野葛藤地上部分葛根素的提取及穩(wěn)定性研究

李　玲,全沁果,沈艷欣,何福林,邵金華,閆旭宇,*

(1.湖南科技學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院,湘南優(yōu)勢(shì)植物資源綜合利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南永州 425199;2.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,浙江杭州 310058;3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

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野葛藤地上部分葛根素的提取及穩(wěn)定性研究

李玲1,2,全沁果3,沈艷欣1,何福林1,邵金華1,閆旭宇1,*

(1.湖南科技學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院,湘南優(yōu)勢(shì)植物資源綜合利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南永州 425199;2.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,浙江杭州 310058;3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

以野葛藤地上部分為研究對(duì)象,采用乙醇回流法提取其葛根素,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上選取影響得率的主要因素:提取溫度、提取時(shí)間、料液比,通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì),對(duì)野葛藤中的葛根素提取條件進(jìn)行優(yōu)化,并研究氧化還原劑和金屬離子對(duì)野葛藤中的葛根素穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明,野葛藤中的葛根素最佳提取工藝條件為:提取溫度為79 ℃,提取時(shí)間為87 min,料液比為1∶14 g/mL;葛根素得率為2.2515%。葛根素的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:氧化劑H2O2不影響葛根素穩(wěn)定性,而還原劑Na2SO3導(dǎo)致葛根素吸光度值變化;在金屬離子中,Na+、K+兩種離子不影響葛根素的穩(wěn)定性,而Cu2+會(huì)改變葛根素吸光度值,對(duì)葛根素的穩(wěn)定性有一定影響。因此,葛根素在生產(chǎn)、貯存及使用過(guò)程中應(yīng)注意避免與還原劑和Cu2+離子存在的環(huán)境接觸。

野葛藤,葛根素,提取優(yōu)化,穩(wěn)定性

野葛為豆科葛屬多年生落葉草質(zhì)藤本植物,在我國(guó)分布廣泛,為湖南省永州市地區(qū)的優(yōu)勢(shì)植物資源之一,具有良好的食用與藥用價(jià)值[1-2]。野葛對(duì)湘南地區(qū)的地形與氣候適應(yīng)力強(qiáng),葛藤可迅速蔓延,并與當(dāng)?shù)刂参锢p繞[3]。這種定殖擴(kuò)散能力使其迅速建立起了種群優(yōu)勢(shì),對(duì)當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)平衡造成了較明顯的負(fù)面作用[4-6]。葛根素是野葛異黃酮類化合物的主要成分,藥用價(jià)值突出,市場(chǎng)需求量大[7-8],但葛根素產(chǎn)品的來(lái)源多局限于野葛地下塊根部位[9-10]。近年來(lái),有關(guān)野葛藤中有效成分的研究工作已初步展開,但目前仍將其列為破壞性較強(qiáng)的入侵植物,研究多集中于采用人為方法進(jìn)行防控,而缺乏有效的后續(xù)利用[4-6]。因此,對(duì)野葛藤進(jìn)行功能性成分開發(fā)可促進(jìn)其從生態(tài)危害物向植物藥用資源轉(zhuǎn)型。目前,葛根的藥用范圍多集中于地下部分,而較為發(fā)達(dá)的地上藤莖的利用率很低,除部分葛藤作為飼料外,大都將其作為廢棄物丟棄,造成了環(huán)境污染與資源浪費(fèi)。研究地上部分野葛藤的葛根素提取工藝,并針對(duì)葛根素提取物進(jìn)行穩(wěn)定性研究以探究合適的儲(chǔ)存環(huán)境,對(duì)合理開發(fā)野葛產(chǎn)業(yè)具有重要的意義。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

野葛藤采摘于湖南省永州市零陵區(qū)朝陽(yáng)巖公園,經(jīng)學(xué)校葛根課題組鑒定為野生葛藤。

葛根素標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%)上海源葉生物科技有限公司;超純水;乙醇為分析純。

電子天平上海玉博生物科技有限公司;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱北京科偉永興儀器有限公司;臺(tái)式低速離心機(jī)上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋金壇市億通電子有限公司;小型粉碎機(jī)天津奈斯特儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品前處理把葛根藤用超純水洗凈,干燥粉碎后過(guò)篩(100目)備用。

