擬南芥阿拉伯糖-5-磷酸異構(gòu)酶的原核表達(dá)、純化及酶催化特性

屈亞平，張智俊，王超莉，王蕾，吳林軍

浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 臨安 311300

工業(yè)生物技術(shù)

擬南芥阿拉伯糖-5-磷酸異構(gòu)酶的原核表達(dá)、純化及酶催化特性

屈亞平，張智俊，王超莉，王蕾，吳林軍

浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 臨安 311300

屈亞平， 張智俊， 王超莉， 等. 擬南芥阿拉伯糖-5-磷酸異構(gòu)酶的原核表達(dá)、純化及酶催化特性. 生物工程學(xué)報， 2016，32（8）: 1060-1069.

Qu YP， Zhang ZJ， Wang CL， et al. Expression， purification and characterization of arabinose-5-phosphate isomerase from Arabidopsis thaliana. Chin J Biotech， 2016， 32（8）: 1060-1069.

阿拉伯糖-5-磷酸異構(gòu)酶 （KdsD） 是 2-酮-3-脫氧辛糖酸 （KDO） 生物合成途徑的第一個關(guān)鍵限速酶，通過無縫克隆技術(shù)將擬南芥KdsD基因構(gòu)建至原核表達(dá)載體pET-HTT，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)，在大腸桿菌BL21 （DE3）中獲得了大量重組蛋白的可溶性表達(dá)；表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA親和層析和分子篩層析 （SEC） 方法進(jìn)行酶蛋白的分離純化步驟，得到純度85%以上的高純度酶；分子篩層析結(jié)果發(fā)現(xiàn)純化后的目的蛋白KdsD在溶液中主要以多聚體、二聚體和單體形式存在，這同微生物來源KdsD酶在溶液中以四聚體形式存在很大差異；進(jìn)一步使用Western blotting和MALDI-TOF MASS技術(shù)對純化的蛋白進(jìn)行鑒定；測定了擬南芥KdsD酶學(xué)性質(zhì)，證明該酶催化反應(yīng)的最適pH值為8.0，最適作用溫度為37 ℃，各種金屬離子在低濃度均對酶活性存在不同程度的抑制作用，其中以Co2+、Cd2+對酶活性的抑制作用最強(qiáng)，而5 mmol/L金屬螯合劑EDTA對酶有激活作用。此外，以阿拉伯糖-5-磷酸 （A5P） 為底物時，擬南芥KdsD酶動力學(xué)常數(shù)Vmax和Km值分別為0.18 mmol/（L·min）、0.16 mmol/L，比較發(fā)現(xiàn)該酶與底物的親和性高于大腸桿菌KdsD。以上研究結(jié)果為KdsD蛋白結(jié)構(gòu)與功能及其在新型抗生素研制領(lǐng)域中的工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

擬南芥，阿拉伯糖-5-磷酸異構(gòu)酶，重組表達(dá)，分離純化，MALDI-TOF MASS，酶學(xué)性質(zhì)

阿拉伯糖-5-磷酸異構(gòu)酶 （Arabinose-5-phosphate isomerase，KdsD，EC 5.3.1.13），在自然界中分布廣泛，參與生物體糖代謝，在微生物和植物糖代謝方面具有重要價值。KdsD是2-酮-3-脫氧辛糖酸 （KDO） 生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，可以催化核酮糖-5-磷酸 （D-ribulose 5-phosphate，Ru5P） 的異構(gòu)化，從而產(chǎn)生KDO生物合成途徑中的第一個中間產(chǎn)物 D-阿拉伯糖-5-磷酸（D-arabinose 5-phosphate，A5P）［1］。因此，該酶是KDO生物合成途徑中的上游關(guān)鍵限速 酶［2］。最初研究發(fā)現(xiàn)，KDO是革蘭氏陰性菌 （Gˉ） 脂多糖 （LPS） 中的八碳糖［3-5］，可將LPS中O-抗原與類脂A鏈接并共同嵌入到細(xì)胞外膜形成完整的細(xì)胞壁［6］。此外，在酵母及動物細(xì)胞中還未有KDO存在的證據(jù)。因此，阻斷細(xì)胞壁中 KDO的合成會導(dǎo)致Gˉ細(xì)胞生長的停滯，最終可達(dá)到抑制Gˉ細(xì)胞生長的目的［4］。鑒于該途徑在Gˉ細(xì)胞中非常保守，以KdsD為靶標(biāo)及KDO衍生物的藥物分子設(shè)計和開發(fā)，可達(dá)到抑制Gˉ細(xì)胞生長并降低病原菌耐藥性，這就為新型抗生素的研發(fā)提供了新的思路。已有研究報道，KDO類似物具有抑制Gˉ細(xì)胞生長的作用；而基于KDO代謝途徑中 KdsD及其他相關(guān)酶作為藥物靶標(biāo)進(jìn)行藥物開發(fā)的研究也日益受到重視［6］。

