牛干巴中降膽固醇、降亞硝酸鹽乳酸菌的分離篩選及其發(fā)酵性能

宋小娟,何臘平,3,*,李翠芹,朱秋勁,范　勁

(1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550025;2.貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州貴陽(yáng) 550025;3.貴州省豬肉制品工程技術(shù)研究中心,貴州貴陽(yáng) 550025;4.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550025)

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牛干巴中降膽固醇、降亞硝酸鹽乳酸菌的分離篩選及其發(fā)酵性能

宋小娟1,2,何臘平1,2,3,*,李翠芹4,朱秋勁1,2,范勁1

(1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550025;2.貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州貴陽(yáng) 550025;3.貴州省豬肉制品工程技術(shù)研究中心,貴州貴陽(yáng) 550025;4.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550025)

以傳統(tǒng)發(fā)酵牛干巴作為乳酸菌篩選源,分離出18株乳酸菌,通過(guò)OPA法測(cè)定降膽固醇能力,鹽酸萘乙二胺比色法測(cè)定降解亞硝酸鹽能力,菌株NR7對(duì)膽固醇的清除率是22.61%,培養(yǎng)12 h和24 h亞硝酸鹽分別降解了34.177 μg/mL和95.82 μg/mL,在pH3.0的環(huán)境中活菌率達(dá)99.50%,對(duì)0.3%的膽鹽耐受性強(qiáng)。因此,選擇NR7作為目的菌株,進(jìn)一步研究其生產(chǎn)適應(yīng)性,能夠在發(fā)酵4 h后使pH迅速降低,能夠在15～40 ℃環(huán)境條件下生長(zhǎng),能夠耐受8%的NaCl和200 mg/kg的NaNO2,且真空冷凍干燥后活菌率93.62%,4 ℃條件下保藏30 d后活菌率可達(dá)89.99%。16S rRNA分子生物學(xué)鑒定,菌株NR7為植物乳桿菌。

牛干巴,膽固醇,亞硝酸鹽,植物乳桿菌,發(fā)酵性能

牛干巴是回族傳統(tǒng)腌臘制品,其營(yíng)養(yǎng)豐富,肉質(zhì)酥脆、食而不膩、聞而不腥,風(fēng)味獨(dú)特而深受喜愛[1]。不過(guò)傳統(tǒng)工藝存在品質(zhì)難以控制、發(fā)酵周期長(zhǎng)等缺陷,如果能從傳統(tǒng)發(fā)酵牛干巴中篩選出功能菌,然后對(duì)發(fā)酵工藝實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)化控制就可以控制發(fā)酵質(zhì)量和縮短發(fā)酵周期。傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中的功能菌主要是乳酸菌[2-3],所以本文計(jì)劃從傳統(tǒng)發(fā)酵牛干巴中篩選功能乳酸菌。再者,隨著人們生活水平的提高,更加注重健康飲食,低鹽、低脂肪的食品更受人們青睞。肉制品中脂肪含量高,但脂肪對(duì)食品的感官、風(fēng)味、氣味、質(zhì)構(gòu)、口感等都有影響,然而過(guò)多的攝入會(huì)給人體健康帶來(lái)危害,引起肥胖、血清中膽固醇含量升高,后者被認(rèn)為是誘發(fā)冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素[4]。WHO預(yù)測(cè)心血管疾病直到2030年,仍然是死亡的主要原因,影響兩千三百萬(wàn)人。臨床研究表明,超過(guò)正常血清膽固醇水平(>5.2 mmol)1 mmol,患冠心病的幾率增加35%,同時(shí),減少1%血清膽固醇水平將降低2%～3%的患病風(fēng)險(xiǎn)。亞硝酸鹽急性中毒導(dǎo)致高鐵血紅蛋白血癥,慢性中毒有致癌和致畸風(fēng)險(xiǎn),腌臘制品中亞硝酸鹽殘留量也讓人們對(duì)腌臘制品望而卻步,但亞硝酸鹽具有維持人體一氧化氮平衡,促進(jìn)心血管健康的作用[5]。

而研究報(bào)道表明不少乳酸菌能降低亞硝酸鹽和血清膽固醇,防止癌癥,所以為了改善傳統(tǒng)牛干巴的發(fā)酵工藝并提升其價(jià)值,本文計(jì)劃從牛干巴篩選降低膽固醇和降低亞硝酸鹽的功能性乳酸菌,并分析其發(fā)酵性能,為其潛在工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

