PCR在自發(fā)性腹膜炎快速診斷中的應(yīng)用

喻長法 葉麗君 章靈敏 段達榮 徐黔寧

PCR在自發(fā)性腹膜炎快速診斷中的應(yīng)用

喻長法 葉麗君 章靈敏 段達榮 徐黔寧

目的 探討聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）在自發(fā)性腹膜炎快速診斷中的應(yīng)用價值。方法 針對原核微生物16S rRNA基因的高度保守性，設(shè)計合成所有細(xì)菌、革蘭陰性菌（G-）和革蘭陽性菌（G+）的通用引物，用PCR擴增已知的病原菌，檢測其特異性。用此方法擴增自發(fā)性腹膜炎患者的腹水標(biāo)本，將結(jié)果與培養(yǎng)法進行對比分析。結(jié)果 通用引物擴增后，已知病原菌均獲得371bp產(chǎn)物。G-菌通用引物擴增后，G-菌均獲得252bp產(chǎn)物，G+菌無相應(yīng)產(chǎn)物；G+菌通用引物擴增后，G+菌均獲得202bp產(chǎn)物，G-菌無相應(yīng)產(chǎn)物。PCR方法的陽性率顯著高于培養(yǎng)法（P＜0.05）。結(jié)論 PCR檢測細(xì)菌16S rRNA基因，具有檢測速度快、敏感性高和結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點，具有一定的實用價值。

自發(fā)性腹膜炎 16S rRNA基因 聚合酶鏈反應(yīng)

自發(fā)性腹膜炎（SBP）是腹腔內(nèi)及鄰近器官在無需外科處理的細(xì)菌感染來源情況下發(fā)生的細(xì)菌性腹膜炎，是失代償期肝硬化伴腹水患者常見的并發(fā)癥［1］。至今為止，SBP的確診主要依賴于腹水培養(yǎng)及腹水常規(guī)檢查，但培養(yǎng)陽性率低，耗時長，不能滿足臨床需求。本研究將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)應(yīng)用于腹水細(xì)菌的快速檢測，取得了較好的效果，現(xiàn)報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2012年1月至2014年6月本院感染科和消化內(nèi)科收治的肝硬化失代償期伴腹水的住院患者共73例，其中男39例，女34例；年齡31～82歲，平均年齡（54.0±13.5）歲。其診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2000年西安全國傳染病與寄生蟲病會議制訂的標(biāo)準(zhǔn)［2］。

1.2 臨床標(biāo)本的采集 無菌條件下抽取患者腹水30ml，10ml用于細(xì)菌需氧和厭氧培養(yǎng)，10ml用于腹水生化和常規(guī)檢查，10ml用于PCR檢測。

1.3 已知實驗菌株的來源 已知菌株為本院檢驗科微生物室保存的菌株，人類基因組DNA、巨細(xì)胞病毒、白色假絲酵母菌由省臨床檢驗中心提供。

1.4 儀器與試劑 9600型PCR反應(yīng)儀由美國Perkin elmer公司提供，DYY-III型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀由北京六一儀器廠提供，Gel doc l000型凝膠圖像處理系統(tǒng)由美國BIO-RAD公司提供。PCR試劑盒由大連寶生物公司提供。

1.5 方法 （1）引物設(shè)計：所有細(xì)菌通用引物為：上游5'-TGCGGTTGGATCACCTCCT-3'，下游5'-TCCCCACCTTCCTCCAGTT-3'。革蘭陰性菌（G-）引物：上游5'-GCATCAGGTCAAGTCATC-3'，下游5'-CCCGGCTTCGTATTCACC-3'。革蘭陽性菌（G+）引物：上游5'-GCATCAGGTCAAGTCATC-3'，下游5'-GGCTTCTGCTGTTACAAA-3'。（2）反應(yīng)體系和反應(yīng)條件：PCR反應(yīng)體系為：2.5mmol/L dNTPs 4μl，25 mmol/L MgCl24μl，10×Buffer 5μl，20μmol/L引物各1μl，5U/μl Taq酶0.25μl，模板5.0μl，加無菌雙蒸餾水至50μl。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性6 min，94℃變性1min，54℃退火1min，72℃ 2min共循環(huán)30次，最后延伸10min。（3）基因產(chǎn)物分析：將PCR擴增產(chǎn)物2μl與1μl上樣緩充液充分混勻后，加樣于1.5%瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠），經(jīng)100 V電壓電泳30min，將電泳后的瓊脂糖凝膠置于凝膠圖像分析儀上，紫外線透射掃描觀察并拍照保存。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。兩方法陽性率比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌通用引物的特異性分析 已知細(xì)菌16S rRNA基因經(jīng)PCR擴增后均有371 bp的產(chǎn)物，而人類基因組DNA、巨細(xì)胞病毒和白色假絲酵母菌無對應(yīng)產(chǎn)物，見圖1。

