喉癌干細(xì)胞的新型培養(yǎng)純化方法及臨床應(yīng)用前景

段廣亮 王凱峰 戴輝萍 唐婷婷 丁飛

喉癌干細(xì)胞的新型培養(yǎng)純化方法及臨床應(yīng)用前景

段廣亮 王凱峰 戴輝萍 唐婷婷 丁飛

目的 通過含生長因子的無血清培養(yǎng)基（SFM）培養(yǎng)Hep-2喉癌細(xì)胞，分離并擴(kuò)增腫瘤干細(xì)胞，為進(jìn)一步制備放療增敏劑做基礎(chǔ)研究。方法 含生長因子的無血清培養(yǎng)基（SFM）培養(yǎng)Hep-2喉癌細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞中側(cè)群細(xì)胞的比例。當(dāng)側(cè)群細(xì)胞比例達(dá)25%時，收集全部細(xì)胞球，F(xiàn)ACS篩選出CD133+、CD44+細(xì)胞作為喉癌干細(xì)胞。結(jié)果 成功培養(yǎng)出側(cè)群細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測其比例達(dá)26.2%，F(xiàn)ACS篩選出CD133+CD44+細(xì)胞的比例均＞91%。結(jié)論 成功培養(yǎng)出高濃度喉癌干細(xì)胞。

無血清培養(yǎng)基 重組表皮生長因子 成纖維生長因子 側(cè)群細(xì)胞

腫瘤干細(xì)胞是腫瘤中少數(shù)具有自我更新、無限增殖及多向分化潛能的細(xì)胞，且固有放射抵抗能力，而其它腫瘤細(xì)胞群并不增殖或數(shù)次增殖后自然凋亡。因此一般認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞是腫瘤發(fā)生發(fā)展和放射抵抗的根源［1～4］。近年成功分離鑒定近10種腫瘤干細(xì)胞，鑒別腫瘤干細(xì)胞目前常用的方法是對富集腫瘤細(xì)胞表面特殊抗原的識別，頭頸部鱗狀細(xì)胞癌表面標(biāo)志物的研究較少，較為認(rèn)可的“標(biāo)志”細(xì)胞是流式細(xì)胞儀檢測的側(cè)群細(xì)胞（腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞）和CDl33+、CD44+腫瘤細(xì)胞［5］，但分選效果不佳，作者自2010年6月至2012年3月結(jié)合自身試驗條件及喉癌干細(xì)胞的特點通過長期實驗摸索分兩步培養(yǎng)純化喉癌干細(xì)胞，成功的經(jīng)流式細(xì)胞儀分選出具有較高濃度CDl33+、CD44+喉癌干細(xì)胞。報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 Anti-CD44-FITC（美國eBioscience公司）；Anti-CD133-PE（美國eBioscience公司）；Hocest33342（碧云天公司）；碘化丙啶（PI）（美國 Sigma公司）；維拉帕米（Verapamil）（美國 Sigma公司）；DMEM/ F12（美國Gibco公司）；重組表皮生長因子（EGF）（美國PeproTech公司）；成纖維生長因子（bFGF）（美國PeproTech公司）