近年來發(fā)現(xiàn)KDO同樣存在于高等植物與藻類植物果膠多糖中［4，7-9］，主要參與植物細(xì)胞壁的構(gòu)成［10］。果膠作為植物體內(nèi)含量豐富的一種多糖，具有優(yōu)良的乳化性和凝膠性及多種生理功效，可以作為一種新的藥物資源和保健食品功能因子，在醫(yī)學(xué)及食品等行業(yè)有著很廣泛的用途［11］。果膠類多糖中的鼠李半乳糖醛酸聚糖-II （Rhamnogalacturonans II，RG-II）［12-13］至少由12種不同成分的糖基殘基組成，盡管KDO是一種少見的八碳糖，但其卻是RG-II構(gòu)成所必需的組分［5］。因此，在植物細(xì)胞中KdsD酶對于果膠類多糖的合成具有重要作用。類似的，為了減輕病原菌及其耐藥性對農(nóng)作物產(chǎn)量的影響，減少經(jīng)濟(jì)損失，基于KdsD及其相關(guān)酶為靶標(biāo)的新型農(nóng)藥開發(fā)，對于保證農(nóng)業(yè)健康發(fā)展具有重要意義，但植物KdsD相關(guān)研究尚處于起步階段，阻礙了KdsD酶的進(jìn)一步的應(yīng)用。

在大腸桿菌Escherichia coli中，旁系同源KdsD和GutQ基因可編碼KdsD，該酶具有328個氨基酸殘基，通過對大腸桿菌和綠膿桿菌KdsD基因定點(diǎn)突變確定了與催化相關(guān)的重要的保守殘基：大腸桿菌的Lys59、His88和His193對應(yīng)于綠膿桿菌的Lys56、His85和His190［14-16］。進(jìn)一步利用原核表達(dá)及分離純化，該酶晶體結(jié)構(gòu)于2010年已經(jīng)被成功解析，空間為同源四聚體［17］。每個KdsD亞基包含兩個不同的結(jié)構(gòu)域：N-末端糖異構(gòu)酶 （SIS） 結(jié)構(gòu)域，主要參與磷糖異構(gòu)化作用，以及一個未知功能的胱硫醚-β-合酶 （CBS） 結(jié)構(gòu)域。自 2000年擬南芥全基因組測序完成之后，利用擬南芥突變體來研究果膠多糖的合成和功能開始受到重視［18-20］。其中植物KDO途徑中擬南芥基因 （AtKdsD，At3g54690）已被確定［6］，但同大腸桿菌KdsD基因序列差異很大，且由于植物中KdsD蛋白尚未純化出來，基于植物來源的 KdsD酶功能及催化作用機(jī)制、酶的催化特性及其應(yīng)用等科學(xué)問題仍需深入研究。

本研究在擬南芥KdsD基因克隆的基礎(chǔ)上，著重進(jìn)行了該基因的原核表達(dá)、蛋白純化和酶學(xué)性質(zhì)研究，研究結(jié)果不僅為后續(xù)植物來源KdsD基因功能及晶體學(xué)結(jié)構(gòu)的研究奠定了基礎(chǔ)，而且對于今后植物果膠類多糖生物合成及新型植物農(nóng)藥研發(fā)具有重要參考價值。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與試劑

大腸桿菌 Escherichia coli菌株 DH5α和BL21 （DE3）、原核表達(dá)載體pET-HTT均由本實(shí)驗(yàn)室保存；Super efficiency fast seam less cloning kit購自上海德聚生物科技有限公司；DNA膠回收試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司。A5P與Ru5P購自Sigma （美國）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2儀器與設(shè)備