2.2 G-菌通用引物擴增結(jié)果 G-菌經(jīng)其通用引物擴增后，均獲得252bp產(chǎn)物，而G+菌無相應(yīng)產(chǎn)物，見圖2。

圖1 已知病原菌PCR擴增后產(chǎn)物電泳圖

圖2 革蘭陰性菌通用引物擴增后產(chǎn)物電泳圖

2.3 G+菌通用引物擴增結(jié)果 G+菌經(jīng)其通用引物擴增后，均獲得202bp產(chǎn)物，而G-菌無相應(yīng)產(chǎn)物，見圖3。

圖3 革蘭陽性菌通用引物擴增后產(chǎn)物電泳圖

2.4 臨床標(biāo)本兩方法陽性率的比較 培養(yǎng)法檢測11例陽性，PCR方法檢測25例陽性，PCR方法陽性率顯著高于培養(yǎng)法（P＜0.05），見表1。

表1 兩種方法敏感性比較

2.5 臨床標(biāo)本兩方法檢測結(jié)果比較 培養(yǎng)法7株G-菌，4株G+菌，PCR分型與其一致。另PCR方法分型9株G-，5株G+，培養(yǎng)法為陰性結(jié)果。

3 討論

SBP是肝硬化腹腔積液常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，發(fā)生率可達10%～25%，病死率高達50%，而早期臨床表現(xiàn)不典型，快速診斷和積極治療是挽救患者生命的關(guān)鍵［3］。

16S rRNA基因序列具有總長度適宜、多信息和多拷貝等特點，存在于所有原核微生物基因組中，故在細(xì)菌學(xué)研究中常被作為研究的靶分子，用于病原微生物的快速鑒定。借助于16S rRNA基因的保守區(qū)，可設(shè)計出多條引物，用于細(xì)菌感染性疾病的快速診斷。馮群燦等［4］將16S rRNA基因檢測應(yīng)用于慢性非細(xì)菌性前列腺炎患者的前列腺液，擴增出1032bp的產(chǎn)物，16S rRNA基因檢測陽性率為38.5%，說明在慢性非細(xì)菌性前列腺炎的前列腺液中，仍有許多病原菌存在的可能。張芳等［5］設(shè)計一條通用引物，用于新生兒膿毒癥早期診斷，PCR檢測細(xì)菌DNA均得到預(yù)期的約371 bp大小的擴增產(chǎn)物。陳群偉等［6］研究抗生素應(yīng)用對16S rRNA基因芯片檢測腹水細(xì)菌的影響，患者使用抗生素后，培養(yǎng)法陽性率明顯降低，而16S rRNA基因芯片幾乎不受影響且陽性率顯著高于培養(yǎng)法。潘紅英等［7］應(yīng)用定量PCR聯(lián)合基因芯片檢測腹水細(xì)菌16 SrRNA診斷自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎，定量PCR聯(lián)合基因芯片檢測陽性率為22.4%，其中G-菌9份，G+菌8份；腹水細(xì)菌培養(yǎng)陽性率為7.9%，均為G-菌，兩種方法差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。湯偉等［8］用半巢式PCR檢測細(xì)菌并革蘭分型，半巢式PCR陽性率顯著高于培養(yǎng)法，革蘭分型與培養(yǎng)法吻合度高。

