小鼠尾靜脈注射與心肌注射腺病毒載體轉(zhuǎn)染效率的比較

楊琳珊，占貞貞，汪　波，楊珺琦，范慧敏，2，劉中民，2

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院心力衰竭研究所，上?！?00120；2.同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院心胸外科，上海　200120)

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小鼠尾靜脈注射與心肌注射腺病毒載體轉(zhuǎn)染效率的比較

楊琳珊1，占貞貞1，汪波1，楊珺琦1，范慧敏1，2，劉中民1，2

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院心力衰竭研究所，上海200120；2.同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院心胸外科，上海200120)

目的比較小鼠尾靜脈注射或心肌注射腺病毒載體后心臟組織和肝臟組織中靶基因的轉(zhuǎn)染效率。方法構(gòu)建表達(dá)綠色熒光蛋白GFP的腺病毒載體(GFP-Ad)。C57BL/6小鼠20只隨機(jī)分為尾靜脈注射腺病毒載體組與心肌注射腺病毒載體組各10只，用實時定量PCR檢測不同時間點小鼠心肌組織和肝臟組織中GFP的mRNA表達(dá)水平,并且通過熒光顯微鏡觀察GFP熒光表達(dá)情況。結(jié)果心肌注射腺病毒載體組心臟組織中GFP的mRNA表達(dá)水平明顯高于尾靜脈注射腺病毒載體組，心肌注射腺病毒載體組心臟組織中熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。同時，我們發(fā)現(xiàn)兩組的肝臟組織中GFP 的mRNA表達(dá)水平和熒光強(qiáng)度均明顯高于心臟組織中；且在尾靜脈注射腺病毒載體組，肝臟組織中GFP的 mRNA表達(dá)水平和熒光強(qiáng)度在7 d達(dá)高峰，而心肌注射腺病毒載體組則在3 d達(dá)高峰。結(jié)論提高心臟組織中靶基因的轉(zhuǎn)染效率宜采用心肌注射腺病毒載體的方法；對于肝臟組織轉(zhuǎn)染效率，兩種注射方法均可，鑒于尾靜脈注射腺病毒載體的方法創(chuàng)傷小，宜采用。

心肌注射；尾靜脈注射；腺病毒載體；轉(zhuǎn)染效率

小鼠尾靜脈注射是動物實驗中藥物干預(yù)的常用途徑。但小鼠尾靜脈較細(xì)，造成穿刺難度大，因此很大程度上制約了實驗的成功與否，且其藥效如何也有待論證。心肌注射是除尾靜脈給藥的另外一種方法，但由于其是一種有創(chuàng)的給藥途徑，因此其應(yīng)用也受限制?，F(xiàn)將這兩種方法的心臟組織及肝臟組織中靶基因的轉(zhuǎn)染效率作比較。

1　材料和方法

1.1實驗動物

C57BL/6雄性小鼠20只，8 周齡，體重(24～26)g，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司(生產(chǎn)許可證【SCXK(滬)2012-0002】)，隨機(jī)分為小鼠尾靜脈注射組和心肌注射組各10只，飼養(yǎng)于同濟(jì)大學(xué)實驗動物中心屏障環(huán)境【SYXK(滬)2014-0026】。

1.2主要試劑和儀器

SYBR Green QPCR Mix(日本Toyobo公司)；組織轉(zhuǎn)染帶綠色熒光的腺病毒載體由上海和元生物有限公司合成。0.1%戊巴比妥鈉，倒置顯微鏡，小動物呼吸機(jī)，顯微外科手術(shù)器械。

1.3方法

1.3.1小鼠尾靜脈注射:將小鼠置于固定器內(nèi)，露出尾巴，按陳育堯[1]的方法尾靜脈注射GFP-Ad。一次注射量為0.05～0.1 mL/10 g 體重[2]?？瞻讓φ战M注射同劑量PBS。