1.2 實驗方法 （1）細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇：①凍存：消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液收集到離心管中保存。1000r/min離心10min，棄上清液。沉淀加含10%DMSO的培養(yǎng)液，計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整至5×106/ml左右。將懸浮液分到凍存管中，1ml/管。將凍存管擰緊封嚴(yán)，如用安瓿瓶火焰封口時，封口須嚴(yán)密，否則復(fù)蘇時較易爆裂。管瓶下部貼上標(biāo)簽，注明細(xì)胞的種類及凍存日期。根據(jù)冷凍要求按順序降溫：室溫時→4℃（20min）→冰箱冷凍室（30min）→低溫冰箱（-30℃ 1h）→液氮。②復(fù)蘇：準(zhǔn)備37℃的溫浴鍋，從液氮中取出凍存管、迅速置于37℃溫水中并不斷攪動，使凍存管中的凍存物在1min之內(nèi)融化。打開凍存管，將細(xì)胞懸液吸到離心管中。1000rpm離心10min，棄去上清液。沉淀加10ml培養(yǎng)液，吹打均勻，再離心10min，棄上清液。加適當(dāng)培養(yǎng)基后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)，第2天觀察生長情況。（2）喉癌干細(xì)胞球培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化試驗：采用常用的干細(xì)胞微球體分離培養(yǎng)法：①先將Hep-2喉癌細(xì)胞接種于含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)傳代。待細(xì)胞生長至80%瓶底面積時，用PBS液清洗，質(zhì)量濃度為2.5g/L胰蛋白酶消化，吸管反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液。②離心除去終止消化時殘留的含血清培養(yǎng)基后重懸于無血清培養(yǎng)基中，無血清培養(yǎng)基為在DMEM/ F12培養(yǎng)基中添加重組表皮生長因子（20μg/L）和重組成纖維生長因子（10μg/L），L-谷氨酰胺（2mmol/L），胰島素（4U/L），青霉素G（1×105U/L），鏈霉素（100mg/ L）。③臺盼藍(lán)染色、計數(shù)重懸成103/ml單細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶，在37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶直立、每日搖數(shù)次以利細(xì)胞懸浮生長，觀察微球形成，在每個培養(yǎng)瓶中加入2 ml/2d新鮮無血清培養(yǎng)基，傳代1次/6d。④待喉癌細(xì)胞增殖形成細(xì)胞球4d后，Accutase消化、吹打成單細(xì)胞，洗滌后在SFM中傳代培養(yǎng)，以擴(kuò)增和富集喉癌干細(xì)胞，按1：4的比例傳代。（3）側(cè)群細(xì)胞的檢測：①選擇對數(shù)生長期生長的細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液的密度至1×109/L。②準(zhǔn)備2個干燥無菌的流式上樣管（5 ml，材料為聚丙烯），分別在2管中加入上述細(xì)胞懸液各1ml，然后再加入Hoechst33342溶液，使終末濃度達(dá)到5 mg/L，在對照管中加入維拉帕米溶液，使終末濃度達(dá)到濃度50 mg/L。③給予反復(fù)吹打數(shù)次，均勻后置于37℃恒溫水浴箱中120 min，期間緩和搖動上樣管1次/15min使細(xì)胞充分染色。④待染色結(jié)束后在4℃ 1000 r/min離心機(jī)離心10min，棄上清液，加入4℃磷酸鹽緩沖液吹洗1次，再4℃ 1000 r/min離心10min，棄上清液，重懸于體積分?jǐn)?shù)為2%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液中。⑤放在4℃環(huán)境中準(zhǔn)備上機(jī)檢測。（4）喉癌干細(xì)胞的篩選及體外生長HE染色觀察：①當(dāng)側(cè)群細(xì)胞比例達(dá)25%時，收集全部生長細(xì)胞球，制成單細(xì)胞PBS懸液100μl，計數(shù)細(xì)胞密度為1×107/ml。②用臺盼藍(lán)染色計活細(xì)胞數(shù)，要求活細(xì)胞數(shù)90%～95%。③加入Anti-CD44-FITC和Anti-CD133-PE各5μl，4℃避光孵育30min。④離心去上清液，PBS洗滌≥3次，1500r/min，離心3min，200目細(xì)胞網(wǎng)篩過濾。⑤加300μl PBS（pH=7.4），上機(jī)檢測。⑥分選之后調(diào)整細(xì)胞濃度達(dá)到1×106/ml，接種到含蓋玻片的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，細(xì)胞長成單層后，取出蓋玻片，PBS洗滌，用95%的酒精固定15min，再洗滌，浸入蘇木精染液中染色10min，洗滌；浸入淡氨水中之前用稀鹽酸酒精溶液分色，使細(xì)胞核藍(lán)化5min洗滌；伊紅染液染色10min，洗滌；無水酒精脫水，過二甲苯3次，封片，光鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 成功誘導(dǎo)和富集喉癌干細(xì)胞 （1）以含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)Hep-2喉鱗癌細(xì)胞系細(xì)胞：接種后8h所有細(xì)胞均貼壁，3～4d后細(xì)胞即長滿瓶底，培養(yǎng)的喉癌細(xì)胞有明顯的腫瘤細(xì)胞特征：上皮樣形態(tài)，多邊形，似鋪路石樣排列，折光性好，不形成懸浮細(xì)胞球（如圖1）。（2）接種細(xì)胞于無血清培養(yǎng)基中：Hep-2喉鱗癌細(xì)胞株細(xì)胞接種于SFM中，培養(yǎng)瓶直立，每日搖數(shù)次，開始大部分細(xì)胞貼壁，在第3～7天，部分細(xì)胞開始懸浮，小球狀增生形成，部分細(xì)胞崩解死亡，不能在SMF培養(yǎng)基中存活生長。第9天時，小球狀細(xì)胞團(tuán)部分凋亡，但仍能見小部分細(xì)胞擴(kuò)增繼續(xù)形成細(xì)胞球，搖晃培養(yǎng)瓶可見較少的細(xì)胞球沉于培養(yǎng)瓶底部。球內(nèi)細(xì)胞折光性較好，生長緊密，不能準(zhǔn)確辨別細(xì)胞間的分界限。新形成的腫瘤干細(xì)胞球外形不規(guī)則，常以“發(fā)芽”的生長方式連接在球體上。傳代時通過Accutase消化、吹打成單細(xì)胞懸液，后第l～2天單個細(xì)胞間相互聚集連接成“樹枝狀”懸浮于SFM中，第3～4天形成不規(guī)則細(xì)胞球，第5～6天逐漸形成規(guī)則球形。隨著傳代次數(shù)的增加，球體趨于圓形（如圖2）。

