高效液相色譜法分析川西北地區(qū)牦牛酸乳的總酸構(gòu)成與B族維生素

李明月,趙　欣,騫　宇,李　鍵,陳煉紅,陳　娟,索化夷,*

(1.西南大學食品科學學院,重慶 400715;2.西南大學 重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心,重慶 400715;3.重慶第二師范學院生物與化學工程系,重慶 400067;4.西南民族大學青藏高原研究院,四川成都 610041;5.西南民族大學生命科學與技術(shù)學院,四川成都 610041)

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高效液相色譜法分析川西北地區(qū)牦牛酸乳的總酸構(gòu)成與B族維生素

李明月1,2,趙欣3,騫宇3,李鍵4,5,陳煉紅4,5,陳娟5,索化夷1,2,*

(1.西南大學食品科學學院,重慶 400715;2.西南大學 重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心,重慶 400715;3.重慶第二師范學院生物與化學工程系,重慶 400067;4.西南民族大學青藏高原研究院,四川成都 610041;5.西南民族大學生命科學與技術(shù)學院,四川成都 610041)

采用高效液相色譜法對采自川西北地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中的總酸構(gòu)成(乳酸、乙酸、檸檬酸)和B族維生素(VB1、VB2、VB6)進行測定。結(jié)果表明,與普通酸乳相比,牦牛酸乳具有較高的乳酸含量(19.86±8.64)mg/g,并且B族維生素含量高,尤其是VB1(53.35±16.32)μg/100 g和VB6(483.00±293.64)μg/100 g豐富。通過測定牦牛酸乳中有機酸及B族維生素含量,為牦牛酸乳營養(yǎng)價值的評定和理化指標的制定提供理論參考。

高效液相色譜法,川西北地區(qū)牦牛酸乳,總酸構(gòu)成,B族維生素

川西北高原地勢高平,氣候奇寒,光能資源豐富。分布在海拔3000 m以上的牦?？梢岳酶吆０蔚貐^(qū)的草地資源,為牧民提供乳、肉、毛皮等畜產(chǎn)品,并且耐寒、耐低溫、耐缺氧,享有“高原之舟”的美譽[1-2]。牦牛乳產(chǎn)量雖低,但乳汁濃稠,營養(yǎng)價值高,具有“天然濃縮乳”之稱[3]。牦牛酸乳由牦牛乳發(fā)酵而得,常用傳統(tǒng)木桶攪打方法使牛乳組成成分變均勻,然后密封至于25 ℃左右環(huán)境中隔夜發(fā)酵[4]。發(fā)酵而得的牦牛酸乳組織細膩,風味獨特,口味純正,略帶醇香味,并且在當?shù)丨h(huán)境中能較好的保持其風味和組織狀態(tài)[5]。牦牛酸乳能降低人體膽固醇、強化肌肉組織、減少脂肪堆積等[6],與普通酸乳相比,具有較高的酸度,能抑制腸道內(nèi)其他有害微生物的繁殖,有預防腸炎、瀉痢的功能[7]。

傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳作為藏族牧民傳統(tǒng)美食,不但傳承著牧民的傳統(tǒng)文化,并具有作為旅游食品開發(fā)的價值,越來越受到消費者的喜愛與關(guān)注。但市面上牦牛酸乳品質(zhì)混雜,制作標準缺失,難以保證傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳的品質(zhì),并且對于牦牛酸乳理化性質(zhì)的研究較少,其品質(zhì)特征也不夠清晰。有機酸是衡量發(fā)酵乳發(fā)酵程度的重要指標,并且會影響發(fā)酵乳的風味,牦牛乳發(fā)酵為牦牛酸乳后B族維生素含量增加[8],有良好的醫(yī)療保健功能,但對其含量的測定研究較少。高效液相色譜法靈敏度高,操作簡便,使用該方法對采自川西北地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中乳酸、乙酸、檸檬酸、VB1、VB2、VB6進行測定,并進行品質(zhì)分析,為牦牛酸乳的品質(zhì)標準制定提供參考,促進牦牛酸乳的進一步開發(fā)利用。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

