超聲波輔助提取中國木莖皮多糖的工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

靳　潔,王一峰

(西北師范大學生命科學學院,甘肅蘭州 730070)

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靳潔,王一峰*

(西北師范大學生命科學學院,甘肅蘭州 730070)

以中國楤木(AraliachinensisL.)莖皮為原料,研究了超聲波輔助提取中國楤木莖皮多糖的最優(yōu)工藝條件及體外抗氧化活性。根據(jù)Box-Behnken設計原理,在單因素實驗基礎上,選取液料比、提取溫度、超聲功率和提取時間四個因素進行四因素三水平的響應面實驗,結果表明超聲波輔助提取多糖的最優(yōu)條件為:液料比33 mL/g、提取溫度71 ℃、超聲功率124 W、提取時間93 min,該條件下多糖提取率預測值為12.897%,驗證值為12.871%±0.11%。體外抗氧化活性研究結果顯示:在實驗范圍內(nèi),隨著濃度的升高,中國楤木莖皮多糖對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子的清除能力逐漸增強,還原能力也逐漸增強。表明該響應面實驗產(chǎn)生的回歸模型用于優(yōu)化中國楤木莖皮多糖的超聲波提取工藝是可行的;中國楤木莖皮多糖具有一定的體外抗氧化能力,可以考慮將其開發(fā)成為一種天然抗氧化劑在醫(yī)學或功能食品領域中使用。

中國楤木莖皮多糖,超聲波輔助提取,響應面法,抗氧化活性

活性氧是細胞代謝過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品,過多的活性氧自由基可以引起許多疾病,如氧化應激、老化、慢性腎衰竭、肺炎、尿毒癥、風濕性關節(jié)炎等[1]。為了減少活性氧對人體的傷害,抗氧化劑被普遍使用。目前主要有兩類抗氧化劑,一種是人工合成的,一種是天然存在的。人工合成的抗氧化劑因具有顯著的毒性而使其治療效果受限,因此從自然資源中尋找安全有效的抗氧化劑受到越來越多的關注。近幾年的研究表明,一些從植物中分離得到的多糖具有有效的抗氧化活性,可以開發(fā)其成為新型的天然抗氧化劑[2-5]。

中國楤木(AraliachinensisL.)隸屬五加科楤木屬,又名鵲不踏、虎陽刺、海桐皮、鳥不宿、通刺、刺樹椿等,在全國大部分地區(qū)均有分布[6]。中國楤木是常用的中草藥,以根皮和莖皮入藥,具有鎮(zhèn)痛消炎、祛風行氣、祛濕活血之效[6]。研究發(fā)現(xiàn)中國楤木含有多種活性成分,包括皂苷、多糖、黃酮、齊墩果酸、揮發(fā)油等[7-9]。在之前的工作中,課題組已經(jīng)對中國楤木根皮多糖的超聲波輔助提取工藝及多糖含量進行了研究,得到其最佳工藝條件為:提取溫度70 ℃,料液比1∶30 g/mL,提取時間80 min,超聲功率100 W,此條件下多糖得率為11.13%[7]。此外,課題組還對中國楤木粗多糖的降血糖作用進行了研究,結果發(fā)現(xiàn)中國楤木粗多糖能夠顯著降低糖尿病大鼠血糖水平,有效調(diào)節(jié)糖藥病大鼠血脂代謝紊亂[8]。

傳統(tǒng)的多糖提取方法需要較高的提取溫度和較長的提取時間,并且多糖得率并不理想,超聲波輔助提取技術因其低的能量消耗、低的溶劑消耗和高的提取效率而在近年被廣泛應用[10]。在提取過程中,很多因素如提取溫度、提取時間、料液比等都會影響多糖得率,為了得到最優(yōu)提取條件,需要對提取工藝進行優(yōu)化。響應面分析法是一種有效精確的優(yōu)化方法,它的優(yōu)點主要是可以減少必要的實驗次數(shù)但不影響優(yōu)化結果[11]。截止目前,對中國楤木莖皮多糖的提取工藝以及抗氧化活性研究還未見報道。本研究以中國楤木莖皮為材料,主要研究超聲波輔助提取中國楤木莖皮多糖的最優(yōu)工藝條件及體外抗氧化活性,以期為中國楤木莖皮多糖的進一步開發(fā)利用提供一定的理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

中國楤木莖皮采自甘肅省隴南市徽縣,洗凈,在恒溫干燥箱中烘干至恒重(50 ℃),然后粉碎過40目篩備用。

無水乙醇、無水乙醚、氯仿、磷酸、甲醇、鹽酸(HCl)、三氯化鐵(FeCl3)均為分析純,上海中秦化學試劑有限公司提供;1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)、脫氧核糖、乙二胺四乙酸(EDTA)、硫酸亞鐵銨、硫代巴比妥酸(TBA)、三氯乙酸(TCA)、還原性輔酶I(NADH)、四唑氮藍(NBT)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、鐵氰化鉀、三氯化鐵(FeCl3)均為分析純,北京索萊寶科技有限公司提供。

