辛伐他汀對不穩(wěn)定斑塊模型家兔血栓形成的影響*

楊 琳，盧 斌，杜 云，郭茂娟，張云莎，李虎虎，曾文赟，馬東明，姜希娟

（1.天津中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，天津 300193；2.天津高等醫(yī)學?？茖W校醫(yī)療系，天津 300222）

·實驗研究·

辛伐他汀對不穩(wěn)定斑塊模型家兔血栓形成的影響*

楊 琳1，盧 斌1，杜 云2，郭茂娟1，張云莎1，李虎虎1，曾文赟1，馬東明1，姜希娟1

（1.天津中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，天津 300193；2.天津高等醫(yī)學?？茖W校醫(yī)療系，天津 300222）

［目的］探討辛伐他汀對動脈粥樣硬化（AS）不穩(wěn)定斑塊家兔模型血栓形成的影響。［方法］將雄性新西蘭家兔隨機分兩組，其中一組（假手術組）始終給予正常飲食，另一組給予高脂飼料喂養(yǎng)4周后，行腹主動脈球囊拉傷術，術后繼續(xù)4周高脂飲食后轉為正常飲食，并隨機分為模型組和辛伐他汀組，辛伐他汀組給予辛伐他?。?0 mg/（kg·d）］灌胃4周，假手術組和模型組則給予等體積的生理鹽水灌胃。各組家兔于藥物干預4周后處死，處死前48 h和24 h兩次行腹膜下注射蛇毒（0.15 mg/kg）和耳緣靜脈注射組胺（0.02 mg/kg）藥物觸發(fā)斑塊破裂。處死后取腹主動脈于體視鏡下觀察血栓形成情況，采用酶聯免疫吸附法（ELISA法）檢測血管性血友病因子抗原（vWF：Ag）和D-二聚體，放免法檢測血栓素B2（TXB2）和6-酮-前列腺素F1α（6-keto-PGF1α）的濃度，并計算TXB2/6-keto-PGF1α的比值。［結果］辛伐他汀干預4周后，體視顯微鏡下觀察斑塊部位血栓形成減少，與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），血漿vWF：Ag和D-二聚體水平均降低，與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），血漿TXB2濃度降低、6-keto-PGF1α濃度升高，與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），TXB2/6-keto-PGF1α降低，與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。［結論］辛伐他汀能夠修復受損血管內皮細胞，改善血液高凝狀態(tài)，抑制血小板聚集等，進而發(fā)揮抗血栓形成的作用，為辛伐他汀臨床針對AS不穩(wěn)定斑塊患者，預防其血栓形成提供了實驗依據。

辛伐他?。粍用}粥樣硬化；不穩(wěn)定斑塊；血栓形成

隨著人們物質生活水平的提高，動脈粥樣硬化（AS）的發(fā)病率逐年升高。復雜的AS斑塊往往結構不穩(wěn)定，易發(fā)生破裂或糜爛，后者因動脈內皮缺失啟動凝血系統(tǒng)促進血栓形成，導致心肌梗死等急性心血管事件發(fā)生，乃至危及生命。世界衛(wèi)生組織（WHO）報道［1］AS所致的急性心血管事件2012年病死人數為740萬，占總病死人數的13.2%，病死率較2000年上升23.3%，成為全球首位死因。

高膽固醇血癥是AS發(fā)生的物質基礎。因此，降低血漿膽固醇水平是抗AS重要治療手段。3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶是膽固醇合成的限速酶，直接影響膽固醇的合成速率和血漿膽固醇的水平。目前，辛伐他汀作為HMG-CoA的抑制劑，被臨床廣泛用于降低血漿膽固醇，防治AS。但近年來發(fā)現辛伐他汀作用機制復雜，除降低膽固醇外，可通過抗炎、抗凋亡等抑制AS的發(fā)生發(fā)展［2］。AS斑塊破裂或糜爛繼發(fā)血栓形成是AS的常見并發(fā)癥和致死原因。辛伐他汀抗AS所致血栓形成療效和機制尚待進一步證實。因此，本實驗復制AS不穩(wěn)定斑塊家兔模型，觀察辛伐他汀對該模型血栓形成的影響，為拓展辛伐他汀的臨床應用范圍提供實驗支持。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 26只SPF級雄性新西蘭家兔，體質量2.4～2.9 kg（購自北京龍安實驗動物繁育中心）。