1.2.2葛根素吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作稱取約2.0 mg干燥恒重的葛根素對(duì)照品,并用溶液濃度為95%的乙醇溶解于50 mL容量瓶中,定容至50 mL,并搖勻,分別精確吸取上述溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL容量瓶中,并用超純水定容;另以1 mL濃度為95%乙醇加水至10 mL的溶液做空白對(duì)照,將配制好的溶液在250 nm下進(jìn)行比色測(cè)定,以對(duì)葛根素質(zhì)量濃度與吸光度作線性回歸[11],得葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.0268X+0.0662,R2=0.9990。

1.2.3野葛藤中葛根素得率的計(jì)算

式中:x-葛根素得率(%);A-測(cè)量的吸光度;B-稀釋的倍數(shù);V-過(guò)濾液體的總體積(mL);m-實(shí)驗(yàn)原料所稱量的質(zhì)量(g)。

1.3單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.1提取時(shí)間對(duì)葛根素得率的影響保持其它浸提條件不變(70%乙醇,在70 ℃水浴下加熱,料液比1∶10 g/mL),設(shè)置40、60、80、100、120 min 5個(gè)水平,平行實(shí)驗(yàn)3次,研究浸提時(shí)間對(duì)野葛藤中葛根素得率的影響。

1.3.2乙醇濃度對(duì)葛根素得率的影響在浸提時(shí)間2 h、70 ℃水浴溫度、料液比1∶10 g/mL下,分別設(shè)置10%、30%、50%、70%、90% 5個(gè)水平,平行實(shí)驗(yàn)3次,考察乙醇濃度對(duì)野葛藤中葛根素得率的影響。

1.3.3提取溫度對(duì)葛根素得率的影響其他工藝條件不變(70%乙醇,浸提時(shí)間2 h,料液比1∶10 g/mL),平行實(shí)驗(yàn)3次,研究40、50、60、70、80 ℃不同溫度下對(duì)野葛藤中葛根素得率的影響。

1.3.4料液比對(duì)葛根素得率的影響在70%乙醇,浸提時(shí)間2 h,水浴溫度70 ℃條件下,分別設(shè)置浸提料液比1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18 g/mL,平行實(shí)驗(yàn)3次,研究不同的料液比對(duì)野葛藤中葛根素得率的影響。

1.4響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法中的Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)野葛藤中葛根素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,選取提取時(shí)間、提取溫度、料液比為考察因素,分別以X1、X2和X3代表,以得率為響應(yīng)值(Y),實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1　Factors and levels of RAS test

1.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

以吸光度的變化為指標(biāo),研究氧化還原劑和金屬離子的存在下,野葛藤中葛根素提取物穩(wěn)定性的變化。分別配制3%、6%、9%、12%、15% H2O2溶液與2.5 mg/mL葛根素1∶1混合,靜置3 h,采用紫外分光光度計(jì)在250 nm處測(cè)定吸光值,檢測(cè)不同濃度H2O2溶液對(duì)葛根素穩(wěn)定性的影響;分別配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L Na2SO3溶液,與2.5 mg/mL葛根素溶液1∶1混合,靜置3 h,采用紫外分光光度計(jì)在250 nm處測(cè)定吸光度值,檢測(cè)不同濃度Na2SO3溶液對(duì)葛根素穩(wěn)定性的影響;分別配制0.2 mol/L的Na+、K+、Cu2+溶液,與2.5 mg/mL葛根素溶液以1∶1比例混合,在3 h內(nèi),每隔0.5 h采用紫外分光光度計(jì)在250 nm處測(cè)定吸光值的變化,評(píng)價(jià)不同金屬鹽對(duì)葛根素穩(wěn)定性的影響[12]。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所得數(shù)據(jù)用Excel 2007作圖,并用Design-expert 8.0.5b軟件進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1提取時(shí)間對(duì)葛根素得率的影響如圖1所示,提取時(shí)間對(duì)野葛藤中葛根素得率有較大影響。80 min以前,隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),葛根素的得率逐漸提升;在80 min處得率達(dá)到最大值,隨后逐漸降低,可能是隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),葛根素的氧化分解速率大于其提取效率,故控制提取時(shí)間在80 min左右時(shí),提取效果較好。