圖1 含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的喉癌細(xì)胞

圖2 SFM培養(yǎng)喉癌細(xì)胞形成的細(xì)胞球（原放大倍數(shù)×200）

2.2 側(cè)群細(xì)胞的分選 側(cè)群細(xì)胞能排出熒光染料Hoechst33342而呈弱染色狀態(tài)，位于流式圖的左下角熒光弱染區(qū)域。對照組中加維拉帕米，抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)運蛋白的功能，改變側(cè)群細(xì)胞外排熒光染料的特性，使側(cè)群細(xì)胞的比例減少到（0.0±0.0）%，經(jīng)多次擴(kuò)增和富集后成功使側(cè)群細(xì)胞達(dá)到26.2%（如圖3）。用離心管收集分選的SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞備用。

圖3 Hoechst33342組（左）和Hoechst33342+維拉帕米組（右）染色結(jié)果

圖4 流式細(xì)胞儀篩選實體瘤來源的CD44+、CDl33+喉癌干細(xì)胞結(jié)果

圖5 喉癌干細(xì)胞HE染色結(jié)果

2.3 喉癌干細(xì)胞的篩選 采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞微球體，富集喉癌干細(xì)胞。流式細(xì)胞儀分別篩選出CD44+、CDl33+喉癌干細(xì)胞。分選前喉癌細(xì)胞CD44+、CDl33+的表達(dá)率均＜3%，分選后均＞91%，分選后喉癌細(xì)胞HE染色可見細(xì)胞分布均勻，體積較大，呈梭形，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的比例接近于1，核大濃染，核仁大而突出，有病理性核分裂相，符合惡性腫瘤干細(xì)胞病理特點（圖4、5）。

3 討論

目前腫瘤干細(xì)胞的分選可通過功能學(xué)分選（腫瘤干細(xì)胞高表達(dá)耐藥蛋白而將核染料Hoechst 33342排除出細(xì)胞外。流式圖中顯示這類細(xì)胞稱為側(cè)群細(xì)胞）或免疫學(xué)分選（流式或免疫磁珠法分選出腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志陽性的細(xì)胞）［6］。但上述兩種方法最大的問題是腫瘤干細(xì)胞存在于腫瘤組織中數(shù)量稀少，若純化足量的細(xì)胞以滿足研究所需，工作量極大。作者通過長期實驗摸索發(fā)現(xiàn)，在無血清培養(yǎng)基中添加bFGF、EGF、L-谷氨酰胺，胰島素作為血清替代物既保留了細(xì)胞賴以生存的必需營養(yǎng)物質(zhì)又去除了血清中的促分化劑，通過富集培養(yǎng)成功使側(cè)群細(xì)胞＞25%。喉癌鱗狀細(xì)胞中，CD44和CD133的陽性比例均＜3%，作者成功地通過流式細(xì)胞儀分選出具有CD44+、CDl33+喉癌干細(xì)胞的比例均＞91%。