WGL-230B型電熱鼓風干燥箱天津市泰斯特儀器有限公司;BS223S型電子天平北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;KQ-250DE型超聲波提取儀昆山超聲儀器廠;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠;Allegra 64R型高速冷凍離心機普瑞麥迪實驗室技術有限公司;LGJ-18S型冷凍干燥機北京松原華興科技發(fā)展有限公司;U-2000型分光光度計優(yōu)尼科儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1超聲波輔助提取精確稱取10.00 g 干燥的中國楤木莖皮粉末于燒杯中,按照實驗設定的條件進行超聲波輔助提取,然后過濾,濾渣按照同樣方法再次進行提取,兩次濾液合并,抽濾,離心(4000 r/min,10 min),收集上清液,在60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮,然后在濃縮液中加入4倍體積無水乙醇,4 ℃放置24 h,之后依次用無水乙醇和乙醚洗滌3次,離心(4000 r/min,10 min),收集沉淀,Sevage法脫蛋白,流水和蒸餾水各透析24 h,減壓濃縮,乙醇沉淀,離心(4000 r/min,10 min),沉淀物冷凍干燥得中國楤木莖皮多糖(ACSP)。

1.2.2多糖得率測定按照侯宏紅等人[7]的方法測定樣品提取得到的總糖質(zhì)量。多糖得率根據(jù)下列公式計算:

1.2.3單因素實驗設計選取液料比(10～50 mL/g)、提取溫度(50～90 ℃)、超聲功率(100～140 W)和提取時間(70～110 min)四個因素進行單因素實驗,考察它們對ACSP得率的影響。當以液料比為考察因素時,其他條件設置為:提取溫度70 ℃,超聲功率120 W,提取時間90 min;當以提取溫度為考察因素時,其他條件設置為:液料比30 mL/g,超聲功率120 W,提取時間90 min;當以超聲功率為考察因素時,其他條件設置為:液料比30 mL/g,提取溫度70 ℃,提取時間90 min;當以提取時間為考察因素時,其他條件設置為:液料比30 mL/g,提取溫度70 ℃;超聲功率120 W。

1.2.4響應面實驗設計在單因素實驗基礎上,選取液料比(X1)、提取溫度(X2)、超聲功率(X3)和提取時間(X4)四個因素,采用Box-Behnken設計方案進行四因素三水平的響應面實驗,實驗的因素和水平見表1。以X1、X2、X3和X4為自變量,多糖得率(Y)為響應值,實驗方案見表2,實驗結果采用Design expert 9.0 進行分析。

1.2.5抗氧化活性測定DPPH自由基清除能力測定:參照Wang等人[12]的方法,以VC為陽性對照;羥基自由清除能力測定:參照Zhao等人[13]的方法,以VC為陽性對照;超氧陰離子清除能力測定:參照Wang等人[14]的方法,以VC為陽性對照;還原力測定:參照Qi 等人[15]的方法,以VC為陽性對照。

表1　響應面分析因素及水平Table 1　Variables and levels in response surface design

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPASS 20.0進行ANOVA分析,實驗重復3次,顯著性水平為0.05。

2　結果與分析

2.1多糖得率

以葡萄糖的質(zhì)量濃度(ρn)為橫坐標,吸光度(D)為縱坐標繪制標準曲線,得到的回歸方程為D=0.0042ρn+0.151,R2=0.9914,根據(jù)該方程可以計算出樣品提取得到的總糖質(zhì)量,多糖得率根據(jù)1.2.2中公式計算。

2.2單因素實驗

許多研究結果表明不同的液料比、提取溫度、超聲功率和提取時間等對多糖得率均有顯著的影響[3,11,16]。

從圖1a中可以看出,當液料比從10 mL/g增加到30 mL/g時,多糖得率迅速增加至最大值,之后隨著液料比的增加多糖得率逐漸降低。這可能是因為增加溶劑量可以增加植物組織細胞內(nèi)外的濃度差,從而促進多糖的析出,但溶劑量過高會導致擴散距離增加,同時導致后續(xù)濃縮過程中多糖虧損增大,反而不利于多糖得率的提升[17],所以選取30 mL/g為最佳液料比。

圖1b顯示,隨著溫度的增加,多糖得率不斷增加,但當溫度超過70 ℃時,多糖得率迅速降低。溫度升高可以提高多糖的溶解度和擴散率,增加多糖得率,但過高的溫度會破壞多糖的結構,引起多糖的降解,從而降低多糖得率[10],因此70 ℃為最適提取溫度。