1.3.2小鼠心肌注射:0.1%戊巴比妥鈉(0.1 mL/10 g)腹腔麻醉，小鼠肌肉松弛充分后氣管插管，連接呼吸機(jī)。小鼠右側(cè)臥位固定于手術(shù)臺上，在距胸骨左緣0.3 cm 處沿4、5 肋間做橫行切口進(jìn)胸，暴露心臟，使用一次性胰島素注射器于靠近心尖處直接心肌注射腺病毒液體，1只小鼠50 μL[4]。注射完畢后使用3-0 線逐層關(guān)閉胸腔。斷開呼吸機(jī)，術(shù)后將小鼠放置于溫毯上密切觀察?？瞻讓φ战M按同樣操作注射同劑量PBS。

1.4檢測組織中GFP的表達(dá)水平

兩組小鼠于實驗后第3、5、7天分別處死3對，分別取心臟組織和肝臟組織做冰凍切片和提取RNA做實時熒光定量QPCR。抽提組織RNA后，利用SYBR MicroRNA Assay Kit 中的探針進(jìn)行實時熒光定量PCR，檢測GFP表達(dá)水平。以U6 snRNA 為內(nèi)參，反應(yīng)體系為10 μL，2-ΔΔCt方法計算GFP的相對表達(dá)水平。定量反應(yīng)條件為95 ℃10 min，擴(kuò)增1 個循環(huán)， 95 ℃ 15 s，擴(kuò)增40 個循環(huán)， 60 ℃ 1 min 擴(kuò)增40 個循環(huán)，在每個循環(huán)的60 ℃時測定熒光。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1心臟組織和肝臟組織中GFP的表達(dá)水平比較

qPCR檢測結(jié)果顯示，心肌注射組的心臟組織中GFP的mRNA表達(dá)水平明顯高于尾靜脈注射組。兩個實驗組的肝臟組織中GFP的mRNA表達(dá)水平均明顯高于心臟組織中，尾靜脈注射組升高更為明顯。GFP的mRNA表達(dá)水平尾靜脈注射組在7 d左右達(dá)高峰，而心肌注射組則在3 d左右達(dá)高峰；同時QPCR 檢測發(fā)現(xiàn)從小鼠尾靜脈注射組取得的肝臟組織和心臟組織中的GFP的mRNA表達(dá)水平在3 d和5 d左右是下調(diào)于從心肌注射組中取得的肝臟組織，而在7 d左右結(jié)果卻與之相反，這種變化在肝臟組織中更明顯。見圖1。

A：心肌注射腺病毒載體組與尾靜脈注射腺病毒載體組，心臟組織中GFP的mRNA表達(dá)水平比較。B：心肌注射腺病毒載體組與尾靜脈注射腺病毒載體組，肝臟組織中GFP的mRNA表達(dá)水平比較。C：心肌注射腺病毒載體組，心臟組織與肝臟組織中GFP的mRNA表達(dá)水平比較。D：尾靜脈注射腺病毒載體組，心臟組織與肝臟組織中GFP的mRNA表達(dá)水平比較。*為P<0.05，**為P<0.01。圖1　兩實驗組小鼠組織中GFP表達(dá)水平Note. A: Comparison of GFP mRNA expression levels in the mouse heart tissues of the intramyocardial injection and tail vein injection groups. B：Comparison of GFP mRNA expression levels in the mouse liver tissue of the intramyocardial injection and tail vein injection groups.C：Comparison of GFP mRNA expression levels in the mouse heart and liver tissues in the intramyocardial injection group. D. Comparison of GFP mRNA expression levels in the mouse heart and liver tissues in the tail vein injection group. *P<0.05，**P<0.01.Fig.1　GFP mRNA levels in mouse tissues of the two groups

2.2心臟組織和肝臟組織冰凍切片觀察GFP熒光情況

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，心臟組織中的GFP熒光強(qiáng)度心肌注射組明顯強(qiáng)于尾靜脈注射組。在尾靜脈注射組，肝臟組織中GFP熒光明顯強(qiáng)于心臟組織，且在7 d左右達(dá)高峰，而在心肌注射組，則心臟組織中GFP熒光強(qiáng)度明顯高于肝臟組織，且在3 d左右達(dá)高峰。見圖2。