高壓蒸汽滅菌器 （SANYO MLS-3750）、PCR儀 （Gene Amp?PCR System 9700）、離心機(jī)（Himac CF 16RX versatile Compact Centrifuge）、PYX-DH350恒溫培養(yǎng)箱、GL-25M高速冷凍離心機(jī) （上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；AKTA純化儀器、酶標(biāo)儀。

1.2方法

1.2.1KdsD表達(dá)載體的構(gòu)建

從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得擬南芥的KdsD基因序列，設(shè)計無縫克隆引物。上游Bam HⅠ酶切位點(diǎn)引物 5′-GTATTTTCAGGGATCC ATGGGAT CTCTTCCACCGCC-3′；下游Hin d Ⅲ酶切位點(diǎn)引物 5′-GTGCGGCCGCAAGCTT GAGACCAG CTGAAACCAAAC-3′ （下劃線為酶切位點(diǎn)）。以擬南芥的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增 （20 μL）：cDNA 1.0 μL，10×緩沖液2.0 μL，dNTPs （2.5 mmol/L）2.0 μL，上、下游引物 （10 μmol/L）各1 μL，Easy Taq DNA聚合酶 （5 U/μL）0.2 μL，補(bǔ)充ddH2O 至20 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 m in；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 m in。經(jīng)PCR擴(kuò)增，純化回收，連接pET-HTT表達(dá)載體 （該載體帶有His標(biāo)簽），得到重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化至E. coli DH 5α，篩選PCR陽性克隆送上海生工進(jìn)行DNA測序。

1.2.2KdsD基因的表達(dá)和重組酶的分離純化

將構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到 E. coli BL21 （DE3） 中，挑取陽性單克隆，接種在2 m L LB液體培養(yǎng)基 （K+） 中，37 ℃搖床培養(yǎng)，OD600達(dá)到0.5-0.8時，加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，分別在 37 ℃搖床上誘導(dǎo) 3 h，在20 ℃搖床上過夜誘導(dǎo)，最后收集菌體。超聲破碎，用SDS-PAGE膠檢測蛋白表達(dá)情況。進(jìn)一步將菌株接種于 1 L LB培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。加入誘導(dǎo)劑后，菌液在20 ℃、220 r/m in條件下過夜培養(yǎng)。4 000 r/m in離心收集菌體，細(xì)胞沉淀使用含1 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl 及 5%甘油緩沖液復(fù)溶后，在超聲儀上破碎細(xì)胞，然后20 000 r/m in、4 ℃條件下離心45 m in收集上清液，并將上清轉(zhuǎn)移至鎳柱，置于搖床緩慢結(jié)合1 h后，分別用低濃度咪唑緩沖液 （20、30、40 mmol/L咪唑，200 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl） 除去雜蛋白，用高濃度咪唑緩沖液 （200 mmol/L咪唑，200 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl） 洗脫目的蛋白，經(jīng)過超濾管濃縮脫鹽后收集目的蛋白的組分；配置 20 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0），200 mmol/L NaCl緩沖溶液，平衡分子篩層析柱 （SEC） SuperoseTM12 10/300 GL柱子后，取500 μL超濾濃縮蛋白樣品上樣。SEC洗脫流速為0.5 m L/m in，并分別按照每管0.5 m L收集各洗脫峰，經(jīng)SDS-PAGE膠檢測蛋白的純度，超濾濃縮后置于-80 ℃保存。

1.2.3KdsD的Western blotting檢測及MALDITOF MS分析

Western blotting檢測：取100 μL蛋白樣品進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳，之后將分離后的蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。浸泡于20 m L的1×Detector Block solution封閉緩沖液，搖床振蕩1 h；加入10 μL his DetectorTMNickle-Ap，室溫振蕩孵育1 h；1×TBST洗膜3次，各5 min；最后用10 m L BCIP/NBT顯色1-15 m in，一旦出現(xiàn)蛋白條帶，立即用去離子水終止反應(yīng)，至膜干燥拍照。

