傳統(tǒng)錦州蝦醬中產(chǎn)蛋白酶嗜鹽菌的分離與鑒定

呂欣然,李　瑩,馬歡歡,繆璐歡,杜靜芳,白鳳翎,季廣仁,勵(lì)建榮

(1.渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院,遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013;2.錦州筆架山食品有限公司,遼寧錦州 121007)

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傳統(tǒng)錦州蝦醬中產(chǎn)蛋白酶嗜鹽菌的分離與鑒定

呂欣然,李瑩,馬歡歡,繆璐歡,杜靜芳,白鳳翎*,季廣仁,勵(lì)建榮

(1.渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院,遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013;2.錦州筆架山食品有限公司,遼寧錦州 121007)

目的:從傳統(tǒng)錦州蝦醬中分離產(chǎn)蛋白酶嗜鹽菌,并對(duì)其進(jìn)行鑒定。方法:應(yīng)用1.0%脫脂乳Gibbons培養(yǎng)基分離產(chǎn)蛋白酶嗜鹽菌,經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)對(duì)其鑒定。采用SDS-PAGE分析蝦醬中可溶性蛋白的變化。結(jié)果:獲得16株產(chǎn)蛋白酶嗜鹽菌,菌株CW0-1、CW0-2、CW0-3和 CW0-4是弧菌屬,菌株CW1-1、CW2-1和CW2-2是尼泊爾葡萄球菌,菌株CW2-3、CW5-1、CW5-2、CW5-3是馬胃葡萄球菌,菌株CW3-1、CW3-2、CW4-1、CW4-2是枝芽孢桿菌,菌株CW4-3是獨(dú)島枝芽孢桿菌?；【鷮僦饕嬖谟谠衔r中,嗜鹽性葡萄球菌出現(xiàn)在發(fā)酵2個(gè)月和5個(gè)月,枝芽孢桿菌出現(xiàn)在發(fā)酵3～4個(gè)月。葡萄球菌和枝芽孢桿菌呈現(xiàn)交替演變,是蝦醬發(fā)酵前期的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)蛋白酶嗜鹽菌。蝦醬中的總可溶性蛋白隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降。結(jié)論:葡萄球菌和枝芽孢桿菌是發(fā)酵前期蝦醬中的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)蛋白酶嗜鹽菌,也是降解蛋白的主體微生物類群。

傳統(tǒng)錦州蝦醬,產(chǎn)蛋白酶嗜鹽菌,發(fā)酵前期,分離與鑒定

傳統(tǒng)錦州蝦醬是以新鮮渤海出產(chǎn)的烏蝦和白蝦為原料,添加20%～30%高濃度的食鹽,在自然條件下經(jīng)1至2年長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵而成的地方海產(chǎn)調(diào)味品。嗜鹽菌(halophilic bacteria)是一類生活在高鹽度環(huán)境中的微生物,主要生長(zhǎng)在鹽湖、鹽堿地、海水及腌制食品等高鹽環(huán)境[1]。嗜鹽菌中既包括芽孢桿菌屬(Bacillus)、微球菌屬(Micrococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、片球菌屬(Pediococcus)中極度耐鹽的細(xì)菌類群,還包括含有細(xì)菌視紫紅質(zhì)光合色素的紅色極端嗜鹽古細(xì)菌(extremely halophilic red archaea)和嗜鹽乳酸菌(halophilic lactic acid bacteria)[2]。依據(jù)嗜鹽濃度的不同,嗜鹽菌可分為輕度嗜鹽菌,鹽濃度為0.2～0.5 mol/L;中度嗜鹽菌鹽濃度為0.5～2.0 mol/L;極端嗜鹽菌鹽濃度為大于3.0 mol/L[3]。嗜鹽菌的發(fā)酵作用主要表現(xiàn)在海產(chǎn)調(diào)味品的發(fā)酵前期[4],在發(fā)酵前期一些菌群可產(chǎn)生蛋白酶降解蝦體蛋白形成氨基酸等小分子代謝產(chǎn)物,賦予蝦醬以特殊的風(fēng)味和品質(zhì)。黃紫燕等[5]從發(fā)酵半年的魚(yú)露中分離獲得一株嗜鹽產(chǎn)蛋白酶乳酸菌T1,通過(guò)形態(tài)學(xué)初步鑒定菌株T1乳酸菌為芽孢桿菌屬。來(lái)自海洋的產(chǎn)蛋白酶嗜鹽菌主要包括芽孢桿菌、葡萄球菌和微球菌,其中芽孢桿菌是普遍關(guān)注的微生物類群,夏偉等[6]從海洋環(huán)境中分離獲得一株產(chǎn)蛋白酶的海洋菌ZR-PW,通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rRNA鑒定其為地衣芽孢桿菌,因其分解蛋白能力強(qiáng),可應(yīng)用于食品、釀造、醫(yī)藥和紡織等工業(yè)領(lǐng)域。Karbalaei-Heidari等[7]從伊朗各區(qū)域分離獲得幾株中度嗜鹽菌,篩選出一株產(chǎn)蛋白酶的中度嗜鹽菌鹽湖菌屬(Salinivibrio sp.)AF-2004。本文應(yīng)用1.0%脫脂乳Gibbons培養(yǎng)基從發(fā)酵前期的傳統(tǒng)錦州蝦醬分離產(chǎn)蛋白酶嗜鹽菌,通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)方法對(duì)菌株進(jìn)行鑒定,并利用SDS-PAGE技術(shù)對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間蝦醬中蛋白降解的過(guò)程進(jìn)行分析,探究產(chǎn)蛋白酶菌株和蝦醬蛋白演變的相關(guān)特征,為利用產(chǎn)蛋白酶嗜鹽菌提升蝦醬發(fā)酵進(jìn)程奠定一定的基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