A: 心肌注射腺病毒載體組與尾靜脈注射腺病毒載體組的小鼠心臟組織中不同時間的GFP熒光強(qiáng)度比較。B：尾靜脈注射腺病毒載體組，心臟組織與肝臟組織不同時間的GFP熒光強(qiáng)度比較。C:心肌注射腺病毒載體組，心臟組織與肝臟組織不同時間的GFP熒光強(qiáng)度比較。圖2　兩組小鼠組織中GFP熒光強(qiáng)度比較。(標(biāo)尺=100 μm) Note. A: Comparison of fluorescence intensity of GFP in the mouse heart tissues at different time points of the intramyocardial and tail vein injection groups. B: Comparison of the fluorescence intensity of GFP in the mouse heart and liver tissues at different time points of the tail vein injection group. C: Comparison of the fluorescence intensity of GFP in the mouse heart and liver tissues at different time points of the intramyocardial injection group. Fig.2　GFP fluorescence expression in mouse tissues of the two groups(Bar=100 μm)

3　討論

3.1小鼠尾靜脈注射的幾個問題探討

3.1.1尾靜脈擴(kuò)張：應(yīng)該保持實驗室溫度在26 ℃左右，尤其是冬季，適宜的室內(nèi)溫度對小鼠尾靜脈有一定的擴(kuò)張作用并且能夠使血流通暢降低注射阻力。目前使用較多的是用酒精涂擦使尾靜脈擴(kuò)張，也有使用紅外線燈加熱小鼠尾部，另外有報道使用硝酸甘油擴(kuò)張尾靜脈從而降低穿剌難度，且其效果優(yōu)于75%乙醇[5]。我們所使用的熱水浸泡聯(lián)合酒精涂擦法能使尾靜脈擴(kuò)張更充分，其效果優(yōu)于單用熱水浸泡法和單用酒精涂擦法。但是水浴的溫度以50℃～60℃較為適宜，溫度太低則尾靜脈擴(kuò)張效果不理想，若溫度超過70 ℃則容易燙傷皮層，甚至在拉尾固定的過程中小鼠掙扎導(dǎo)致皮層脫落并出血，容易誘發(fā)感染。

3.1.2注射劑量：單次小鼠尾靜脈注射劑量不宜超過400 μL每只，大劑量迅速推注容易造成小鼠循環(huán)超負(fù)荷導(dǎo)致猝死，特別是懸浮顆粒型液體更容易造成栓塞導(dǎo)致小鼠死亡，因此推注藥物的過程應(yīng)該緩慢并觀察小鼠的反應(yīng)。我們在實驗過程中采用的注射劑量為200 μL每只，即約為全血體積的14%，小于100 μL注射劑量時在一次注射不成功時藥物損失量的影響會比較大，因此200 μL是一個比較適宜的注射量。

3.2小鼠心肌注射的幾個問題探討

3.2.1小鼠模型的建立：成功的麻醉與氣管插管是建立模型的前提，麻醉過量易導(dǎo)致小鼠死亡，故麻醉用量應(yīng)謹(jǐn)慎, 藥量宜少不宜多, 以使小鼠不能自主翻身為宜,本實驗以0.1%戊巴比妥鈉(0.1 mL/10 g)腹腔麻醉，效果良好。氣管插管次數(shù)不宜太多，因插管次數(shù)太多易致喉水腫而窒息死亡，插管時用小鑷子拉出鼠舌, 順舌根插成功率較高, 插管后接呼吸機(jī), 若小鼠胸廓起伏與呼吸機(jī)頻率一致提示插管成功。