1.1.2 實驗試劑和儀器 辛伐他汀片（舒降之，杭州默沙東制藥有限公司），高脂飼料（1%膽固醇+5%豬油+5%蛋黃粉+89%基礎飼料，其中膽固醇購自天津市大茂化學試劑廠），魯塞爾蝰蛇毒（RVV，Sigma Chemical Co，美國），組胺（Sigma Chemical Co，美國），血管性血友病因子抗原（vWF：Ag，上海索萊寶生物技術有限公司），D-二聚體（D-Dimer，上海易生物技術研究所），血栓素B2（TXB2）和6-酮-前列腺素F1α （6-keto-PGF1α）放免試劑盒（解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)公司），球囊導管及附件（Cordis公司，美國），微機多探頭γ計數儀（FT-630G型，北京），體視顯微鏡（Olympus，SZXY7，日本），多功能微孔讀板機（Endpine，美國Perkin Elmer公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗模型的制備 將26只家兔稱重后，按體質量從輕到重依次1～26號排列，依照安全隨機法，利用Excel文件中的“隨機數發(fā)生器”進行隨機分組，其中，一組作為假手術組（n=8），始終給予正常飲食，其余18只家兔給予高脂飼料飼養(yǎng)4周，行腹主動脈球囊拉傷術。模型制作過程簡述如下：3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）耳緣靜脈麻醉，同時靜脈給予肝素（200 U/kg，以防止插管過程中發(fā)生凝血），切開右股動脈，結扎遠心端。沿0.014的導絲從股動脈切口逆行插入球囊（內徑3.5 mm，長15 mm）約20 cm，回抽3 cm，連接手推式壓力泵，注入肝素生理鹽水，膨至8個大氣壓，向著髂總動脈輕柔回拉，重復3次，行腹主動脈壁氣囊拉傷術。假手術組：家兔僅行腹主動脈切口，并不進行球囊拉傷。術后常規(guī)注射抗生素3 d以預防感染。

1.2.2 給藥劑量和給藥方法 模型制作過程中，因麻醉意外和失血過多死亡2只。模型制作成功的16只家兔繼續(xù)給予4周高脂飲食后轉為正常飲食，并按上述隨機分組法再次隨機分為模型組（n=8）和辛伐他汀組（n=8）。辛伐他汀組給予10 mg/（kg·d）的辛伐他汀混懸液灌胃干預4周，相同干預時間內假手術組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃。

1.2.3 藥物觸發(fā) 藥物干預結束后，參照Constantinides等［3］方法將所有家兔行藥物觸發(fā)：腹膜下注射蛇毒（RVV，0.15 mg/kg），30 min后，經耳緣靜脈注射組胺（0.02 mg/kg），于處死動物前24 h和48 h分別給予2次觸發(fā)。

1.3 指標檢測

1.3.1 標本采集和血栓的體視顯微鏡觀察 于處死動物前，禁食12 h，不禁水。經耳緣靜脈取血，2% EDTA Na2抗凝，離心（3 000 r/min）30 min獲得血漿；取腹主動脈，生理鹽水沖洗后，縱行剖開腹主動脈，平鋪于濾紙上，體視顯微鏡下觀察可視血栓形成情況。

1.3.2 酶聯免疫吸附測定（ELISA）法 取各組家兔血漿，采用ELISA法測定血漿中vWF：Ag和D-二聚體，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3.3 放射免疫分析法 以125I-TXB2和125I-6-keto-PGF1α為示蹤標記物，采用放射免疫分析法測定血漿TXB2和6-keto-PGF1α的濃度，嚴格按照試劑盒說明書操作，并計算TXB2/6-keto-PGF1α的比值。