以貴州省黔西南興仁縣回族牛干巴為篩選源;大腸桿菌和金黃色葡萄球菌由實(shí)驗(yàn)室提供。

MRS培養(yǎng)基,CaCO3,30% H2O2溶液,膽固醇(≥99%),膽固醇(≥95.5%)鄰苯二甲醛,濃硫酸,冰乙酸,乙酸鋅,對(duì)氨基苯磺酸,鹽酸萘乙二胺,亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液,硼砂,亞鐵氰化鉀,牛膽鹽,蔗糖八乙酸脂,脫脂乳粉,糖發(fā)酵鑒定管。

高壓蒸汽滅菌鍋江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司;奧林巴斯生物顯微鏡奧林巴斯中國(guó)有限公司;司水套式二氧化碳培養(yǎng)箱上海三騰儀器有限公司;紫外可見分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限公司;S-3C型pH計(jì)成都世紀(jì)方舟科技有限公司;立式超低溫冰箱海爾特種電器有限公司;真空冷凍干燥機(jī)北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1乳酸菌的分離純化在無(wú)菌操作條件下,將剪碎的25 g樣品加入225 mL無(wú)菌蛋白胨水的三角瓶中(蛋白胨1 g/L,NaCl 0.85 g/L,吐溫-80 1 mL/L),于搖床上振蕩60 min,靜置10 min。取上清液1 mL作10倍梯度稀釋,選擇合適稀釋濃度涂布于CaCO3-MRS培養(yǎng)基平板上,37 ℃下厭氧培養(yǎng)48 h,挑選產(chǎn)生溶鈣圈的單菌落,繼續(xù)分離純化。純菌革蘭氏染色后,選取革蘭氏陽(yáng)性菌和觸酶陰性菌(直接在菌落上滴加3%～15% H2O2),鏡檢觀察。分離至純的菌株進(jìn)行斜面接種,0～4 ℃下短期保藏,或終濃度20%的甘油-80 ℃下長(zhǎng)期保藏。

1.2.2乳酸菌的生理特性指標(biāo)通過(guò)過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、石蕊牛乳實(shí)驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)、乙酰甲基甲醇實(shí)驗(yàn)(V-P)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、乳酸定性實(shí)驗(yàn)以及運(yùn)動(dòng)性檢查,并且測(cè)定菌株是否滿足發(fā)酵肉制品基本條件:不產(chǎn)粘液,不產(chǎn)H2S,抑制病原菌的生長(zhǎng)等[6]。

1.2.3乳酸菌降膽固醇能力測(cè)定乳酸菌的降膽固醇能力參考文獻(xiàn)報(bào)道的OPA法(鄰苯二甲醛法)[7]。新鮮培養(yǎng)的菌株按3%(v/v)接種于膽固醇含量為100 μg/mL的MRS液體培養(yǎng)基中,在37 ℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,12000 r/min,離心10 min測(cè)定上清液中膽固醇?xì)埩袅俊?/p>

1.2.4乳酸菌降解亞硝酸鹽的能力乳酸菌降解亞硝酸鹽的測(cè)定根據(jù)GB 5009.3-2010方法測(cè)定,將菌株按3%(V/V)接種于NaNO2的濃度為100 μg/mL的MRS液體培養(yǎng)基中,分別于0、12、24 h測(cè)定NaNO2的殘留量。

1.2.5乳酸菌的耐酸、耐膽鹽能力

1.2.5.1耐酸能力待測(cè)菌株在MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)20 h,取0.3 mL的細(xì)菌培養(yǎng)液接種于10 mL磷酸鹽緩沖液,分別用5 mol·L-1HCl調(diào)節(jié)pH至3。初始細(xì)菌濃度為106～108CFU·mL-1,置于37 ℃下培養(yǎng)3 h。采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)存活菌數(shù),并計(jì)算存活率。

存活率(%)=培養(yǎng)3 h后的活菌數(shù)/培養(yǎng)前的活菌數(shù)×100

1.2.5.2耐膽鹽能力篩選菌株接種于6 mL MRS培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)20 h,將0.3 mL培養(yǎng)物分別接種于10 mL含膽鹽0(即空白)、0.3%的MRS液體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)24 h后,于600 nm處測(cè)定培養(yǎng)液的 OD值,計(jì)算菌株對(duì)不同濃度膽鹽的耐受能力。