牦牛酸乳隨機采取四川紅原縣安曲,若爾蓋縣,甘肅夏河三個牧區(qū)的牧民家庭自然發(fā)酵的牦牛酸乳于10 mL無菌采樣瓶中。紅原縣安曲4份樣品,樣品編號為A1,A2,A3,A4;若爾蓋縣5份樣品,樣品編號為R1,R2,R3,R4,R5;甘肅夏河3份樣品,樣品編號為XH1,XH2,XH3。共12份牦牛酸乳樣品,低溫采樣箱保藏,及時拿回實驗室,4 ℃保存;a,b,c 3種常見市售發(fā)酵乳,4 ℃保存。

α-淀粉酶和木瓜蛋白酶(生物試劑)北京奧博星生物技術(shù)有限公司;辛烷基磺酸鈉(離子對色譜試劑)成都市科龍化工試劑廠;甲醇(色譜純)河北四友卓越科技有限公司;乳酸、乙酸及檸檬酸(分析純)成都市科龍化工試劑廠;磷酸二氫銨(分析純)成都市科龍化工試劑廠;其他化學試劑均為分析純。

DY-09 PHS-3C酸度計成都世紀方舟科技有限公司;FA2104電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;SYQ-DSX-280A手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠;LC-20A高效液相色譜儀日本島津公司;Agilent XDB-C18高效液相色譜柱安捷倫科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1牦牛酸乳中VB1含量的測定參照GB 5413.11-2010規(guī)定的方法進行測定[9]。

1.2.2牦牛酸乳中VB2含量的測定參照GB 5413.12-2010規(guī)定的方法進行測定[10]。

1.2.3牦牛酸乳中VB6含量的測定參照GB 5413.13-2010規(guī)定的方法進行測定[11]。試樣預處理:稱取牦牛酸乳試樣約5.0000 g(精確至0.0001 g),加入約25 mL 45～50 ℃的水,混勻并充分溶解,靜置5～10 min,冷卻至室溫。待測液的制備:用鹽酸溶液調(diào)節(jié)試樣溶液的pH至1.7±0.1,放置約1 min。再用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)試樣溶液的pH至4.5±0.1。將試樣溶液全部轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,用水稀釋至刻度,用超聲波振蕩器震蕩約10 min。將震蕩后的試樣自然過濾后,再用0.45 μm微孔濾膜加壓過濾,收集即為試樣待測液。色譜條件:色譜柱:C18柱(粒徑5 μm,150 mm×4.6 mm);流動相:甲醇50 mL,辛烷磺酸鈉2.0 g,三乙胺2.5 mL,用水溶解并定容至1000 mL后,用冰乙酸調(diào)pH至3.0±0.1,再經(jīng)0.45 μm微孔濾膜加壓過濾;流速:1.5 mL/min;檢測波長:激發(fā)波長293 nm,發(fā)射波長395 nm;進樣量:標準品20 μL,樣品20 μL。標準曲線的繪制:將維生素B6混合系列標準液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL)依次進行色譜測定。記錄各組分的色譜峰面積,以峰面積為橫坐標,以標準測定液的濃度為縱坐標,繪制標準曲線。試樣測定:將試樣待測液進行色譜測定。記錄各組分色譜峰面積,根據(jù)標準曲線計算出試樣待測液中維生素B6各組分的濃度Ci。分析與計算:

X=X醇+X醛×1.012+X胺×1.006

式中:X為試樣中維生素B6含量,μg/100 g;X醇為試樣中吡哆醇含量,μg/100 g;X醛為試樣中吡哆醛含量,μg/100 g;X胺為試樣中吡哆胺含量,μg/100 g;1.012為吡哆醛的含量換算成吡哆醇的系數(shù);1.006為吡哆胺的含量換算成吡哆醇的系數(shù)。