流式細(xì)胞儀分選法，也稱為熒光活化細(xì)胞分選法，是利用待分選細(xì)胞結(jié)合熒光素標(biāo)記抗體能力的差異或者利用外排熒光染料性質(zhì)的差異來分離腫瘤干細(xì)胞，是目前應(yīng)用最為廣泛的分離技術(shù)，已應(yīng)用于人白血病、乳腺癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的分離。磁性激活細(xì)胞分選法基于細(xì)胞表面抗原與連結(jié)有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而留滯在磁場中，無該類表面抗原的細(xì)胞不能與連接有磁珠的特異性抗體結(jié)合，不能被磁珠捕獲，因而無磁性，這些細(xì)胞不能在磁場中留下，細(xì)胞進(jìn)而得到分離，目前膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的分離常采用此法。還有一種腫瘤干細(xì)胞分選法是側(cè)群細(xì)胞分選法，有關(guān)研究表明體外培養(yǎng)的側(cè)群細(xì)胞具有神經(jīng)干細(xì)胞特性，且與非側(cè)群細(xì)胞不同，側(cè)群可以在裸鼠中高效表達(dá)移植瘤。由于腫瘤干細(xì)胞包膜高度表達(dá)ATP結(jié)合盒（ATP-binding cassette，ABC）膜轉(zhuǎn)運蛋白（包括P-糖蛋白P-gp、乳腺癌耐藥蛋白、ABCG1、ABCG2等）對進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的化療藥物和染料有外排泵作用。因此可以利用側(cè)群細(xì)胞不被Hoechst33342染色的特性，即利用干細(xì)胞通過分子標(biāo)記來分離純化腫瘤干細(xì)胞，這一方法有利于分離純化未知表面標(biāo)志物的腫瘤干細(xì)胞。研究證明大多數(shù)腫瘤細(xì)胞系中存在側(cè)群細(xì)胞［5］，并在C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤、MCF-7乳腺癌、B104成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系中成功分離出側(cè)群細(xì)胞亞群，且證實了C6中僅占細(xì)胞總數(shù)0.4%的側(cè)群細(xì)胞具有多向分化和少量成瘤的特性，提示側(cè)群細(xì)胞是適用于腫瘤干細(xì)胞分離的一種方法。目前尚無最優(yōu)化的腫瘤干細(xì)胞分選方案，流式細(xì)胞儀分選與純化具有高敏感和高特異性，由于流式細(xì)胞分選法是在分選血細(xì)胞的過程中建立的，許多腫瘤細(xì)胞可能難以承受高壓小直徑的液流，進(jìn)而影響分選細(xì)胞的活性，磁性激活細(xì)胞分選法對細(xì)胞損傷小，不會影響細(xì)胞的活性與功能，微型磁珠可被生物降解等優(yōu)點，但與流式細(xì)胞分選法相比分選純度較低。側(cè)群細(xì)胞分離的最優(yōu)化條件是用355nm左右的紫外光激發(fā)，需要特殊的氬氣激發(fā)光源，其功率較高，需要水冷卻系統(tǒng)及相應(yīng)的濾片，這些設(shè)備價格昂貴，限制了側(cè)群細(xì)胞分選法的普遍推廣。

我國喉癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，成為危害嚴(yán)重的常見惡性腫瘤之一。放療是喉癌的臨床最重要的治療手段之一，但是腫瘤細(xì)胞固有的和放療誘導(dǎo)的放療抵抗嚴(yán)重影響了療效，希望在分選出喉癌干細(xì)胞的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究開發(fā)出放療增敏劑，解決喉癌放療抵抗，根治腫瘤。

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Objective To explore a new culturing method for Hep-2 Laryngeal Cancer Cell by menas of the SFM of containing growth factor separate and to amplify cancer stem cell. Methods Culturing Hep-2 Laryngeal Cancer Cell by menas of the SFM of containing growth factor，F(xiàn)ACS was used to detect the ratio of side population. When the ratio of side population expressed reached 25%，the whole cell balls were collected. FACS was used to screen out CD133+CD44+cells， which were laryngeal cancer stem cell. Results The side population were successful cultured and reached the ratio of 26.2% by detection of FACS；Overtop 91% of CD133+CD44+cells were screened out by FACS. Conclusion High ration of laryngeal cancer stem cell can be successfully cultured.

SFM EGF bFGF Side population

310015 杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院