本研究采用細(xì)菌通用引物擴增已知病原菌，均獲得371bp擴增產(chǎn)物，G-菌通用引物擴增后，G-菌均獲得252bp產(chǎn)物，G+菌無相應(yīng)產(chǎn)物；G+菌通用引物擴增后，G+菌均獲得202bp產(chǎn)物，G-菌無相應(yīng)產(chǎn)物，證實細(xì)菌通用引物、G-菌和G+菌的通用引物具有特異性。培養(yǎng)法陽性率為15.07%，PCR方法陽性率為34.25%，PCR方法陽性率顯著高于培養(yǎng)法（P＜0.05）。對兩種方法革蘭分型對比分析可知，培養(yǎng)法7株G-菌，4株G+菌，PCR分型與其一致，另PCR方法分型9株G-，5 株G+，培養(yǎng)法為陰性結(jié)果，證明PCR分型結(jié)果可靠。

總之，16S rRNA基因應(yīng)用于SBP患者腹水細(xì)菌檢測，具有檢測速度快、特異性高等特點，并能將病原菌進行初步分型，指導(dǎo)SBP抗生素的選擇方面可能有重要的應(yīng)用價值，尤其是對腹水培養(yǎng)陰性的臨床感染患者，顯著優(yōu)于腹水培養(yǎng)方法，可以提高SBP的確診率，有利于臨床及時診斷和治療。

1 Runyon BA.Practice Guidelines Committee，American Association for the study Liver Disease （AASLD）.Management of adult patients with ascites due to cirrhosis .Hepatology，2009，49（6）：2087～2107.

2 中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲病學(xué)分會、肝病學(xué)分會.病毒性肝炎防治方案.傳染病信息，2000，13（4）：141～142.

3 陳銀蕓，霍繼榮.乙型肝炎肝硬化并發(fā)腹膜炎患者血清及腹腔積液TNF-α、IL-8、IL-18水平臨床意義的探討.中國當(dāng)代醫(yī)藥，2010，17（14）：32～34.

4 馮群燦，戎永楚. 16S rRNA基因檢測在慢性非細(xì)菌性前列腺炎患者中的應(yīng)用 .現(xiàn)代實用醫(yī)學(xué)，2013，25（5）：574～576.

5 張芳，宋力，黨力亨，等.基因檢測在新生兒膿毒癥早期診斷中的價值.實用兒科臨床雜志，2011，26（10）：764～766.

6 陳群偉，潘宏儀，孫洪運，等.抗生素應(yīng)用對16S rRNA基因芯片檢測腹水細(xì)菌的影響 .國際流行病學(xué)傳染病學(xué)雜志，2012，39（2）：92～94.

7 潘紅英，諶翠容，尚世強，等.定量PCR聯(lián)合基因芯片檢測腹水細(xì)菌16SrRNA診斷自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎.中華肝臟病雜志，2011，19（4）：297～300.

8 湯偉，汪曉鶯，馬國光，等.快速檢測細(xì)菌并革蘭分型的半巢式聚合酶鏈反應(yīng)及其初步應(yīng)用 .中國人獸共患病雜志，2005，21（2）：164～168 .

Objective To explore the application value of PCR in rapid diagnosis spontaneous peritonitis. Methods PCR primers of all bacteria，gram-negative and gram-positive were synthesized according to the high conservative region of 16S rRNA gene in bacteria.，the known pathogens were amplified by PCR to test its specificity.Ascites samples were tested by PCR，and PCR results were compared with culture method. Results The known pathogens obtained 371 bp product after general primer amplification.Gram-negative bacteria obtained 252 bp product after gramnegative bacteria general primer amplification，while gram-positive bacteria without corresponding product. Gram-positive bacteria obtained 202 bp product after gram-positive bacteria general primer amplification，while gram- negative bacteria without corresponding product. The positive rate of PCR method was significantly higher than that of culture method（P＜0.05）. Conclusion PCR technology has advantages of short detection time，high sensitivity and accurate in identifying 16S rRNA gene of bacteria.

Spontaneous bacterial peritonitis（SBP） 16S rRNA gene Polymerase chain reaction（PCR）

·臨床研究·

浙江省臺州市黃巖區(qū)科技局資助項目（201305926）

318020 浙江省臺州市第一人民醫(yī)院