MALDI-TOF MS分析：將目的蛋白通過電泳分離、考馬斯亮藍(lán)染色，脫色液脫色后，切割目的條帶，送上海博苑生物科技有限公司做多肽指紋圖譜鑒定分析。蛋白定量采用BCA法，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.2.4酶活性測定

酶活性測定采用半胱氨酸-咔唑法［21-22］。在96孔板中進(jìn)行活力測定，200 μL反應(yīng)混合液包括 100 mmol/m L Tris-HCl （pH 8.0），25 μL At KdsD，25 μL 2 mmol/L A 5P ，50 μL 12.5 mol/L H2SO4。At KdsD和緩沖液在37 ℃預(yù)溫育3 m in，然后加入A5P開始反應(yīng)5 m in，最后加入50 μL 12.5 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，采用半胱氨酸-咔唑法顯色，用酶標(biāo)儀測定540 nm吸光值。酶活力單位 （U）定義為：在37 ℃、pH 8.0條件下，以A5P為底物，每分鐘催化產(chǎn)生1 μmoL的Ru5P所需的酶量。所有酶活性測定結(jié)果均為 3次重復(fù)平均試驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值。

1.2.5重組酶的性質(zhì)分析

最適反應(yīng)溫度測定：將反應(yīng)溫度控制在25-65 ℃范圍內(nèi)，每間隔10 ℃下進(jìn)行酶促反應(yīng)（pH 8.0），然后測定酶活，測定結(jié)果取3次重復(fù)平均試驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值。最高酶活性設(shè)為100%，用來計算相對酶活性的變化。

最適pH測定：在37 ℃條件下，pH 6.0-9.0范圍內(nèi)每隔0.5測定酶活，每個樣品設(shè)3個平行組，結(jié)果取平均值。以最高酶活力為100%，計算相對酶活力。

金屬離子及酶抑制劑對酶活性的影響：分別取濃度為100 mmol/L的Cu2+、Zn2+、Se2+、Li+、Na+、Ca2+、M n2+、M g2+、K+、Fe3+、Co2+等12種金屬離子及金屬蛋白酶抑制劑EDTA分別與酶液混合，使離子終濃度為5 mmol/L，在最適反應(yīng)條件下測定酶活，酶活測定結(jié)果為 3次重復(fù)平均試驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值。以未經(jīng)處理的酶液的酶活力為100%，繪制酶活力金屬離子曲線。

酶的動力學(xué)常數(shù)的測定：以A5P為底物，分別配制 0.2-10 mmol/L的底物，緩沖液選取100 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0），然后在最適溫度37 ℃下反應(yīng)，測定酶活。利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，以1/［S］為橫坐標(biāo)，1/V為縱坐標(biāo)繪制曲線，通過米氏方程計算動力學(xué)常數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以擬南芥的cDNA為模板進(jìn)行無縫PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析后經(jīng)DNA膠回收試劑盒回收，獲得的目的 DNA片段直接與pET-HTT表達(dá)載體連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α，挑取陽性菌落進(jìn)行菌液PCR及測序，成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-HTT-KdsD。

2.2KdsD在E. coli中的表達(dá)及純化

將 pET-HTT-KdsD重組載體轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21 （DE3） 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)小量誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)及可溶性情況 （圖1）。發(fā)現(xiàn)一條明顯的表達(dá)條帶，接近理論分子量39 kDa，對比不同溫度蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)蛋白在20 ℃表達(dá)量較高，故在后續(xù)試驗(yàn)中使用20 ℃為蛋白最佳誘導(dǎo)表達(dá)溫度。

圖1　At KdsD在表達(dá)菌株BL21 (DE3) 中的表達(dá)Fig. 1 Prokaryotic expression of At KdsD in BL （DE3）cell. M: molecular mass standards （kDa）； 20 ℃?。≒/S）: cell pellet/supernatant induced by IPTG at 20 ℃； 37 ℃（P/S）: cell pellet/supernatant induced by IPTG at 37 ℃??；CK （P/S）: cell pellet/supernatant not induced by IPTG.