膽鹽耐受力(%)=加膽鹽培養(yǎng)基的OD值/空白培養(yǎng)基的OD值×100

1.2.6乳酸菌生產(chǎn)適應(yīng)性

1.2.6.1乳酸菌的生長(zhǎng)曲線以及產(chǎn)酸能力將活化好的菌種按3%(V/V)的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h,每隔2 h取樣測(cè)定OD600值,并測(cè)定樣液的pH。

1.2.6.2乳酸菌的耐鹽、耐亞硝酸鹽能力將菌種接種于添加0、2%、4%、6%、8% NaCl的MRS液體培養(yǎng)基,在有氧環(huán)境中37 ℃培養(yǎng)24 h,以不接菌的相應(yīng)的NaCl濃度的MRS液體培養(yǎng)基作空白對(duì)照,在600 nm下測(cè)定培養(yǎng)液OD值,比較菌種在不同鹽濃度下的生長(zhǎng)情況。

將菌種接種于添加0、50、100、150、200 mg/kg NaNO2的MRS液體培養(yǎng)基,在有氧環(huán)境中37 ℃培養(yǎng)24 h,以空白MRS液體培養(yǎng)基作對(duì)照,在600 nm條件下測(cè)定OD值,比較菌株對(duì)亞硝酸鹽的耐受能力。

1.2.6.3乳酸菌在不同溫度下生長(zhǎng)情況根據(jù)肉制品發(fā)酵工藝條件要求,將菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中,分別在4、15、25、35、45 ℃條件下培養(yǎng)24 h,于波長(zhǎng)600 nm測(cè)定菌株生長(zhǎng)狀況,同時(shí)用pH計(jì)測(cè)定不同溫度菌株產(chǎn)酸情況。

1.2.6.4乳酸菌抗冷凍干燥能力新鮮培養(yǎng)物4000 r/min離心10 min,收集菌體以10%的脫脂乳為真空冷凍干燥的保護(hù)劑混勻后分裝,預(yù)凍3 h,冷凍干燥12 h,分別在不同時(shí)間段測(cè)定菌粉保藏在25 ℃和4 ℃條件下活菌數(shù),單位log CFU/mL。

1.2.7乳酸菌的鑒定

1.2.7.1形態(tài)鑒定菌株于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h觀測(cè)菌落特征,記錄菌落邊緣形狀、大小、顏色,顯微鏡觀察菌體革蘭氏染色、個(gè)體形態(tài)等。

1.2.7.216S rRNA分子生物學(xué)鑒定DNA的提取:采用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒,方法根據(jù)試劑盒說(shuō)明書。PCR擴(kuò)增:引物為27F:AGTTTGA TCMTGGCTCAG;1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT,具體實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)報(bào)道[8]。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳分析后測(cè)序,所得序列在NCBI中比對(duì),選取相似性較高的菌株的16S rRNA序列,用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.8統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件分析,p<0.05表示差異顯著,p>0.05表示無(wú)顯著差異。

2　結(jié)果與討論

2.1菌株分離純化以及生理特性指標(biāo)

通過(guò)挑選CaCO3-MRS培養(yǎng)基平板上產(chǎn)酸能力強(qiáng)的菌株進(jìn)一步純化、鏡檢,最終保藏革蘭氏陽(yáng)性,過(guò)氧化氫酶陰性,吲哚實(shí)驗(yàn)、石蕊牛乳實(shí)驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)等滿足益生乳酸菌要求,能抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng),且不產(chǎn)粘液和H2S菌株的共18株。

2.2菌株降膽固醇能力測(cè)定

將上述牛干巴中分離的菌株編號(hào)為NR1,NR2,…,NR18,通過(guò)OPA法測(cè)定其膽固醇清除能力,測(cè)定的OD550的值代入所測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0051x-0.0009,R2=0.9988中,結(jié)果如表1所示,膽固醇清除率為7.29%～22.61%。為提高篩選效率,選擇18株乳酸菌中膽固醇清除率>15%的菌株6株NR6,NR7,NR9,NR10,NR13,NR16進(jìn)行后續(xù)研究。