圖1c表明,當超聲波功率小于120 W時,多糖得率與超聲功率呈正相關,超聲波功率大于120 W時,兩者呈負相關。說明在一定范圍內(nèi)增加超聲功率可以提高多糖得率,這是因為增加功率有利于植物組織細胞壁的破裂,促進多糖的溶出,但過高的功率會導致熱量的不穩(wěn)定以及多糖的化學降解[18],因此選取120 W為最適功率。

圖1　不同因素對多糖得率的影響Fig.1　Effect of different factors on the yield of ACSP

觀察圖1d發(fā)現(xiàn),提取時間的增加有利于多糖得率的升高,但當時間超過90 min時,多糖得率開始下降,因為過長的時間可能引起多糖的降解、聚集以及水解,并且造成能量的浪費[1],所以將最適提取時間定為90 min。

2.3響應面優(yōu)化

四因素三水平的響應面實驗結果見表2,對表2數(shù)據(jù)進行分析得到二次多元回歸方程:

Y=12.48+0.88X1+0.46X2+0.96X3+0.62X4-0.05X1X2+0.25X1X3+0.12X1X4-0.27X2X3-0.43X2X4+0.29X3X4-1.62X12-1.44X22-1.57X32-1.144X2

式中Y代表多糖得率,X1代表液料比,X2代表提取溫度,X3代表超聲波功率,X4代表提取時間。

回歸模型的響應面圖見圖2。圖2顯示,各因素對ACSP得率的影響作用與單因素實驗結果基本一致,結合回歸方程可知,超聲功率對多糖得率的影響最為顯著,每組實驗在實驗范圍內(nèi)多糖得率均存在極值,即響應面的最高點[20]。

應用響應面優(yōu)化法得到的ACSP最優(yōu)提取條件為:液料比33.1 mL/g,提取溫度70.7 ℃,超聲功率123.5 W,提取時間93.2 min,此條件下ACSP的理論提取率為12.897%。為了實際操作方便,將該最優(yōu)提取條件修正為:液料比33 mL/g,提取溫度71 ℃,超聲功率124 W,提取時間93 min,在修正條件下進行驗證實驗,ACSP的實際提取率為12.871±0.11%(n=3),與理論值基本吻合。說明該回歸方程能較為真實地反應各因素對ACSP得率的影響,證明該模型用于優(yōu)化ACSP的超聲波提取工藝是可行的[21]。

表2　響應面實驗設計及多糖得率Table 2　Response surface experimental design and the results for extraction yield of ACSP

2.4抗氧化活性

2.4.1DPPH自由基清除能力DPPH自由基清除能力的測定已經(jīng)成為評價天然化合物自由基清除能力的一種有效方法。DPPH的甲醇溶液在517 nm處具有最大吸收峰,當溶液被還原時,其在517 nm處的吸光度就會降低,并且溶液顏色會發(fā)生改變。本研究中,以VC為陽性對照,ACSP對DPPH自由基清除能力的測定結果見圖3a。觀察圖3a發(fā)現(xiàn),在實驗濃度范圍內(nèi),ACSP對DPPH自由基的清除能力隨著濃度的升高而逐漸增大,具有濃度依賴性,其半抑制濃度IC50為0.887 mg/mL,說明ACSP具有一定的清除DPPH自由基的能力,但清除能力弱于VC。這與許多研究結果類似[16,22]。研究認為,一些化合物之所以能清除DPPH自由基,可能是因為這些化合物能提供一個電子使其與DPPH自由基的單電子配對,從而使DPPH自由基的吸收逐漸消失[23]。

表3　響應面實驗分析結果Table 3　Analysis of variance of response surface experiment

注:a表示差異顯著(p<0.05),b表示差異不顯著(p>0.05)。

2.4.2羥基自由基清除能力羥基自由基是體內(nèi)產(chǎn)生的一類典型的活性氧,它能穿過細胞膜與細胞內(nèi)大多數(shù)生物活性分子(如多糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA等)反應,對細胞具有很大的傷害作用,因此清除羥基自由基就顯得尤為重要[24]。ACSP和VC對羥基自由基清除能力的測定結果見圖3b,可以看出兩者對羥基自由基的清除能力均具有濃度依賴效應。當濃度從0.02 mg/mL升至0.5 mg/mL時,ACSP和VC的清除能力分別迅速增至57.6%和79.9%,之后隨著濃度的增加,兩者的清除能力均緩慢上升。實驗結果說明ACSP具有清除羥基自由基的能力,其半抑制濃度IC50為0.632 mg/mL。研究表明多糖能清除羥基自由基的機制可能是多糖中的羥基能夠貢獻一個質(zhì)子使其與羥基自由基結合,從而達到清除的目的[17]。