1.4 統(tǒng)計分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料實驗數據以均數±標準差（±s）表示，計量資料組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett'T3法，組間率的比較采用卡方檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 動脈斑塊血栓形成情況 球囊拉傷后合并高脂飲食8周后，變換為正常飲食并給予藥物干預4周后，以蝰蛇毒和組胺誘導斑塊破裂和血栓形成。體視顯微鏡下，可見假手術組無斑塊和血栓形成（0%），模型組和辛伐他汀組斑塊血栓受損繼發(fā)血栓形成率分別為6/8（75%）和2/8（25%），見表1。模型組與假手術組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；辛伐他汀組與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 不同組別斑塊受損激發(fā)血栓形成的比較

2.2 辛伐他汀對血漿vWF：Ag和D-二聚體的影響 結果顯示，模型組動物高膽固醇飲食合并球囊損傷，可提高血漿vWF：Ag和D-二聚體水平，與假手術組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。辛伐他汀干預4周后，血漿vWF：Ag和D-二聚體水平均降低，與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示辛伐他汀對血漿vWF：Ag和D-二聚體有明顯的抑制作用，見表2。

表2 不同組別血漿vWF:Ag和D-二聚體濃度的比較（±s）

表2 不同組別血漿vWF:Ag和D-二聚體濃度的比較（±s）

注：與模型組比較，**P＜0.01。

組別 n vWF：Ag（%） D-二聚體（mg/L）假手術組 8 120.121±23.298** 0.266±0.061**模型組 8 168.954±23.586 1.640±0.392辛伐他汀組 8 132.993±23.160** 1.056±0.376**

2.3 辛伐他汀對血漿TXB2和6-keto-PGF1α濃度及TXB2/6-keto-PGF1α的影響 結果顯示，模型組動物高膽固醇飲食合并球囊損傷后，血漿TXB2濃度升高、6-keto-PGF1α濃度降低、TXB2/6-keto-PGF1α升高，與假手術組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。辛伐他汀干預4周后，血漿TXB2濃度、TXB2/6-keto-PGF1α降低、而6-keto-PGF1α濃度升高，其中，TXB2和6-keto-PGF1α與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；TXB2/6-keto-PGF1α與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示辛伐他汀可降低血漿TXB2濃度、升高6-keto-PGF1α濃度，進而降低TXB2/6-keto-PGF1α，見表3。

表3 不同組別血漿TXB2和6-keto-PGF1α濃度及TXB2/6-keto-PGF1α的比較（±s）

表3 不同組別血漿TXB2和6-keto-PGF1α濃度及TXB2/6-keto-PGF1α的比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 n TXB2 （ng/L）6-keto-PGF1α （ng/L）

3 討論

動脈粥樣硬化發(fā)生臨床急性事件最基本的深層原因，是復雜動脈粥樣斑塊易損，在此基礎上斑塊破裂或者糜爛合并血栓形成。高膽固醇飼料喂養(yǎng)易于形成腹主動脈易于形成斑塊，然而，持續(xù)高膽固醇飲食形成的斑塊往往以泡沫細胞為主，難以形成與人體類似的復雜斑塊。實驗研究顯示［4-5］，AS本身與血管內皮細胞功能紊亂關系密切相關，內皮細胞受損或功能障礙是AS的始動因素。因此，筆者采用高膽固醇飲食的基礎上，行球囊拉傷術損傷腹主動脈內皮細胞，促進斑塊形成的數量和嚴重程度；高膽固醇飲食8周后，改為普通飲食，研究顯示降低膽固醇水平，促進斑塊不穩(wěn)定。在此基礎上，采用蝰蛇毒和組胺使血管交替強烈收縮和舒張，促進不穩(wěn)定斑塊破裂或糜爛。本研究結果顯示，上述模型動物腹主動脈處發(fā)生明顯的斑塊糜爛、破裂和繼發(fā)血栓形成，與Gang等［6］人的研究類似，提示不穩(wěn)定斑塊繼發(fā)血栓形成的動物模型制作成功。辛伐他汀可降低上述模型血栓形成，提示辛伐他汀具有抗血栓功效。AS的不穩(wěn)定斑塊易形成血栓，是多種因素共同作用的結果。為闡述辛伐他汀抗血栓形成的機制，本研究利用此模型進一步觀察與血栓形成的相關指標的改變。