蝦醬樣品自2014年4月25日原料投放第一天,每隔30 d從錦州筆架山食品有限公司進(jìn)行采樣。樣品分別采自5個(gè)缸距離表面30 cm的中間部分,垂直采取200 g。采集后的樣品保存于帶蓋玻璃瓶中,4℃冷藏。共采集5個(gè)月,樣品按發(fā)酵時(shí)間記為0、1、2、3、4、5。分析前采用四等縮分法至25.0 g,備用。

SPX-250生化培養(yǎng)箱寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠;GI54DWS立式壓力蒸汽滅菌鍋致微儀器有限公司;DL-CJ-2N超級(jí)潔凈工作臺(tái)北京東聯(lián)哈爾儀器制造;BMM-480YS生物顯微鏡上海繪統(tǒng)光學(xué)儀器有限公司;PCR儀德國(guó)Eppendorf公司;PHSJ-3F pH計(jì)上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;Quantity one凝膠成像系統(tǒng)美國(guó)Bio-Rad公司;IKA Vortex GENIUS 3振蕩器德國(guó)IKA公司;5804R高速冷凍離心機(jī)德國(guó)Eppendorf公司;移液器,德國(guó)Eppendorf公司。

Gibbons培養(yǎng)基:胰蛋白胨5.0 g,酵母粉10.0 g,檸檬酸鈉3.0 g,氯化鉀2.0 g,MgSO4·7H2O 20.0 g,氯化鈉50.0 g,添加1000 mL蒸餾水,調(diào)pH7.2,121℃滅菌20 min;固體培養(yǎng)基需添加1.5%的瓊脂粉。生化鑒定管杭州天和微生物試劑有限公司;細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒、DNA marker-D、Taq PCR Master mix上海生工生物工程有限公司;其他化學(xué)試劑北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1產(chǎn)蛋白酶嗜鹽菌的富集及初步篩選取25.0 g蝦醬樣品置于225 mL滅菌水中振蕩5 min,靜置,取上層清液200 μL接種于10.0 mL Gibbons液體培養(yǎng)基中進(jìn)行富集。取適量富集培養(yǎng)液接種于含1.0%脫脂乳的Gibbons固體培養(yǎng)基,30℃培養(yǎng)24～48 h。選取菌落周圍產(chǎn)生透明水解圈即產(chǎn)蛋白酶嗜鹽菌的菌落分離純化。

1.2.2形態(tài)學(xué)分析將分離的產(chǎn)蛋白酶嗜鹽菌單菌落劃線接種于Gibbons固體培養(yǎng)基進(jìn)行純化,30℃培養(yǎng)48 h,挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色,鏡檢。