圖1　提取時(shí)間對(duì)野葛藤中葛根素得率的影響Fig.1　Effect of extraction time on pueraria extraction rate in the Vine of Pueraria lobata

2.1.2乙醇濃度對(duì)葛根素得率的影響如圖2所示,乙醇濃度對(duì)野葛藤中葛根素得率影響相對(duì)其它三個(gè)因素表現(xiàn)較弱。低濃度乙醇梯度下,葛根素得率的增長(zhǎng)較為緩慢;當(dāng)乙醇濃度超過(guò)50%后,提取效率迅速提高;當(dāng)濃度為70%時(shí)得率最大,繼續(xù)提高乙醇濃度時(shí),葛根素得率開始降低,表明適當(dāng)增大乙醇比例會(huì)促進(jìn)這種作用,過(guò)高則對(duì)反應(yīng)體系無(wú)益,且增加了投料成本。最終確定乙醇的適宜濃度為70%。

圖2　乙醇濃度對(duì)野葛藤中葛根素得率的影響Fig.2　Effect of ethanol concentration on pueraria extraction rate in the Vine of Pueraria lobata

2.1.3提取溫度對(duì)葛根素得率的影響如圖3所示,可以看出,提取溫度對(duì)葛根素得率的影響機(jī)制較為復(fù)雜,在50 ℃和80 ℃處出現(xiàn)了兩個(gè)極大值點(diǎn),相對(duì)而言,在80 ℃范圍內(nèi)提取結(jié)果較為理想。表明在較低溫度下,溫度的變化與葛根素得率之間存在非線性關(guān)系,故應(yīng)考察溫度較高環(huán)境下葛根素得率的變化。

圖3　提取溫度對(duì)野葛藤中葛根素得率的影響Fig.3　Effect of extraction temperature on pueraria extraction rate in the Vine of Pueraria lobata

2.1.4料液比對(duì)葛根素得率的影響由圖4知,隨著料液比的提高,葛根素的得率總體呈先升后降趨勢(shì)。料液比為1∶14 g/mL之前,葛根素得率逐漸升高;繼續(xù)提高料液比,其得率開始下降。其原因可能是料液比的變化能直接影響葛根素在植物細(xì)胞內(nèi)外的擴(kuò)散平衡,使得得率上下浮動(dòng)。

（2）熱處理調(diào)質(zhì)后變形風(fēng)險(xiǎn)大 根據(jù)技術(shù)條件的性能試料要求編制的粗加工圖如圖2所示，增加性能試料區(qū)和粗加工余量后粗加工尺寸變?yōu)棣?430mm×350mm。雖然在工藝準(zhǔn)備時(shí)充分考慮到變形因素并適當(dāng)增加厚度方向上的余量，力求在源頭上保證熱處理變形后尺寸能夠滿足精加工要求，但管板直徑大、壁厚小、高徑比小，熱處理調(diào)質(zhì)時(shí)容易變形，調(diào)質(zhì)后變形風(fēng)險(xiǎn)大。

圖4　料液比對(duì)野葛藤中葛根素得率的影響Fig.4　Effect of the solid-liquid ratio on pueraria extraction rate in the Vine of Pueraria lobata

2.2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,并考慮實(shí)際情況,確定乙醇最佳提取濃度為70%,在此基礎(chǔ)上以提取時(shí)間、提取溫度、料液比為考察因素,以得率為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),方案見(jiàn)表1。

表2　野葛藤中葛根素提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2　Design and experiment results of response surface methodology of pueraria extraction in the Vine of Pueraria lobata

表3　回歸模型方差分析Table 3　Analysis of variance for the regression model

注:**p<0.01為極顯著;*p<0.05為顯著。

采用Design expert 8.0.5b軟件對(duì)表2中實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多項(xiàng)擬合回歸,得到野葛藤中葛根素得率(Y)對(duì)提取時(shí)間(X1)、提取溫度(X2)、料液比(X3)的二次多項(xiàng)回歸模型方程:Y=2.23+0.061X1-0.071X2+0.035X3+0.0025X1X2-0.01X1X3-0.01X2X3-0.088X12-0.33X22-0.14X32。