重組蛋白使用 Ni-NTA親和層析和分子篩層析兩步法進(jìn)行純化，At KdsD Ni-NTA親和層析SDS-PAGE檢測表明 （圖2）：在低濃度咪唑洗脫條件下可以很好地去除雜蛋白。在高濃度咪唑200 mmol/L洗脫條件下，可以很好洗脫出條帶單一的目的條帶。對得到的蛋白進(jìn)一步純化，SEC結(jié)果顯示：At KdsD蛋白在溶液中存在多聚體、二聚體和單體狀態(tài) （圖3A）。因水溶液中 BSA分子之間快速可逆自聚可形成少量的BSA二聚體，所以BSA是一個很好的標(biāo)記物。經(jīng)Superose TM 12 10/300 GL層析后，對比小牛血清BSA出峰位置 （二聚體D峰對應(yīng)分子量為134 kDa，單聚體E峰對應(yīng)分子為67 kDa）。分子篩層析后分管收集蛋白，經(jīng)SDS-PAGE膠檢測 （圖3B），發(fā)現(xiàn)不同的KdsD蛋白聚合狀態(tài)的電泳條帶均同KdsD理論分子量39 kDa一致，純度為85%以上。

圖2　At KdsD Ni-NTA親和層析SDS-PAGE檢測Fig. 2 SDS-PAGE analysis from Ni-NTA affinity chromatography of At KdsD. S: cell supernatant after induced； FT: liquid of protein and Ni-beads； M: molecular mass standards （kDa）； Lanes W 1-W 3: wash in the presence of 20， 30， 40 mmol/L im idazole； E: elution w ith 200 mmol/L im idazole.

2.3KdsD的W estern blotting檢測及MALDI -TOF MS分析

圖3　At KdsD分子篩層析圖 (A) 及其SDS-PAGE檢測 (B)Fig. 3 Purification of At KdsD and BSA by size exclusion chromatography （A） and SDS-PAGE of SEC （B）. （A） The peak of A is polymers of At KdsD， the peak of B is dimers or trimers of At KdsD， the peak of C is monomers of At KdsD， the peak of D is dimmers of BSA， the peak of E is monomers of BSA. （B） M: protein marker； 1-11: fractions of every 0.5 m L starting from 8 m L.

為確定獲得的融合蛋白是目的蛋白，利用his DetectorTMNickel-Ap抗體，Western blotting檢測獲得的融合蛋白，結(jié)果顯示有兩條條帶，大小約在39 kDa，基本符合上述SDS-PAGE檢測的表達(dá)條帶大小 （圖4A）。 進(jìn)一步MALDI-TOF MS分析，通過獲得肽質(zhì)量指紋圖 （PMF） 比對后發(fā)現(xiàn)（圖 4B）：來自粗帶的樣品肽段序列數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果比對得分615，分子量為38.124 kDa，等電點(diǎn)為6.56，且與目的蛋白序列匹配度更高 （用下劃線顯示），說明大量純化獲得的重組蛋白是目的蛋白At KdsD。

2.4重組酶的酶學(xué)性質(zhì)

酶活性測定結(jié)果表明該酶最適溫度為37 ℃，在37-45 ℃范圍內(nèi)酶活力較高，45 ℃以上酶活力急劇下降，而在 25 ℃時仍保持在70%以上 （圖5）；溫度為37 ℃時，該酶最適pH為8.0，屬于弱堿性酶。在pH 6.0-8.0范圍酶活性迅速增加，pH 7.0-8.5之間酶的活性穩(wěn)定在60%以上 （圖6），超出這一范圍，則酶活迅速下降。

圖4　At KdsD的Western blotting (A) 和質(zhì)譜檢測 (B)Fig. 4 Identification of recombinant protein by Western blotting （A） and mass spectrometry analysis （B）. （A）Western blotting. M: protein marker； 1: purified recombinant protein. （B） M ass spectrometry results. M atched peptides underlined were identified as At KdsD.

圖5　溫度對酶活性的影響Fig. 5 Effect of temperature on activities of recombinant enzyme. The optimal temperature of At KdsD was estimated at various temperature （25-65 ℃） in Tris-HCl buffer （100 mmol/L， pH 8.0）， and the maximum activity was taken as 100%. Results are the average of three replicates.