1.2.3生理生化鑒定參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[8]和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[9]進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn),包括半乳糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、果糖、山梨醇和甘露醇等發(fā)酵糖醇實(shí)驗(yàn),過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)以及硫化氫實(shí)驗(yàn)。

1.2.4分子生物學(xué)鑒定菌株DNA采用細(xì)菌基因組試劑盒提取。PCR擴(kuò)增引物為:27f:5′-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3′,1492r:5′-TACGGYTACC TTTGTTACGACTT-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μL):上下游引物各1.0 μL,DNA模板1.0 μL,Taq PCR Master mix 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序:94℃ 2 min,94℃ 1 min,60℃ 1 min,72℃ 90 s,循環(huán)30次,4℃保溫。PCR純化產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析后送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。測(cè)得序列登陸GenBank進(jìn)行BLAST同源性比較,應(yīng)用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.2.5蝦醬發(fā)酵液中總蛋白的提取和測(cè)定稱取10.0 g蝦醬樣品置于50 mL離心管,加入30.0 mL超純水,均勻混合后,11000 r/min離心15 min,取上層清液備用。

表1　蝦醬中產(chǎn)蛋白酶嗜鹽菌的形態(tài)學(xué)特征

取10 μL樣品溶液加入適量的緩沖液將樣品濃度調(diào)整為1.0 mg/mL,煮沸3 min。按參考文獻(xiàn)[10]進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,分離膠10%,濃縮膠5%,上樣量10 μL,濃縮膠過(guò)程電壓恒定為80 V,分離膠過(guò)程電壓恒定為120 V。至溴酚藍(lán)指示劑抵達(dá)膠片底部邊沿時(shí)停止電泳。

電泳結(jié)束后將膠片轉(zhuǎn)移至染色盒中,加入適量含0.1%考馬斯亮藍(lán)染色液(V異丙醇∶V冰醋酸∶V超純水=25∶10∶65),在搖床上染色約1 h。倒掉染色液,加入適量脫色液(V冰醋酸∶V乙醇∶V超純水=10∶5∶85),搖床上脫色,直至條帶清晰無(wú)底色。采用Quantity One系統(tǒng)拍照。

2　結(jié)果與討論

2.1產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選

從1.0%脫脂乳的Gibbons固體培養(yǎng)基分離獲得16株產(chǎn)蛋白酶嗜鹽菌,圖1是發(fā)酵3個(gè)月時(shí)分離的菌株CW3-1(左)和發(fā)酵4個(gè)月的菌株CW4-3(右)分解酪蛋白形成的透明圈,從圖中可以看出兩菌株產(chǎn)生的蛋白酶降解酪蛋白的比較明顯。

圖1　蝦醬中產(chǎn)蛋白酶嗜鹽菌在脫脂乳平板上的菌落透明圈Fig.1　The transparent circles on skim-milk culture of protease-producing halophilic bacteria in shrimp paste

2.2產(chǎn)蛋白酶菌株形態(tài)特征和生理生化鑒定

2.2.1產(chǎn)蛋白酶菌株的形態(tài)特征對(duì)16株產(chǎn)蛋白酶菌株的形態(tài)學(xué)進(jìn)行分析,從表1可以看出16株嗜鹽菌可分為3種類型,即發(fā)酵開(kāi)始時(shí)分離的4株革蘭氏陰性弧菌CW0-1、CW0-2、CW0-3和CW0-4,發(fā)酵1、2、5個(gè)月分離的7株革蘭氏陽(yáng)性球菌CW1-1、CW2-1、CW2-2、CW2-3、CW5-1、CW5-2和CW5-3,發(fā)酵3、4個(gè)月分離的5株革蘭氏陽(yáng)性桿菌CW3-1、CW3-2、CW4-1、CW4-2和CW4-3。從菌落形態(tài)上看,革蘭氏陰性弧菌呈扁平,表面光滑,光澤,透明,不產(chǎn)生色素;發(fā)酵前期的革蘭氏陽(yáng)性球菌菌落呈圓形,隆起,表面光滑濕潤(rùn),不透明,多呈白色,少量的CW1-1及CW2-1菌株產(chǎn)生黃色和橙黃色色素;革蘭氏陽(yáng)性桿菌的菌落呈圓形,稍隆起,表面光滑有光澤,菌落的透明度、顏色都有所差異。