2.2.1響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头讲罘治鰹榱藱z驗(yàn)回歸方程的有效性,進(jìn)一步確定各因素對(duì)野葛藤中葛根素得率的影響程度,對(duì)回歸模型進(jìn)行了方差分析,結(jié)果見(jiàn)表3。模型的p<0.0001,極顯著;失擬項(xiàng)的p值為0.0558,不顯著,決定系數(shù)為0.9869,響應(yīng)值的變化有98.69%來(lái)源于所選因素,即來(lái)源于提取時(shí)間、提取溫度、料液比,說(shuō)明模型擬合度好,回歸方程能很好的描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系,該實(shí)驗(yàn)方法可靠[13]。

回歸模型中一次項(xiàng)的p值均小于0.01,達(dá)到極顯著,二次項(xiàng)的p值亦小于0.0001,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)中3個(gè)因素的二次項(xiàng)都具有極顯著影響;而其交互項(xiàng)及失擬項(xiàng)顯著性較差。這表明實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系,而是一種非線性關(guān)系[14]。單考察p值大小,可確定各因素的效應(yīng)關(guān)系為:X2(提取溫度)>X1(提取時(shí)間)>X3(料液比)。

響應(yīng)曲面坡度越陡峭,表明響應(yīng)值對(duì)于操作條件的改變?cè)矫舾?反之曲面坡度越平緩,操作條件的改變對(duì)響應(yīng)值的影響也就越小[15]。圖5直觀地反映了各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響,提取時(shí)間和提取溫度的陡峭程度相對(duì)較高,表明其對(duì)野葛藤中葛根素得率的交互作用相對(duì)明顯。

圖5　各提取因素之間的交互作用影響Fig.5　Effect of interaction of Extraction factor on the yield of pueraria

2.2.2驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)用Design-expert 8.0.5b軟件對(duì)二次多項(xiàng)式回歸方程進(jìn)行計(jì)算,得到最佳的提取條件為提取溫度78.93 ℃,提取時(shí)間為86.77 min,料液比為14.24倍乙醇體積,預(yù)測(cè)得率為2.25031%?？紤]到單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及實(shí)際操作的局限性,野葛藤中葛根素的提取工藝最終修正為:提取溫度79 ℃、提取時(shí)間87 min、料液比1∶14 g/mL。此條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,設(shè)置4次平行實(shí)驗(yàn),如表4所示,得到野葛藤中葛根素最大得率為2.2515%,幾乎等同于預(yù)測(cè)值,表明模型可靠。

2.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.3.1氧化劑對(duì)葛根素穩(wěn)定性的影響由圖6知,隨著H2O2處理濃度的提高,葛根素提取物的吸光度的下降幅度很小,說(shuō)明氧化劑對(duì)野葛藤中葛根素的穩(wěn)定性影響小。

表4　葛根素得率Table 4　Extraction rate of pueraria

圖6　氧化劑對(duì)野葛藤中葛根素穩(wěn)定性的影響Fig.6　Effect of oxidant on the stability of pueraria in the Vine of Pueraria lobata

2.3.2還原劑對(duì)葛根素穩(wěn)定性的影響如圖7所示,葛根素溶液中添加還原劑Na2SO3后,吸光度隨著還原劑Na2SO3濃度的增大而逐漸增加。這可能是隨著還原劑的加入使葛根素最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生偏移,導(dǎo)致吸光度增加[15]。因此,葛根素在生產(chǎn)、貯存及使用過(guò)程中應(yīng)注意避免與還原劑接觸。

圖7　還原劑對(duì)野葛藤中葛根素穩(wěn)定性的影響Fig.7　Effect of reducing agent on the stability of pueraria in the Vine of Pueraria lobata

