié)等因素限制的優(yōu)越性[1]。研究表明,許多微生物色素除了可以作為潛在的食品添加劑(由于其被認為無毒或安全性高)外,還具有多種營養(yǎng)或藥用等價值[2-4]。自然界中,微生物生產(chǎn)色素種類較為豐富,但發(fā)酵產(chǎn)生藍色素卻較罕見[5]。目前,國內(nèi)研究最多的是鏈霉菌產(chǎn)生的藍色素[6],除此之外,還有許多產(chǎn)藍色素的菌株,如紫色色桿菌屬、詹森菌屬、假單胞菌屬、交替假單胞菌屬、杜搟氏菌屬等[7-12]。

本研究擬從土壤中分離得到產(chǎn)藍色素的菌株,再對目的菌株進行形態(tài)特征觀察、生理生化實驗分析和全細胞脂肪酸檢測以及系統(tǒng)發(fā)育樹分析,確定目的菌株分類地位,為進一步研究和應(yīng)用該菌株奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

土樣四川某坡地土壤；TaqDNA polymerase、dNTPs、DL2000TMDNA Marker寶生物工程(大連)有限公司;其余試劑和藥品均為國產(chǎn)分析純。PCR擴增使用通用引物27F和1492R[9]進行擴增。通用引物27F序列為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,和1492R序列為5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)和高氏I號培養(yǎng)基[13]。

BD-30生物顯微鏡深圳市博視達光學儀器有限公司;DYY-12型電泳儀北京六一儀器廠;Bio-best200E凝膠成像分析系統(tǒng)美國西蒙公司;PCR儀美國Thermo公司;6890N氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀安捷倫公司;D3024臺式高速微量(冷凍型)離心機大龍創(chuàng)新實驗儀器(北京)有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1樣品的處理在無菌條件下將土壤研細后,稱取10.0 g土壤于90 mL帶玻璃珠的無菌水中,振蕩20 min,靜置1 min。

1.2.2篩選方法采用稀釋涂布法篩選菌株,取10-3、10-4、10-5的稀釋液各0.1 mL進行平板涂布。置于30 ℃下培養(yǎng)24 h,挑取產(chǎn)色素的(有顏色)單菌落進行劃線分離得到純種,并保存于相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上。選取產(chǎn)藍色素的菌株作為目的菌株。

1.2.3細菌全細胞脂肪酸鑒定先將菌株T2013采用劃線法(劃四個區(qū))接種在含牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的平板上,30 ℃倒置培養(yǎng),1 d。再用無菌竹簽刮取40 mg第三區(qū)生長培養(yǎng)物(40 mg細菌),置于8mL的螺口玻璃管中,通過分離提取脂肪酸以及甲基化后經(jīng)氣相色譜分析脂肪酸組分。具體操作方法按張文俊[14]等人的方法進行實驗。

1.2.4細菌形態(tài)觀察及生理生化實驗通過平板法觀察菌落特征,采用光學顯微觀察菌體特征。選取吲哚實驗、V-P實驗、甲基紅實驗、反硝化實驗、硫化氫實驗、接觸酶實驗、淀粉水解實驗、明膠液化實驗及碳源利用等生理生化實驗對菌株進行鑒定,具體方法參見東秀珠等編著的《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[15]、R.E.布坎南和N.E.吉本斯等編著《伯杰細菌鑒定手冊》[16]。

1.2.516S rDNA的鑒定細菌T2013基因組DNA的提取采用水煮法[17-18]。挑取2環(huán)斜面活化24 h的菌株,接種于盛有50 mL液體高氏I號培養(yǎng)基的250 mL的搖瓶中,30 ℃,200 r/min,培養(yǎng)24 h。吸取1 mL培養(yǎng)液于1.5 mL的無菌離心管中,7000 r/min,離心2 min。棄上清,加入200 μL ddH2O,100 ℃恒溫15 min。10000 r/min離心10 min。將上清液作為PCR擴增模板。