3.2.2心肌注射：成功開胸暴露心臟后，即于靠近心尖處直接心肌注射腺病毒液體，每只小鼠50 μL。注意排空注射器內(nèi)空氣，以免造成空氣栓塞導(dǎo)致小鼠死亡。由于小鼠心肌比較薄，故注射液體時注射器針頭不能刺入太深以防注入心腔。

3.3腺病毒轉(zhuǎn)染效率的探討

我們實驗比較了心肌注射或尾靜脈注射腺病毒載體后心臟組織和肝臟組織中靶基因的轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)心肌注射腺病毒載體方法心臟組織中靶基因的轉(zhuǎn)染效率明顯高于尾靜脈注射方法，且兩種方法注射腺病毒載體后肝臟組織中靶基因的轉(zhuǎn)染效率均明顯高于心臟組織中，尾靜脈注射組升高更為明顯，且在尾靜脈注射腺病毒載體組，肝臟組織中靶基因的轉(zhuǎn)染效率7 d達(dá)高峰，而心肌注射腺病毒載體組則在3 d達(dá)高峰。小鼠血液循環(huán)和人體血液循環(huán)是相似的，血液都是從左心室射入主動脈，沿動脈到全身各部包括肝臟的毛細(xì)血管，然后匯入小靜脈，大靜脈，最后經(jīng)上下腔靜脈回到右心房。其中，肝臟的血液循環(huán)十分豐富，肝臟對來自體內(nèi)和體外的許多非營養(yǎng)物質(zhì)如各種藥物、毒物以及體內(nèi)某些代謝產(chǎn)物，具有生物轉(zhuǎn)化作用，通過新陳代謝將它們徹底分解或以原形排出體外。無論是心肌注射腺病毒載體還是尾靜脈注射腺病毒載體方法，腺病毒載體相當(dāng)于一種外來非營養(yǎng)物質(zhì)，其首先進(jìn)入肝臟進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，因此，兩種方法注射腺病毒載體后肝臟組織中靶基因的轉(zhuǎn)染效率均明顯高于心臟組織中。腺病毒載體從尾靜脈注入體內(nèi)后，其首先經(jīng)過靜脈回流進(jìn)入心臟，然后才經(jīng)左心室射入主動脈，沿動脈到達(dá)肝臟組織中；而心肌注射腺病毒載體則直接從左心室射入主動脈，然后到達(dá)肝臟，因此兩種方法注射腺病毒載體后，其在肝臟組織中的轉(zhuǎn)染效率各顯示不同的高峰，尾靜脈注射腺病毒載體組肝臟組織中靶基因的轉(zhuǎn)染效率7 d達(dá)高峰，而心肌注射腺病毒載體組則在3 d達(dá)高峰。肝臟還有藥物首過效應(yīng)，首過效應(yīng)既某些藥物經(jīng)胃腸道等途徑給藥后，經(jīng)門脈系統(tǒng)進(jìn)入肝臟，在肝臟被代謝，而使進(jìn)入血液循環(huán)的原形藥量減少的現(xiàn)象，尾靜脈注射腺病毒進(jìn)入體內(nèi)后首先經(jīng)過肝臟的首過消除效應(yīng)，到達(dá)心臟組織后病毒量減少，因此尾靜脈注射腺病毒載體方法心臟組織中靶基因的轉(zhuǎn)染效率明顯低于心肌注射方法。具體機(jī)制還有待深入研究。

總之，小鼠尾靜脈注射法是常用的藥物干預(yù)途徑，傳統(tǒng)的方法是采用1 mL 注射器 (0.5 號針頭)在回抽見血后予以注射，但是由于注射過程中小鼠掙扎尾部擺動易使針頭移位，導(dǎo)致注射失敗，且難以估算注射液有效入量，影響最終的實驗結(jié)果。采用我們自制的這種方法進(jìn)行尾靜脈注射可以準(zhǔn)確的估算注射液有效入量，但是由于其操作繁瑣，耗時較久，且藥物經(jīng)過肝臟的首過消除到達(dá)心臟后其療效有所下降，因此如果是研究肝臟方面的疾病，采用尾靜脈注射效果優(yōu)于心肌注射。采用心肌注射法，藥物沒有肝臟的首過消除效應(yīng)，心臟組織中腺病毒轉(zhuǎn)染效率明顯增加，因此用于研究心臟方面疾病此法效果更好；且小鼠開胸可用于做心梗模型，利于后續(xù)方面的研究。

[1]陳育堯, 黃雪玲. 小鼠尾靜脈注射法[J]. 毒理學(xué)雜志, 2008, 22(4)：311-312.