圖6　pH對酶活性的影響Fig. 6 Effect of pH on activities of recombinant enzyme. The optimal pH of At KdsD was estimated at various pH （6.0-9.0）. The maximum activity was taken as 100%. Results are the average of three replicates.

金屬離子及金屬蛋白酶抑制劑 EDTA對KdsD酶活影響結(jié)果顯示 （圖7），各種金屬離子對酶活性存在不同程度的抑制作用。其中以Co2+、Cd2+對酶活的抑制作用最強(qiáng)；Cu2+、Zn2+抑制作用較弱。而EDTA對酶活性有激活作用，分析認(rèn)為EDTA是通過其螯合作用減弱了金屬離子對酶活性的影響，從而對酶活性起到激活作用。以A5P為底物時，在37 ℃、pH 8.0條件下，KdsD的酶促動力學(xué)常數(shù) Vmax值為 0.18 mmol/（L·m in），Km值為0.16 mmol/L。

圖7　金屬離子及EDTA對酶活性的影響Fig. 7 Effcet of different metal ions and EDTA on At KdsD activity. Activity of KdsD as isolated was measured at 37 ℃　in the presence of various metal or EDTA （100 mmol/L Tris-HCl， pH 8.0， 2 mmol/L A5P，5 mmol/L metal or EDTA）. Results are the mean of three replicates.

3　討論

無 縫 克 隆 （Seam less cloning/in-fusion cloning）［23］是一種新的、快速、簡單的克隆方法，突破傳統(tǒng)的雙酶切再連接，只需一步重組法，即可得到高效率克隆的重組載體，唯一的區(qū)別在于引物末端和載體末端具有 13-20個同源堿基，無需酶連通過堿基互補(bǔ)配對成環(huán)即可直接用于轉(zhuǎn)化。本文通過無縫克隆技術(shù)［24］成功構(gòu)建了擬南芥KdsD基因表達(dá)載體，首次實(shí)現(xiàn)了植物該基因在大腸桿菌內(nèi)的成功表達(dá)和活性測定。研究所得 At KdsD蛋白序列，與其他文獻(xiàn)已報道的微生物序列比對分析，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌序列中關(guān)鍵的催化殘基Lys59、His88和His193對應(yīng)擬南芥的 Lys78、His107、His212是完全保守的［14-16］，但是擬南芥蛋白序列與微生物蛋白序列相似度不足30%［12］（圖8）。推測植物KdsD與微生物中的 KdsD蛋白空間結(jié)構(gòu)和催化特性可能存在一定的差異。

在酶的分離純化過程中，通過兩步法快速獲得了該蛋白的純酶液，純度達(dá)85%以上。SEC結(jié)果顯示，擬南芥KdsD在30 mmol/L Tris-HCI （pH 8.0）、200 mmo/L NaCl溶液條件下，以多種聚體、二聚體和單聚體形式存在，而微生物中KdsD的分子篩層析目的峰單一，且主要以四聚體形式存在，分析認(rèn)為植物 KdsD與微生物KdsD在溶液中存在的聚體形式不同，可能與它們之間的序列差異性有關(guān)。在溶液中At KdsD蛋白究竟是以哪種聚體形式存在還需分析超速離心 （AUC）等實(shí)驗(yàn)做進(jìn)一步的分析驗(yàn)證。此外，在蛋白晶體生長方面，通過KdsD晶體的初步篩選 （實(shí)驗(yàn)結(jié)果未發(fā)表），獲得了部分蛋白晶體，但晶體形狀不規(guī)則，質(zhì)量尚不能達(dá)到X-ray衍射要求，究其原因與擬南芥KdsD在溶液中存在不同種類多聚體混合狀態(tài)有一定關(guān)系，因?yàn)樵谌芤褐袛M南芥KdsD易形成不同多聚體狀態(tài)，很大程度上會干擾均一晶核的形成，最終影響晶體質(zhì)量。而微生物來源的KdsD在結(jié)晶時，其溶液中蛋白聚體狀態(tài)單一，晶體均一性好，有利于獲得X衍射結(jié)果并解析出結(jié)構(gòu)信息。