表1　菌株膽固醇清除能力Table 1　The cholesterol reducing rate of strains

Esra Tok等[4]研究五種德氏乳桿菌在不同培養(yǎng)時(shí)間下膽固醇清除能力,發(fā)現(xiàn)19 h和48 h膽固醇清除率無(wú)顯著差異(p>0.05),因此將菌株培養(yǎng)19 h即可,且文獻(xiàn)報(bào)道了這五種德氏乳桿菌的膽固醇清除率為8%～26%。乳酸菌降解膽固醇的機(jī)理尚不明確,Miremadi等[9]對(duì)益生乳桿菌和雙歧桿菌的降膽固醇機(jī)理進(jìn)行研究,結(jié)果表明菌株對(duì)膽固醇的清除能力是由于不同原因造成,有的主要以產(chǎn)BSH影響,有的以同化吸收為主。汪曉輝等[10]從泡菜、傳統(tǒng)臘腸中篩選出降膽固醇率分別為49.11%和50.03%的植物乳桿菌。

2.3菌株降解亞硝酸鹽能力

腌制食品中添加亞硝酸鹽能抑制肉毒桿菌的生長(zhǎng),抑制毒素的產(chǎn)生,且對(duì)發(fā)酵肉的色澤和風(fēng)味起重要作用。新鮮肉中的血紅素也增加癌癥的風(fēng)險(xiǎn),在胃腸道中血紅素能夠促進(jìn)亞硝基的合成。而腌制肉中添加亞硝酸鹽能提高亞硝基合成,由于這個(gè)原因,大量研究報(bào)道亞硝酸鹽替代物:如蔬菜提取物(芹菜),天然抗菌劑(乳酸,細(xì)菌素,或者直接添加益生乳酸菌),以及嚴(yán)格控制加工過(guò)程。到目前為止,還沒(méi)有找到任何一種單一的化合物能夠代替亞硝酸鹽在肉制品發(fā)酵過(guò)程中所起的多重作用[11]。

歐洲2006/52/EC指令規(guī)定:在干發(fā)酵香腸中硝酸鹽和亞硝酸鹽的最大添加量均為150 mg/kg,而長(zhǎng)時(shí)間腌制的產(chǎn)品在沒(méi)有添加亞硝酸鹽的情況下,硝酸鹽的最大添加量可以是250 mg/kg。在2007年,丹麥官方規(guī)定在沙拉米香腸中亞硝酸鹽的最大使用量為100 mg/kg,又考慮到香腸發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生亞硝胺,2011年丹麥官方就規(guī)定歐洲所有肉制品的亞硝酸鹽的最大添加量應(yīng)低于100 mg/kg。

為進(jìn)一步篩選目的菌株,通過(guò)鹽酸萘乙二胺比色法測(cè)定膽固醇清除率大于15%的6株乳酸菌的降解亞硝酸鹽能力,于波長(zhǎng)538 nm測(cè)定OD值,測(cè)定結(jié)果代入所測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0158x-0.0011中,結(jié)果如表2所示。初始配制的MRS液體培養(yǎng)基中NaNO2的濃度為100 μg/mL,滅菌后測(cè)得實(shí)際值為93.797 μg/mL,亞硝酸鹽的降解率按實(shí)際測(cè)定值計(jì)算。從表2中可知,菌株培養(yǎng)12 h時(shí)降解亞硝酸鹽的能力呈顯著差異(p<0.05),NR7在12 h時(shí)降解率達(dá)36.44%,降解量34.177 μg/mL。當(dāng)培養(yǎng)24 h,菌株對(duì)亞硝酸鹽的降解率除NR10和NR6以外,其余菌株無(wú)顯著差異(p>0.05)均大于95%,降解量最高達(dá)89.873 μg/mL。菌株NR10降解亞硝酸鹽的能力明顯低于其他5株菌,因此選擇NR6,NR7,NR11,NR14,NR17進(jìn)行下一步研究。

2.4菌株耐酸、耐膽鹽能力

2.4.1耐酸能力耐酸耐膽鹽是乳酸菌作為食補(bǔ)因子的重要指標(biāo),益生乳酸菌隨食物進(jìn)入胃腸道環(huán)境,而人體胃液pH為3.0左右,空腹時(shí)可達(dá)1.5,食物在胃中停留時(shí)間大約在2～3 h,而作為益生菌必需具有較好的耐酸性[12]。由表3可知,5株實(shí)驗(yàn)菌株在pH為3.0的環(huán)境中處理3 h的活菌率呈顯著差異(p<0.05),其中耐酸能力最強(qiáng)的菌株NR7,活菌率為99.50%。作為益生菌,不僅耐酸,還需具有一定耐膽鹽能力。因此,進(jìn)一步研究其耐膽鹽能力。