2.3.3金屬離子對(duì)葛根素穩(wěn)定性的影響由圖8可以看出,加入Na+、K+兩種金屬離子后,葛根素的吸光度值基本不變,而加入Cu2+后,吸光度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,Cu2+或能與葛根素生成某種配合物以致最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生偏移[12],故葛根素應(yīng)避免與含有Cu2+的溶液接觸。

圖8　金屬離子對(duì)野葛藤中葛根素穩(wěn)定性的影響Fig.8　Effect of mental ion on the stability of pueraria in the Vine of Pueraria lobata

3　結(jié)論

在不考慮其他因素的情況下,根據(jù)單因素優(yōu)化及響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析得到野葛藤中葛根素最佳提取條件:提取溫度為79 ℃,提取時(shí)間為87 min,料液比為1∶14 g/mL;葛根素的得率為2.2515%。由方差分析和各因素交互作用可知,野葛藤中葛根素提取條件因素的影響主次順序?yàn)?提取溫度>提取時(shí)間>料液比。葛根素的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:氧化劑H2O2不影響葛根素穩(wěn)定性;還原劑Na2SO3會(huì)破壞其穩(wěn)定性,Na2SO3導(dǎo)致葛根素吸光度值變化。因此,葛根素在生產(chǎn)、貯存及使用過(guò)程中應(yīng)注意避免與還原劑接觸。Na+、K+兩種離子不影響葛根素的穩(wěn)定性,而Cu2+離子對(duì)葛根素穩(wěn)定性影響較大,會(huì)改變其吸光度值,應(yīng)盡量避免與其接觸。本研究對(duì)延長(zhǎng)野葛加工的產(chǎn)業(yè)鏈有一定的參考價(jià)值,為明確葛根素的適宜環(huán)境提供了一定的參考,并且為今后開發(fā)野葛藤?gòu)V泛的保健及藥用價(jià)值提供了一定的理論依據(jù)。

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Study on the extraction and stability of pueraria in aerial parts of the Vine ofPuerarialobata

LI Ling1,2,QUAN Qin-guo3,SHEN Yan-xin1,HE Fu-lin1,SHAO Jin-hua1,YAN Xu-yu1,*

(1.Department of Chemistry and Biological Engineering,Hunan University of Science and Engineering,Key Laboratory of Comprehensive Utilization of Advantage Plants Resources in Hunan South,Yongzhou 425199,China;2.College of Agriculture and Biotechnology,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China;3.Institute of Agro-products Processing Science and Technology,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Laboratory of Agro-products Quality Safety Risk Assessment,Ministry of Agriculture,Beijing 100193,China)

In this experiment,pueraria was extracted from the Vine ofPuerarialobatausing ethanol refluxing method.The main influence factors(the extraction temperature,the extraction time,the solid-liquid ratio)of extraction rate were selected from the results of single factor test,the extraction conditions of pueraria were optimized by response surface design,and its stability to oxidizer(reducer)and metal ion was studied.The results showed that the optimum extraction technology was for the extraction temperature 79 ℃,the extraction time was 87 min,and the solid-liquid ratio of 1∶14 g/mL,the extraction rate of pueraria was 2.2515%.The stability results indicated that the pueraria were not affected by H2O2as the oxidizing agent,but the change of the absorbency was caused by Na2SO3as the reducing agent.The stability of pueraria was not affected by Na+and K+,but it was influenced by Cu2+.So the storage and use of the pueraria process should avoid contacting with reducing agent and Cu2+.

Vine ofPuerarialobata;pueraria;extraction and optimization;stability

2015-08-07

李玲(1982-)，女，博士，副教授，研究方向：植物生物技術(shù)，E-mail：liling7826@126.com。

閆旭宇(1979-)，男，碩士，講師，研究方向：植物生物技術(shù)，E-mail:yanxuyu1979@163.com。

中國(guó)博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2014M561768)；湖南科技學(xué)院湘南優(yōu)勢(shì)植物資源綜合利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金XNZW14C12；湖南省永州市2015年度指導(dǎo)性科技計(jì)劃項(xiàng)目2015-10號(hào)；永州市科技創(chuàng)新項(xiàng)目(永財(cái)企指2015[25]號(hào)-9)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)09-0235-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.037