PCR擴增體系(50 μL反應(yīng)體系、冰上操作)為:10×PCR緩沖液(Mg2+free)5 μL、dNTP MIX(2.5 mmol/L)4 μL、MgCl2(25 mmol/L)4 μL、引物27F(10 pmol·μL-1)0.5 μL、引物1492R(10 pmol·μL-1)0.5 μL、基因組DNA模板 2 μL、DNA Taq酶(5 U·μL-1)0.5 μL、ddH2O 33.5 μL。

PCR擴增循環(huán)參數(shù)為:95 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,共35個循環(huán),反應(yīng)前預變性(95 ℃)5 min,循環(huán)結(jié)束后應(yīng)延伸10 min(72 ℃)。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測并送上海杰李生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.2.6系統(tǒng)發(fā)育樹分析將所測基因組序列的拼接序列在NCBI網(wǎng)頁上的GenBank數(shù)據(jù)庫中進行相似性分析,并下載相近菌種的16S rDNA序列,以“.Fasta”格式保存。用Clustal X軟件進行序列比對,以MEGA5.05軟件進行數(shù)據(jù)分析以及采用Neighbor-Joining(N-J)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(自舉1000次),分支聚類的穩(wěn)定性用Boot-strap方法進行評價。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株的篩選

在所取的100多個土樣中分離得到52株產(chǎn)色素的菌株,其中大多數(shù)菌株產(chǎn)紅色、紫紅色、紫色、棕紅色、褐色、橙色或橙紅色色素,其中1株產(chǎn)綠色素,有2株產(chǎn)藍色素,篩選得到的2株產(chǎn)藍色素的菌株如圖1所示。

圖1　兩株產(chǎn)藍色素的菌株Fig.1　Two strains produce blue pigment

通過形態(tài)特征觀察,左圖可能為放線菌(編號為D2013),右圖可能為細菌(編號為T2013)。由于細菌T2013的發(fā)酵周期短,放線菌D2013發(fā)酵周期長,且放線菌D2013產(chǎn)色素條件苛刻,因此以細菌T2013為后續(xù)研究對象。

2.2菌株T2013的形態(tài)特征

以產(chǎn)藍色素的細菌T2013作為目的菌株進行平板劃線分離培養(yǎng)及形體的顯微觀察,然后對挑取單菌落進行液態(tài)培養(yǎng),培養(yǎng)結(jié)束后對代謝產(chǎn)生的色素進行提取,結(jié)果如圖2所示。

圖2　菌株T2013的菌體、菌落照片F(xiàn)ig.2　Micrograph of strain T2013 and its colonies

由圖2中的左圖(高氏I號中菌落照片)可知,在高氏I號培養(yǎng)基中菌落光滑、邊緣較整齊、濕潤、呈紫色或藍紫色、易挑起,培養(yǎng)后期菌體較干燥,菌體呈藍色、藍黑或藍紫色;圖2中的右圖(結(jié)晶紫染色顯微照片)可知菌株T2013為短桿菌。

2.3菌株T2013的生理生化鑒定

2.3.1菌株T2013的脂肪酸鑒定菌株T2013的全細胞脂肪酸經(jīng)抽提分離及甲基化后,通過高效液相色譜的測定脂肪酸的成分。測定結(jié)果表明菌株T2013含有的脂肪酸為C10∶0(0.26%),3-OH C10∶0(3.64%),2-OH C12∶0(1.93%),3-OH C12∶0(3.41%),3-OH C12∶1(0.10%),C14∶0(0.65%),C16∶0(34.6%),C17∶0 cyclo(9.15%),C17∶0(0.25%),C17∶1 w7c(0.27%),C18∶0(0.36%),C19∶0 cyclo w8c(0.44%)。T2013的全細胞脂肪酸成分與杜搟氏菌的一致。