表2　菌株降解亞硝酸鹽能力Table 2　The nitrite degradation ability of strains

注:表中同列不同字母表示差異顯著,下同。

表3　菌株耐酸能力Table 3　The tolerance of strains on acid

2.4.2耐膽鹽能力人體正常的膽鹽濃度是在0.03%～0.3%之間,食物通過(guò)腸道的時(shí)間一般是4～16 h[13]。因此將實(shí)驗(yàn)菌株在0.3%的膽鹽中處理24 h,結(jié)果如圖1所示,菌株NR7對(duì)0.3%的膽鹽有較高的耐受性,顯著(p<0.05)優(yōu)于其他菌株。因此將NR7作為篩選的具有降膽固醇和降亞硝酸鹽的目的菌株進(jìn)行發(fā)酵特性研究。

圖1　菌株在含0.3%的膽鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后的變化Fig.1　The change of strains in medium containing 0.3% bile salt culture after 24 h

2.5菌株NR7的生產(chǎn)適應(yīng)性

肉制品發(fā)酵劑的篩選條件:產(chǎn)酸快,能在15～40 ℃條件下生長(zhǎng),對(duì)肉制品發(fā)酵過(guò)程添加輔料(NaCl和NaNO2)具有耐受性[14]。發(fā)酵劑的制作采用真空冷凍干燥技術(shù),因此還需具有一定抗冷凍干燥的能力,使菌株活菌率達(dá)8 log CFU/mL[15]。

2.5.1菌株發(fā)酵特性如圖2中A為NR7的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸特性,在6 h就開始對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,12 h進(jìn)入穩(wěn)定期,在12 h,pH從6.5降到4.0,然后趨于穩(wěn)定。B表示NR7在不同溫度條件下生長(zhǎng)狀況,圖中顯示菌株在15～40 ℃之間均能生長(zhǎng),各溫度下菌株的生長(zhǎng)呈顯著差異(p<0.05),且在35 ℃下生長(zhǎng)快,產(chǎn)酸能力強(qiáng)。C表示NR7對(duì)鹽的耐受性,2%的NaCl與空白對(duì)照組無(wú)顯著差異(p>0.05),其不同濃度間生長(zhǎng)狀態(tài)呈顯著差異(p<0.05),且菌株NR7對(duì)8%的NaCl具有較高耐受性,原因可能是篩選源含鹽量高,使得其具有高耐鹽性。D表示對(duì)不同濃度亞硝酸鹽耐受性,可見含50 mg/kg的NaNO2實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組差異不顯著(p>0.05),與其他濃度實(shí)驗(yàn)組呈顯著差異(p<0.05)。而100～200 mg/kg NaNO2之間無(wú)顯著差異,可能與菌株NR7降解亞硝酸鹽的能力有關(guān)。

圖2　菌株發(fā)酵特性Fig.2　The strain fermentation charactristics (A)生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸特性; (B)不同溫度下生長(zhǎng)情況以及產(chǎn)酸能力; (C)對(duì)鹽耐受性;(D)對(duì)亞硝酸鹽耐受性。

保藏條件(℃)初始活菌數(shù)(logCFU/mL)凍干后活菌數(shù)(logCFU/mL)存活率(%)5d后活菌數(shù)(logCFU/mL)存活率(%)15d活菌數(shù)(logCFU/mL)存活率(%)30d活菌數(shù)(logCFU/mL)存活率(%)259.09±0.018.51±0.0193.628.16±0.0289.777.57±0.0383.284.62±0.0850.8349.09±0.018.51±0.0193.628.42±0.0192.638.37±0.0192.088.18±0.0289.99

表5　菌株NR7的生理生化特性Table 5　Physiological and biochemical characteristics of stain NR7

注:+表示陽(yáng)性反應(yīng),-表示陰性反應(yīng)。

2.5.2菌株NR7抗真空冷凍干燥的能力為了方便使用,選擇10%脫脂乳粉作為凍干保護(hù)劑,測(cè)定不同保藏時(shí)間,保藏條件菌株NR7抗冷凍干燥能力,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。冷凍干燥后活菌率達(dá)93.62%,隨著時(shí)間延長(zhǎng),活菌率逐漸降低,且常溫(25 ℃)降低更顯著,在4 ℃條件下保藏30 d活菌率達(dá)89.99%,滿足直投式發(fā)酵劑要求。Jagannath等[16]選擇了脫脂乳粉作為乳酸菌菌株保護(hù)劑,將實(shí)驗(yàn)菌株與保護(hù)劑混合,采用真空冷凍干燥技術(shù)制備凍干菌粉,菌株凍干菌粉分別保藏在4 ℃和25 ℃條件下,乳酸菌凍干粉在4 ℃條件下保藏期限更長(zhǎng),文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2.6菌株NR7的形態(tài)以及16S rRNA分子生物學(xué)鑒定