1.2.4乳酸、乙酸、檸檬酸的測定參照SN/T 2007-2007規(guī)定的高效液相色譜法[12]。試樣溶液制備:稱取牦牛酸乳試樣約5.0000 g(精確到0.0001 g)于50 mL容量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻,過0.45 μm濾膜后作為樣液,供HPLC測定。色譜條件:色譜柱:Agilent XDB-C18柱;流動相:0.1 mol/L磷酸二氫銨溶液,用磷酸調(diào)節(jié)pH2.4,過0.45 μm濾膜,甲醇;流速:甲醇0.03 mL/min,磷酸二氫銨溶液0.57 mL/min;柱溫:35 ℃;檢測波長:220 nm;進樣量:20 μL。標準曲線的繪制:以0.5、1.0、2.0、5.0、10 mg/mL為濃度梯度分別制作出乳酸、乙酸、檸檬酸的標準曲線。記錄各組分的色譜峰面積,以峰面積為橫坐標,以標準測定液的濃度為縱坐標,繪制標準曲線。試樣測定:將試樣待測液進行色譜測定。記錄各組分色譜峰面積,根據(jù)標準曲線計算出試樣待測液中乳酸、乙酸、檸檬酸的濃度。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2　結(jié)果與分析

2.1有機酸及B族維生素色譜圖

在選定色譜條件下,乳酸、乙酸、檸檬酸的保留時間分別約為6.150、6.518、7.470 min。標準品的色譜圖參見圖1,樣品色譜圖以A3為代表參見圖2。

圖1　5.0 mg/mL乳酸、乙酸、檸檬酸標準溶液的液相色譜圖Fig.1　Chromatogram of 5.0 mg/mL lactic acid, acetic acid,citric acid standard liquid

圖2　樣品A3中乳酸,乙酸,檸檬酸液相色譜圖Fig.2　Chromatogram lactic acid,acetic acid, citric acid liquid chromatogram in sample A3

由圖1,圖2可知,在所建立的色譜條件下,乳酸、乙酸、檸檬酸能達到較好的分離,且峰形對稱、完整、無拖尾現(xiàn)象。

在所述色譜條件下,VB1,VB2,VB6標準液的色譜圖及樣品色譜圖如圖所示。

由圖3～圖8可知,在所建立的色譜條件下,B族維生素可以得到較好的分離,峰形對稱,通過色譜圖可以對其進行定性以及定量分析。

圖3　5 mg/mL維生素B1標準溶液的液相色譜圖Fig.3　Standard liquid chromatogram of 5 mg/mL VB1

圖4　樣品XH2中維生素B1的液相色譜圖Fig.4　Liquid chromatogram of VB1 in sample XH2

圖5　0.05 μg/mL維生素B2標準溶液的液相色譜圖Fig 5　Standard liquid chromatogram of 0.05 μg/mL VB2

圖6　樣品A1中維生素B2的液相色譜圖Fig.6　Liquid chromatogram of VB2 in sample A1

圖7　1.0 μg/mL維生素B6標準溶液的液相色譜圖Fig.7　Standard liquid chromatogram of 1.0 μg/mL VB6

圖8　樣品A3中維生素B6的液相色譜圖Fig.8　Liquid chromatogram of VB6in sample A3

2.2標準工作曲線

以0.5、1.0、2.0、5.0、10 mg/mL的酸濃度梯度為縱坐標,以色譜峰面積為橫坐標,分別制作乳酸、乙酸、檸檬酸的標準曲線?；貧w方程和相關(guān)系數(shù)如表1所示。

以標準測定液的濃度為縱坐標,峰面積為橫坐標,分別制作VB1、VB2、吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺的標準曲線?；貧w方程和相關(guān)系數(shù)如表2所示。

由表1、表2所知,在所建立的色譜條件及進樣量范圍內(nèi),各有機酸和B族維生素的線性方程的線性相關(guān)系數(shù)為0.9982～0.9999,表明線性關(guān)系良好。

表1　乳酸、乙酸、檸檬酸標準曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 1　The standard regression equation and correlation coefficient of lactic acid,acetic acid,citric acid

注:公式X為面積;Y為質(zhì)量濃度(mg/mL),表2同。

表2　B族維生素標準曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 2　The standard regression equation and correlation coefficient of B vitamins