圖2　各因素對中國楤木莖皮多糖提取率影響的響應面圖。Fig.2　Response surface plots showing the effect of variables on the extraction yield of ACSP

圖3　不同濃度的中國楤木莖皮多糖的活性Fig.3　Activity of ACSP at different concentration注:a:DPPH自由基清除能力;b:羥基自由基清除能力;c:超氧陰離子自由基清除能力;d:還原能力。

2.4.3超氧陰離子清除能力超氧陰離子是在線粒體電子傳遞系統(tǒng)中產(chǎn)生的一種有毒物質(zhì),它被認為是單線態(tài)氧和羥基自由基的前體[25]。超氧陰離子的存在可以損害一些生物活性分子,并且啟動一些病理反應,如關節(jié)炎和阿爾茨海默氏癥[26]。圖3c顯示了ACSP對超氧陰離子的清除能力,當濃度從0.02 mg/mL升至2 mg/mL,ACSP對超氧陰離子的清除能力從5.7%升至74.5%,半抑制濃度為0.652 mg/mL,清除能力整體低于對照VC。許多研究指出從植物中提取的多糖對超氧陰離子具有很強的清除能力,認為它們可以被發(fā)展成為極具潛力的新型抗氧化劑[2,27]。

2.4.4還原能力具有還原能力的物質(zhì)(如抗氧化劑)的出現(xiàn)可以使帶有Fe3+的化合物變成亞鐵化合物,因此通過檢測反應后亞鐵化合物的吸光度就可以測定樣品的還原能力[28]。從圖3d可以看出,ACSP和VC的還原能力均隨著其濃度的升高而增加,當濃度升至3 mg/mL時,兩者的吸光度分別為1.51和2.13,表明ACSP具有一定的還原能力。研究表明還原力的產(chǎn)生通常與還原酮的出現(xiàn)有關,還原酮可以通過貢獻一個質(zhì)子來破壞自由基反應鏈,從而起到還原作用[15]。

3　結論

此次研究根據(jù)Box-Behnken設計原理,應用響應面分析法建立了影響ACSP得率的二次多項式回歸模型,優(yōu)化了超聲波輔助提取ACSP的工藝條件(液料比33 mL/g、提取溫度71 ℃、超聲功率124 W、提取時間93 min),該條件下多糖提取率預測值為12.897%,驗證值為12.871%±0.11%(n=3),無顯著差異,說明該回歸模型用于優(yōu)化ACSP的超聲波提取工藝是可行的,具有實際價值。

對ACSP的體外抗氧化活性進行了初步研究,結果表明ACSP具有一定的體外抗氧化能力,可以考慮將其開發(fā)成為一種天然抗氧化劑在醫(yī)學或功能食品領域中使用,這為中國楤木多糖的進一步開發(fā)利用提供了理論和實驗依據(jù)。

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Optimization of ultrasonic-assisted extraction of polysaccharides fromAraliachinensisL.stem-bark and its antioxidant activities evaluation

JIN Jie,WANG Yi-feng*

(College of Life Science,Northwest Normal University,Lanzhou 730070,China)

UsingAraliachinensisL.stem-bark as materials,optimal process conditions of ultrasonic-assisted extraction ofAraliachinensisL.stem-bark polysaccharides(ACSP)and its antioxidant activities were studied.According to the Box-Behnken design principle,based on the single factor experiment,four-factor(ratio of water to material,extraction temperature,ultrasonic power and extraction time)three-level response surface methodology(RSM)was conducted.The optimal extraction conditions of ACSP were determined as follows:ratio of water to material was 33 mL/g,extraction temperature was 71 ℃,ultrasonic power was 124 W,extraction time was 93 min.Under optimal conditions,predicted value of polysaccharides yield was 12.897%,verified value was 12.871±0.11%.The results of antioxidant activities of ACSPinvitroshowed that the scavenging activity of DPPH,hydroxyl radical,superoxide radical and reducing power increased with the increase of polysaccharides concentration in the experimental range.Conclusion:the regression model generated from RSM was feasible to optimize the ultrasonic-assisted extraction process of ACSP.ACSP has good antioxidant activity,which may be explored as a natural antioxidant in medicine or functional foods areas.

AraliachinensisL stem-bark polysaccharides(ACSP);ultrasonic-assisted extraction;response surface methodology(RSM);antioxidant activities

2015-09-24

靳潔(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：植物資源的開發(fā)及利用，E-mail：jinjie920119@aliyun.com。

王一峰(1964-)，男，博士，教授，研究方向：植物資源的利用與開發(fā)，E-mail:wangyifeng6481@aliyun.com。

國家自然科學基金項目(31460105)；蘭州市科技局項目(2013-4-89)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)09-0218-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.034