通過(guò)對(duì)1、2、3、4個(gè)月的4株嗜鹽菌進(jìn)行革蘭氏染色,結(jié)果從圖2中可以看出,發(fā)酵1個(gè)月的菌株CW1-1和2個(gè)月的菌株CW2-1的顯微形態(tài)均為球形,前者呈單或雙排列,后者呈葡萄狀排列,CW1-1明顯大于CW2-1;發(fā)酵3個(gè)月的菌株CW3-1和發(fā)酵4個(gè)月的菌株CW4-3皆呈桿狀,多以成對(duì)出現(xiàn),CW4-3的個(gè)體明顯大于CW3-1。

表2　蝦醬中產(chǎn)蛋白酶嗜鹽菌的生理生化鑒定結(jié)果

圖2　產(chǎn)蛋白酶嗜鹽菌菌株的顯微形態(tài)(1000×)Fig.2　The micro-morphology of protease-producing halophilic bacteria strain in shrimp paste(1000×)注:A為菌株CW1-1;B為菌株CW2-1;C為菌株CW3-1;D為菌株CW4-3。

注:“-”表示陰性,“+” 表示陽(yáng)性。

2.2.2產(chǎn)蛋白酶菌株的生理生化鑒定依據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》對(duì)發(fā)酵0至5個(gè)月的16株嗜鹽菌進(jìn)行生理生化鑒定,結(jié)果如表2所示。由表2可知,初始蝦醬樣品中分離得到的4株革蘭氏陰性弧菌CW0-1、CW0-2、CW0-3和CW0-4可以分解葡萄糖、果糖、蔗糖和半乳糖等糖類產(chǎn)酸,過(guò)氧化氫酶和產(chǎn)H2S實(shí)驗(yàn)均為陰性,初步判斷這4株菌為弧菌屬。7株革蘭氏陽(yáng)性球菌CW1-1、CW2-1、CW2-2、CW2-3、CW5-1、CW5-2和CW5-3能分解葡萄糖、果糖、蔗糖等糖類產(chǎn)酸,過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)均為陽(yáng)性,產(chǎn)H2S實(shí)驗(yàn)均為陰性,初步判斷這7株菌為葡萄球菌屬。5株革蘭氏陽(yáng)性桿菌CW3-1、CW3-2、CW4-1、CW4-2和CW4-3均不能發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)酸,過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性,產(chǎn)H2S實(shí)驗(yàn)均為陰性,初步判斷這5株菌為芽孢桿菌屬。

2.2.3產(chǎn)蛋白酶菌株的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果將產(chǎn)蛋白酶菌株的DNA提取后,經(jīng)PCR擴(kuò)增后的16S rRNA電泳圖如圖3所示,從圖中可以看到16株在1500 bp處出現(xiàn)特異性亮帶,表明目標(biāo)片段被成功擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序,將菌株測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行BLAST比對(duì),采用MEGA5.0軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖3　蝦醬中產(chǎn)蛋白酶嗜鹽菌的PCR瓊脂糖電泳圖Fig.3　Agarose gel electrophoresis of PCR of protease-producing halophilic bacteria in shrimp paste注:1:菌株CW0-1;2:菌株CW0-2;3:菌株CW0-3;4:菌株CW0-4;5:菌株CW1-1;6:菌株CW2-1;7:菌株CW2-2;8:菌株CW2-3;9:菌株CW3-1;10:菌株CW3-2;11:菌株CW4-1;12:菌株CW4-2;13:菌株CW4-3;14:菌株CW5-1;15:菌株CW5-2;16:菌株CW5-3;M:maker。