2.3乳酸、乙酸、檸檬酸的測定

牦牛酸乳中乳酸、乙酸、檸檬酸的含量如表3所示。

表3　牦牛酸乳中乳酸、乙酸、檸檬酸的含量Table 3　The content of Lactic acid, acetic acid,citric acid in yak yogurt

注:同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母、不同大寫字母表示差異極顯著(p<0.01);相同小寫字母表示差異顯著(p<0.05);含有相同大寫字母表示無顯著性差異;大寫字母與小寫字母之間無比較,表4同。

由表3知,牦牛酸乳中乳酸的平均含量為19.86 mg/g,顯著高于西藏發(fā)酵黃牛乳(0.37 mg/g)和發(fā)酵牦牛乳(0.81 mg/g)以及陳永福測定的青海省傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中的乳酸含量(0.01 mg/g),高于張和平等測定的青海部分地區(qū)發(fā)酵牦牛乳中的平均乳酸含量(11.10 mg/g)[13-15]。與泌乳期、自然環(huán)境、牧民制作牦牛酸乳所采用的發(fā)酵溫度、發(fā)酵容器以及發(fā)酵微生物等因素有關(guān)[16]。由于受到微生物種類,數(shù)量以及相互適應、協(xié)調(diào)能力等因素的影響,牦牛酸乳中乳酸平均含量顯著高于普通酸乳(12.50 mg/g)。乳酸是乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的主要有機酸,與滴定酸度呈正相關(guān),它可以促進蛋白質(zhì)的消化和腸胃的蠕動,提高營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等致病菌的生長[17],提高產(chǎn)品的食用安全性、賦予產(chǎn)品酸味和清爽的口感,是天然的防腐劑[18]。對牦牛酸乳中乳酸含量的研究可為川西北地區(qū)牦牛酸乳特征理化指標的制定提供參考。同一地區(qū)部分牦牛酸乳樣品中乙酸和檸檬酸含量未被檢出,與不同牧民家庭發(fā)酵牦牛酸乳所用原料乳,發(fā)酵強度以及發(fā)酵微生物的種類和數(shù)量等因素有關(guān),同時乙酸是揮發(fā)性物質(zhì),其含量與牧民在發(fā)酵過程中的密封性有關(guān),密封不當會導致含量降低。[15]。雖然牦牛酸乳中乙酸和檸檬酸的含量低,但對牦牛酸乳的滋味和香氣起到了重要的作用。部分乳酸球菌和明串珠菌能代謝檸檬酸產(chǎn)生雙乙酰等風味物質(zhì)[19]。由于不同地區(qū)牦牛乳原料不同以及發(fā)酵時間和發(fā)酵微生物數(shù)量、區(qū)系的多樣性導致牦牛酸乳樣本間乳酸、乙酸、檸檬酸的含量存在差異。

2.4VB1、VB2、VB6的含量測定

牦牛酸乳中VB1、VB2、VB6含量如表4所示。

表4　牦牛酸乳中的VB1、VB2、VB6含量Table 4　The content of VB1,VB2,VB6 in yak yogurt

由表4知,牦牛酸乳中VB1(53.35 μg/100 g)和VB6(483.00 μg/100 g)的平均含量顯著高于市售普通酸乳(p<0.01);VB2的平均含量與市售酸乳中VB2平均含量差異較顯著(p<0.05)。由于受到原料乳、氣候條件、海拔,放牧季節(jié)、泌乳期、制作條件與發(fā)酵菌種等因素的影響[13,20]以及 B族維生素容易受到破壞,尤其是VB2見光易分解,在發(fā)酵、加工及含量測定過程中會造成B族維生素的損失,從而導致牦牛酸乳樣本間B族維生素含量存在差異。牦牛酸乳中,VB1、VB2的含量高于艾日登才次克[14]測定的西藏部分地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳中VB1(19.60 μg/100 g)、VB2(154.60 μg/100 g)的含量;VB6含量高于青海部分地區(qū)牦牛酸乳中VB6(27.76 μg/100 g)的含量以及青海部分地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸羊奶中VB6(63.80 μg/100 g)的含量[16,21];B族維生素含量可以作為川西北地區(qū)牦牛酸乳的特征理化指標之一。

傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳為典型的Ⅳ型發(fā)酵乳,微生物菌群復雜,Zhang Heping[13]等研究表明相對于其他發(fā)酵酸奶,牦牛酸乳中除了含有豐富的乳酸菌,還有豐富的酵母菌,酵母菌在增生過程中可以產(chǎn)生大量的B族維生素[22]。同時,酵母菌中B族維生素含量相當豐富,并且容易被人體吸收,每克酵母菌中VB1、VB2、VB6分別相當于成人日需要量的10.75%、2.6%和1.36%[23]。乳酸菌在代謝過程中雖會消耗部分維生素但同時也會合成一些B族維生素,例如乳酸乳球菌和雙歧桿菌等[24-25],并且乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的有機酸會增加腸道內(nèi)VB1和VB6的穩(wěn)定性[8],產(chǎn)生的乳酸會促進B族維生素的合成。藏族牧民制作并食用牦牛酸乳的傳統(tǒng)習慣解決了高原地區(qū)由于缺少生鮮果蔬帶來的B族維生素缺乏問題[13],減少牧民出現(xiàn)食欲不振、消化不良、空腔炎、皮炎等B族維生素缺乏癥。

3　結(jié)論

采用高效液相色譜法測定牦牛酸乳中的B族維生素和有機酸含量,相對標準偏差偏小,線性相關(guān)系數(shù)高,具有重現(xiàn)性好和回收率高的特點,能夠快速簡便的測定出牦牛酸乳中B族維生素和有機酸的含量,具有較高的準確度和精密度,能夠滿足實驗的要求。

通過測定川西北地區(qū)牦牛酸乳中B族維生素和有機酸的含量,發(fā)現(xiàn)牦牛酸乳中VB1、VB2、VB6、乳酸、乙酸、檸檬酸的平均含量為53.35±16.32、169.72±62.48、483.00±293.64 μg/100 g、19.86±8.64、0.97±1.40、1.55±1.04 mg/g,普遍高于普通的市售酸乳和其他部分地區(qū)牦牛酸乳中B族維生素和乳酸含量,可以作為川西北地區(qū)牦牛酸乳的特征理化指標。

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Analysis of total acid composition and B vitamins in northwestern Sichuan yak yogurt by HPLC

LI Ming-yue1,2,ZHAO Xin3,QIAN Yu3,LI Jian4,5,CHEN Lian-hong4,5,CHEN Juan5,SUO Hua-yi1,2,*

(1.College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China;2.Chongqing Engineering Research Center of Regional Food,Chongqing 400715,China;3.Department of Biological and Chemical Engineering,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China;4.Institute of Qinghai-Tibetan Plateau,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China;5.College of Life Science and Technology,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China)

To analyze total acid composition and B vitamins in yak yogurt from northwestern Sichuan,the HPLC was used to investigate the content of the lactic acid,acetic acid,citric acid and VB1,VB2,VB6.The results showed that yak yogurt had high lactic acid with the content of(19.86±8.64)mg/g and B vitamins compared with ordinary yogurt,particularly VB1of(53.35±16.32)μg/100 g and VB6of(483.00±293.64)μg/100 g.Organic acids and vitamins B were determinated to provide theoretical reference for nutritional value assessment and chemical indicators of yak yogurt.

HPLC;yak yogurt in northwestern Sichuan;total acid composition;B vitamins

2015-11-05

李明月(1991-)，女，碩士研究生，研究方向:發(fā)酵微生物，E-mail：13436117157@163.com。

索化夷(1978-)，男，博士，副教授，研究方向:發(fā)酵微生物，E-mail：birget@swu.edu.cn。

國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303085)；重慶市社會民生科技創(chuàng)新專項 (cstc2015shmszx80021)；重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心能力提升項目(cstc2014pt-gc8001)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)09-0344-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.059