內皮細胞功能障礙或受損不但是AS始動因素，而且功能障礙和受損的內皮細胞又釋放大量的vWF，其具有使血小板與膠原或其他表面黏附的橋梁作用，進而導致AS病變處易形成血栓。本研究顯示球囊損傷內皮細胞的動物模型中血漿vWF濃度升高，提示球囊損傷是AS本身和誘導斑塊破裂的因素，均導致內皮細胞功能障礙。辛伐他汀有效降低上述動物模型的vWF水平，提示該藥抑制血栓形成的機制與保護內皮細胞受損傷有關。

D-二聚體是凝血酶及因子Ⅻ作用下的交聯纖維蛋白經纖溶酶降解作用后一種特異性降解產物?？煞从衬屠w溶系統(tǒng)的激活，是目前公認的體內活動性血栓形成的特異性分子的標志物［7］。大量臨床研究［8］顯示在AS病變中，D-二聚體能沉積于血管壁，直接損傷血管內膜；同時還能促進血小板黏附和聚集，使血液處于高凝狀態(tài)，進而加速血栓形成。本研究中模型組的D-二聚體檢測明顯高于假手術組，說明該模型制備后血液處于高凝狀態(tài)，易于在不穩(wěn)定斑塊中發(fā)生血栓形成。而辛伐他汀有效降低了模型動物的D-二聚體濃度，提示該藥物可逆轉高凝狀態(tài)，發(fā)揮抗血栓功能。

TXB2和6-keto-PGF1α是TXA2和PGI2的穩(wěn)定代謝產物，以兩者含量間接反映半衰期極短的TXA2和PGI2濃度。TXA2和PGI2是一組由血液中血小板和血管內皮細胞釋放的血管活性物質，TXA2促進血管收縮和血小板聚集，PGI2舒張血管和抑制血小板聚集，兩者相互拮抗。正常情況下在血液中兩者含量及比值保持相對平衡狀態(tài)，使血管舒張有度，既不形成血栓也不發(fā)生出血［9］。臨床研究［10］發(fā)現AS患者血管損傷處有大量血小板黏附，易形成血栓，TXA2增高，而PGI2降低，導致兩者平衡失調。一旦兩者失衡，則促進血小板聚集，加速血栓形成。本研究實驗結果顯示，模型組中TXB2增高，6-keto-PGF1α減低，兩者比值明顯升高，提示該模型血管內皮細胞受損，循環(huán)血液中的血小板黏附在損傷部位、被激活、釋放TXA2，進一步促進血小板聚集，加速血栓形成。辛伐他汀能有效提高6-keto-PGF1α濃度、降低TXB2濃度，促進兩者比例平衡，進一步提示辛伐他汀具有保護內皮細胞、抑制血小板激活進而發(fā)揮抗凝作用。

綜上所述，本實驗通過球囊拉傷術后藥物觸發(fā)制備不穩(wěn)定斑塊血栓形成的模型，進而研究辛伐他汀抗AS的血栓形成的機制，實驗結果顯示辛伐他汀可能通過修復損傷的血管內皮細胞，改善血液高凝狀態(tài)，抑制血小板聚集等，發(fā)揮抗血栓形成的作用，本研究為辛伐他汀臨床針對AS不穩(wěn)定斑塊患者，預防其血栓形成提供了實驗依據。

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Effect of simvastatin on thrombosis in unstable plaque thrombosis rabbits model

YANG Lin1，LU Bin1，DU Yun2，GUO Mao-juan1，ZHANG Yun-sha1，LI Hu-hu1，ZENG Wen-yun1，MA Dong-ming1，JIANG Xi-juan1
（1.School of Combination of TCM and WM，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Medical Department，Tianjin Medical College，Tianjin 300222，China）

R541.4

A

1673-9043（2016）01-0019-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2016.01.06

國家自然科學基金資助項目（81102699）；天津市自然科學基金資助項目（08JCYBJC10800）。

楊 琳（1978-），女，博士研究生，主要從事中醫(yī)藥防治心腦血管疾病的研究。

姜希娟，E-mail：xijuanjiang@foxmail.com.

（2015-10-30）