圖4是產(chǎn)蛋白酶嗜鹽菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),由圖可知,在初始蝦醬樣品中分離得到的4株產(chǎn)蛋白酶菌CW0-1、CW0-2、CW0-3和CW0-4,可初步判斷屬于弧菌屬,弧菌廣泛分布于水產(chǎn)品,是原料生存環(huán)境中存在的或原料自身攜帶的一類產(chǎn)蛋白酶菌。在1～5個(gè)月的發(fā)酵過(guò)程中,嗜鹽性葡萄球菌和枝芽孢桿菌是產(chǎn)蛋白酶的優(yōu)勢(shì)菌,嗜鹽性葡萄球菌包括菌株CW1-1、CW2-1、CW2-2、CW2-3、CW5-1、CW5-2、CW5-3,菌株CW1-1、CW2-1 和CW2-2與尼泊爾葡萄球菌(Staphylococcus nepalensis)F4同源性較近,可初步判定這4株菌是尼泊爾葡萄球菌,菌株CW2-3、CW5-1、CW5-2、CW5-3與馬胃葡萄球菌(Staphylococcus equorum)Y15同源性較近,可初步判定菌株這4株菌是馬胃葡萄球菌。枝芽孢桿菌包括菌株CW3-1、CW3-2、CW4-1、CW4-2和CW4-3,菌株CW3-1、CW3-2、CW4-1、CW4-2與枝芽孢桿菌(Virgibacillus sp.)SK37和KK-B1同源性較近,可初步判定這4株為枝芽孢桿菌,菌株CW4-3與獨(dú)島枝芽孢桿菌(Virgibacillus dokdonensis)JAN-2同源性較近,可初步判定其為獨(dú)島枝芽孢桿菌。

圖4　蝦醬中產(chǎn)蛋白酶嗜鹽菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4　Phylogenetic tree of protease-producing halophilic bacteria in shrimp paste

2.3蝦醬總可溶性蛋白的變化

蝦醬發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)主要通過(guò)體系內(nèi)微生物和酶的相互作用,使其降解為肽類、氨基酸和氨基態(tài)氮等小分子風(fēng)味前體物質(zhì)[11]。Udomsil等研究泰國(guó)魚(yú)醬中4株嗜鹽四聯(lián)球菌M11、MS33、MRC5-5-2和MRC10-7-8在高鹽濃度下對(duì)魚(yú)肉蛋白的分解活性,研究表明4株四聯(lián)球菌使蛋白分解形成風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)寡肽和低聚肽[12]。

圖5是蝦醬發(fā)酵前期的總可溶性蛋白的變化,由圖可知,蝦醬中總可溶性蛋白的條帶主要分布在29.0～97.2 ku區(qū)間。前1個(gè)月,66.4～97.2 ku區(qū)間的大分子的蛋白質(zhì)光密度較強(qiáng),含量較高,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)其光密度逐漸減弱,到3個(gè)月時(shí)基本分解完全,表明大分子蛋白質(zhì)可能是被芽孢桿菌和葡萄球菌產(chǎn)生的蛋白酶分解,使得含量逐漸降低[13]。前3個(gè)月,略小于66.4 ku的蛋白質(zhì)分子的光密度有微量增加,可能是由于大分子蛋白質(zhì)被降解轉(zhuǎn)化成較小的蛋白質(zhì)分子,3個(gè)月后,其光密度減弱,說(shuō)明蛋白質(zhì)在優(yōu)勢(shì)微生物枝芽孢桿菌和葡萄球菌的作用下逐漸被分解。前3個(gè)月,29.0 ku的蛋白質(zhì)分子的含量逐漸上升,上升是由于大分子蛋白的降解形成小分子蛋白質(zhì),3個(gè)月后,29.0 ku的蛋白質(zhì)分子的含量逐漸下降,下降是在活性較強(qiáng)的產(chǎn)蛋白酶的嗜鹽性枝芽孢桿菌和葡萄球菌分解成更小的多肽和氨基酸[14]。總體來(lái)看,蝦醬中的總可溶性蛋白隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸被微生物降解,表明產(chǎn)蛋白酶的嗜鹽性葡萄球菌和枝芽孢桿菌是導(dǎo)致產(chǎn)品中蛋白降解的主體微生物類群。

圖5　蝦醬發(fā)酵前期總可溶性蛋白的變化Fig.5　Change of total soluble protein extracted from shrimp paste in the fermentation prophase注:發(fā)酵時(shí)間0:0個(gè)月;1:1個(gè)月;2:2個(gè)月; 3:3個(gè)月;4:4個(gè)月;5:5個(gè)月;M:maker。