[2]蔡陳之, 陳凱. 小鼠尾靜脈注射的幾點體會[J]. 科技向?qū)? (2010),(6): 4.

[3]Oleg Tarnavski JRM., Schinke M, Nie Q, et al. Mouse cardiac surgery comprehensive techniques for the generation of human diseases and their application for genomic studies [J]. Physiol Genomics, 2004, 16(3): 349-60.

[4]Svensson EC, M., Marshall DJ, Woodard K, et al. Efficient and stable transduction of cardiomyocytes after intramyocardial injection or intracoronary perfusion with recombinant adeno-associated virus vectors [J]. Circulation, 1999, 99: 201-205.

[5]蔣蘭蘭, 馮俊濤, 羅百靈, 等. 硝酸甘油干預(yù)法對小鼠尾靜脈穿刺效果的影響[J]. 中國醫(yī)學(xué)工程, 2004, 12(4): 92-93.

Comparison of the efficiency of tail vein injection and intramyocardial injection of adenovirus vector in mice

YANG Lin-shan1, ZHAN Zhen-zhen1, WANG Bo1, YANG Jun-qi,1FAN Hui-min1，2, LIU Zhong-min1，2

(1. Institute of Heart Failure, East Hospital, Tongji University School of Medicine, Shanghai 200120, China；2.Cardio-Thoracic Surgery, East Hospital, Tongji University School of Medicine, Shanghai 200120)

ObjectiveTo investigate the efficiency of target gene transfection of the heart and liver after tail vein or intramyocardial injection of adenovirus vector (GFP-Ad). MethodsGFP-AD was constructed at first. A total of 20 male 8-week old C57BL/6 mice were randomly and equally divided into tail vein injection of GFP-AD group and intramyocardial injection of GFP-AD group. The mRNA levels of GFP in the heart and liver tissues were detected by Q-PCR at different time points. Fluorescence microscopy was performed to visualize the expression of GFP fluorescence. Results Compared with the tail vein injection group, the GFP mRNA level in mouse heart tissue was apparently higher in the intramyocardial injection group. In both groups, the GFP mRNA levels in liver tissue were significantly increased compared with that in the heart tissue. In the tail vein injection group, the GFP mRNA level in liver tissue reached a peak on day 7; but in the intramyocardial injection group, the mRNA level of GFP in liver tissue reached apeak on day 3. We also observed the same trend of GFP fluorescence expression in the tail vein injection group compared with that in the intramyocardial injection group.ConclusionsIntramyocardial injection of adenovirus vector is suitable to achieve a higher transfection efficiency in mouse heart tissue compared with the tail vein injection method. Although both injection methods are suitable for transfection of mouse liver, the tail vein injection method is preferential for it is simple and less invasive.

Intramyocardial injection; Tail vein injection; Adenovirus vector; Transfection efficiency,Mice.

國家自然科學(xué)基金面上項目(81370433，81373146，81571541)；上海市“創(chuàng)新行動計劃”基礎(chǔ)研究領(lǐng)域項目(14JC1405200)。

楊琳珊，女，碩士在讀，研究方向：心血管免疫；Email: yls2011114@163.com。

占貞貞，副教授、副研究員，Email: zhanzz@#edu.cn；劉中民，教授、主任醫(yī)師，Email: liu.zhongmin@#edu.cn。

研究報告

R-33

A

1671-7856(2016) 08-0042-05

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.08.006

2016-04-26