At KdsD經(jīng)酶學(xué)性質(zhì)測定，該蛋白的最適反應(yīng)溫度為 37 ℃，與已報道的微生物中大腸桿菌CFT073的阿拉伯糖-5-磷酸異構(gòu)酶性質(zhì)類似［22］；酶的最適pH為8.0，與大腸桿菌KdsD酶最適pH 8.4亦近似，屬于偏堿性蛋白。當(dāng)溶液中存在各種金屬陽離子時均對酶活性有不同程度的抑制作用，其中 Cu2+、Zn2+對酶活性的抑制作用較弱，而 Co2+、Cd2+對酶活性的抑制作用最強(qiáng)。這說明At KdsD具有較差的金屬離子耐受性。Km值表示酶與底物之間的親和能力，Km值越大，親和能力越弱，反之亦然。At KdsD動力學(xué)常數(shù) Vmax值為0.18 mmol/（L·min），Km值為0.16 mmol/L，而微生物中大腸桿菌KdsD的Km為0.61 mmol/L［25-27］。兩者比較發(fā)現(xiàn)，擬南芥KdsD的 Km值遠(yuǎn)小于大腸桿菌Km值，說明擬南芥的KdsD酶與底物之間的親和能力更強(qiáng)，這種差異推測與植物和微生物之間 KdsD一級結(jié)構(gòu)序列差異性和聚體存在形式所產(chǎn)生的空間構(gòu)象不同有關(guān)。本文研究結(jié)果為后期研究 At KdsD蛋白的結(jié)構(gòu)與功能奠定了基礎(chǔ)，同時也為果膠多糖保健食品和植物新型農(nóng)藥的研發(fā)提供十分重要的參考。

圖8　不同物種KdsD氨基酸序列比對Fig. 8 A lignment of am ino acid sequence of KdsD from different species. Arabidopsis thaliana （Accession No. NP_191029.1）； Escherichia coli （Accession No. NP_417664.1）； Pseudomonas aeruginosa （Accession No. KGB88562.1）. The unique SIS domain， CBS domain of KdsD and conserved residues of the active site are indicated by arrow and box， respectively.

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（本文責(zé)編 陳宏宇）

November 13， 2015； Accepted: December 30， 2015

Zhijun Zhang. Tel: +86-571-63741297； E-mail: 397942805@qq.com

Expression, purification and characterization of arabinose-5-phosphate isomerase from Arabidopsis thaliana

Yaping Qu, Zhijun Zhang, Chaoli Wang, Lei Wang, and Linjun Wu

The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture， Zhejiang A & F University， Lin’an 311300，Zhejiang， China

Arabinose-5-phosphate isomerase （KdsD） is the first key lim iting enzyme in the biosynthesis of 3-deoxy-D-manno-octulosonate （KDO）. KdsD gene was cloned into prokaryotic expression vector pET-HTT by seam less DNA cloning method and the amount of soluble recombinant protein was expressed in a soluble form in E. coli BL21 （DE3）after induction of Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside （IPTG）. The target protein was separated and purified by Ni-NTA affinity chromatography and size exclusion chromatography， and its purity was more than 85%. Size exclusion chromatography showed that KdsD protein existed in three forms: polymers， dimmers， and monomers in water solution，different from m icrobial KdsD enzyme w ith the four polymers in water solution. Further， the purified protein was identified through Western blotting and MALDI-TOF MASS technology. The results of activity assay showed that the optimum pH and temperature of At KdsD isomerase activities were 8.0 and 37 ℃， respectively. The enzyme was activated by metal protease inhibitor EDTA （5 mmol/L） and inhibited by some metal ions at lower concentration， especially w ith Co2+and Cd2+metal ion. Furthermore， when D-arabinose-5-phosphate （A 5P） was used as substrate， Kmand Vmaxof At KdsD values were 0.16 mmol/L， 0.18 mmol/L·m in. The affinity of At KdsD was higher than KdsD in E. coli combined w ith substrate. Above results have laid a foundation for the KdsD protein structure and function for its potential industrial application.

Arabidopsis thaliana， arabinose-5-phosphate isomerase， heterologous expression， purification， MALDI-TOF MASS， enzyme properties

Supported by: Natural Science Foundation of Zhejiang Province （No. Y14C160039）.

浙江省自然科學(xué)基金 （No. Y14C160039） 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-01-15 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160115.1716.001.html