3　結(jié)論

應(yīng)用1.0%脫脂乳Gibbons培養(yǎng)基從的傳統(tǒng)錦州蝦醬發(fā)酵前期樣品中共分離獲得16株產(chǎn)蛋白酶嗜鹽菌,菌株CW0-1、CW0-2、CW0-3和CW0-4是弧菌屬;菌株CW1-1、CW2-1和CW2-2是尼泊爾葡萄球菌;菌株CW2-3、CW5-1、CW5-2、CW5-3是馬胃葡萄球菌;菌株CW4-3是獨(dú)島枝芽孢桿菌;菌株CW3-1、CW3-2、CW4-1、CW4-2是枝芽孢桿菌?；【鷮僦饕嬖谟谠衔r中,嗜鹽性葡萄球菌出現(xiàn)在發(fā)酵2個(gè)月和5個(gè)月蝦醬,枝芽孢桿菌出現(xiàn)在發(fā)酵3～4個(gè)月。葡萄球菌和枝芽孢桿菌呈現(xiàn)交替演變,是蝦醬發(fā)酵前期的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)蛋白酶嗜鹽菌。蝦醬中的總可溶性蛋白隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降解,表明產(chǎn)蛋白酶嗜鹽性葡萄球菌和枝芽孢桿菌是導(dǎo)致產(chǎn)品中蛋白降解的主體微生物類群。通過(guò)蝦醬中產(chǎn)蛋白酶嗜鹽菌菌株的分離鑒定及其對(duì)產(chǎn)品蛋白分解過(guò)程的分析,對(duì)探究產(chǎn)品品質(zhì)形成具有潛在的研究?jī)r(jià)值。

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Isolation and identification of protease-producing halophilic bacteria in traditional Jinzhou shrimp paste

LV Xin-ran,LI Ying,MA Huan-huan,MIAO Lu-huan,DU Jing-fang, BAI Feng-ling*,JI Guang-ren,LI Jian-rong

(1.Research Institute of Food Science,Bohai University;Food Safety Key Lab of Liaoning Province; National & Local Joint Engineering Research Center of Storage,Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products,Jinzhou,121013,China; 2.Bijia mountain food co.,Ltd,Jinzhou,121007,China)

Objective:To isolate and identify protease-producing halophilic bacteria from the fermentation prophase of traditional Jinzhou shrimp paste.Methods:Protease-producing halophilic bacteria were isolated by 1.0% skimmed milk Gibbons test.These strains were identified by morphology,biochemical characteristics and molecular biology.Total soluble protein was analyzed using SDS-PAGE test.Results:16 strains protease-producing halophilic bacteria were obtained.Strain CW0-1,CW0-2,CW0-3 and CW0-4 were identified as Vibro sp.,strain CW1-1,CW2-1 and CW2-2 were identified as Staphylococcus nepalensis,strain CW2-3,CW5-1,CW5-2 and CW5-3 were identified as Staphylococcus equorum,strain CW3-1,CW3-2,CW4-1 and CW4-2 were identified as Virgibacillus sp.,strain CW4-3 was identified as Virgibacillus dokdonensis.The Vibro sp.mainly existed in raw shrimp,halophilic Staphylococcus sp.were observed in fermentation second month and fifth month,Virgibacillus sp.were observed in fermentation third month to fourth month.Staphylococcus sp.and Virgibacillus sp.presented alternate successions,which were the dominant protease-producing halophilic bacteria in the fermentation prophase of shrimp paste.Total soluble protein was gradually decreased with the extension of fermentation time.Conclusion:Staphylococcus sp.and Virgibacillus sp.were the dominant protease-producing halophilic bacteria in the fermentation prophase of shrimp paste,and were considered as the dominant bacteria of degradation protein.

traditional Jinzhou shrimp paste;protease-producing halophilic bacteria;fermentation prophase;isolation and identification

2015-08-07

呂欣然(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：食品質(zhì)量與安全控制，E-mail:lvxinran1990@163.com。

白鳳翎(1964-)男，博士，教授，研究方向：食品質(zhì)量與安全控制和食品微生物學(xué),E-mail:baifling@163.com。

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題(2012BAD29B06)；遼寧省高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)課題(LT2014024)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)07-0121-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.016