2.3.2菌株T2013的生理生化鑒定菌株T2013革蘭氏染色呈陰性,接觸酶實驗、明膠液化實驗、淀粉水解等實驗均為陽性,產(chǎn)H2S實驗、吲哚實驗、V-P實驗、甲基紅實驗、反硝化實驗等均為陰性。菌落形態(tài)較小,呈藍紫色,圓形,低突起,光滑,較濕,易挑取。T2013菌株于高氏I號培養(yǎng)基中培養(yǎng),最適溫度在28 ℃左右?？衫玫奶荚从欣w維二糖、D-(+)木糖、七葉靈、水楊苷、葡萄糖、蔗糖及D-甘露糖等。(具體見表1)。

表1　菌株T2013的生理生化特征Table 1　The physiological and biochemical characteristics of the strain T2013

注:“+”表示該反應(yīng)呈陽性;“-” 表示該反應(yīng)呈陰性。

通過生化實驗,并結(jié)合形態(tài)學鑒定結(jié)果,菌株T2013為一株產(chǎn)藍色素的杜搟氏菌。

2.4PCR產(chǎn)物電泳圖

從圖3可知該菌株的16S rDNA產(chǎn)物的PCR產(chǎn)物的堿基對大約為1400 bp。PCR產(chǎn)物進行序列分析。注:圖3中1為DNA Marker,2為陰性對照和3為菌株T2013 16S rDNA的PCR產(chǎn)物。所使用的DNA Marker為DL2000。

圖3　PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.3　The electrophoresis of PCR products

2.5菌株T2013的16S rDNA的序列測定

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后,于上海杰李生物科技有限公司測序。將所測序列經(jīng)過拼接后得到的1321bp,堿基序列如下:

將所測基因組序列的拼接序列在 NCBI 網(wǎng)頁上的 GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行相似性分析及注冊細菌T2013 DNA序列的登錄號。菌株T2013與杜搟氏菌的同源性較高,從97% 到 99%,。菌株T2013的16S rDNA序列在GenBank的核酸序列數(shù)據(jù)庫中的為登錄號為KP250653。

2.6系統(tǒng)發(fā)育分析

由圖4可知,菌株T2013與DuganellanigrescensstrainYIM H16(EF584756)、Pseudoduganellasp. NI28(KM087999)、Duganellasp. BAB-3519(KJ871607)的相似性較高,與DuganellanigrescensstrainYIM H16的相似最大,可信度較高。據(jù)此可知菌株T2013屬于杜搟氏菌屬,Duganellasp.T2013很可能是杜搟氏菌屬一個新種,命名為Duganellasp.T2013。

圖4　菌株T2013的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4　Phylogenetic tree of strain T2013

3　結(jié)論

本研究組從土壤中分離了一株產(chǎn)藍色素的細菌T2013,經(jīng)形態(tài)觀察及革蘭氏染色,發(fā)現(xiàn)其為革蘭氏陰性桿菌,經(jīng)形態(tài)特征的觀察和生理生化實驗分析以及16S rDNA 基因序列比對及系統(tǒng)進化樹分析確定了該細菌是一株杜搟氏菌。該菌株能夠產(chǎn)生胞內(nèi)藍色素,其產(chǎn)生的藍色素的性質(zhì)及安全性還有待進一步研究。

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Isolation and preliminary identification of strains producing blue pigment

ZUO Yong,JIANG Peng,YE Bi-xia,WANG Xiao-long,FU Bin,YANG Xiao-long,ZHANG Jing

(College of Bioengineering,Sichuan University of Science and Engineering,Zigong 643000,China)

A bacteria T2013 producing blue pigment was isolated from the soil in Zigong. According to morphological observation,biochemical and physiological characteristics experiment,whole-cell fatty acid detection and 16S rDNA sequence alignment,the strain was identified as one strain of the genusDuganellasp.. Phylogenetic analysis showed that strain T2013 had high homology withDuganellanigrescensstrainYIM H16(EF584756).This strain isolated was likely to be a new member of theDuganellasp.,tentatively namedDuganellasp. T2013.

bacteria;strain identification;blue pigment;16S rDNA

2015-04-23

左勇(1972-)，男，碩士，教授，主要從事發(fā)酵工程方面的研究， E-mail：sgzuoyong@tom.com。

四川省教育廳成果轉(zhuǎn)化項目(11ZZ016)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)03-0166-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.027