2.6.1菌落形態(tài)及菌體形態(tài)菌株NR7在MRS瓊脂平板上 37 ℃培養(yǎng)24 h,菌落表面光滑濕潤(rùn),乳白色,100倍油鏡下觀察,呈革蘭氏陽(yáng)性桿狀。菌落形態(tài)和菌體形態(tài)如圖3所示。

圖3　NR7菌落形態(tài)(左)和100倍油鏡(右)Fig.3　NR7 puried colonies morphology(L)and 100 times the oil microscopic examination of the mirror(R)

2.6.2生理生化鑒定菌株NR7的一系列生理生化鑒定結(jié)果如表5所示。

2.6.316S rRNA鑒定結(jié)果圖4表示1%瓊脂糖凝膠對(duì)菌株NR7以通用引物進(jìn)行的PCR擴(kuò)增,獲得了一條特異的、大小約為1500 bp的擴(kuò)增條帶,條帶經(jīng)純化后測(cè)序,獲得1418 bp的片段。將所測(cè)得的16S rRNA基因序列提交到NCBI,通過(guò)Blast工具在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì),選取同源性較高菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖5所示。

圖4　PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.4　PCR amplification lectrophoresis

由以上的系統(tǒng)發(fā)育樹可知,菌株NR7所在最大分支所包含菌株均為乳酸桿菌,菌株的16S rRNA序列與LactobacillusplantarumstrainCIP 103151以及LactobacillusplantarumWCF51的同源性達(dá)98%,因此菌株NR7為植物乳桿菌。

3　結(jié)論

圖5　基于16S rRNA序列的NR7的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5　Systerm phylogenetic tree of NR7 based on 16S rRNA sequence

本實(shí)驗(yàn)選取回族傳統(tǒng)發(fā)酵牛干巴作為乳酸菌篩選源,分離出18株乳酸菌,通過(guò)OPA法測(cè)定其降膽固醇能力,其中有6株菌株的膽固醇清除能力大于15%,為近一步篩選出目的菌株,通過(guò)鹽酸萘乙二胺比色法測(cè)定其降解亞硝酸鹽能力,最終5株菌在24 h降解亞硝酸鹽能力大于94%。菌株要達(dá)到益生的作用,必需能夠耐受pH為3.0的環(huán)境以及0.3%的膽鹽,5株菌的耐酸能力均達(dá)97%以上,但菌株NR7對(duì)0.3%的膽鹽耐受性最強(qiáng)。因此,選擇NR7作為目的菌株,進(jìn)一步研究其生產(chǎn)適應(yīng)性,發(fā)酵4 h使pH迅速降低,在15～40 ℃環(huán)境條件下生長(zhǎng),耐受8%的NaCl和200 mg/kg的NaNO2,且真空冷凍干燥后活菌率93.62%,4 ℃條件下保藏30 d后活菌率可達(dá)89.99%?？梢?菌株NR7滿足發(fā)酵肉制品發(fā)酵劑的條件。16S rRNA分子生物學(xué)鑒定,菌株NR7為植物乳桿菌。

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Isolation and screening of lactic acid bacteria with the ability to remove cholesterol and lower nitrite from cured beef and its fermentation performances

SONG Xiao-juan1,2,HE La-ping1,2,3,*,LI Cui-qin4,ZHU Qiu-jin1,2,FAN Jin1

(1.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Store & Processing of Guizhou Province,Guizhou University,Guiyang 550025,China;3.Guizhou Pork products Research Center of Engineering Technology,Guiyang 550025,China;4.School of Chemistry and Chemical Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

18 strains of lactic acid bacteria were isolated from traditional fermented cured beef.The o-phthalaldehyde method was used to determine the amount of cholesterol,the rate of cholesterol-degrading of strain NR7 was 22.61%.The N-(1-Naphthyl)-ethyl-enediamine dihydrochloride method was used to determine the amount of nitrite,after inoculating 12 h and 24 h,the amount of degeneration of nitrite were 34.177 μg/mL and 95.82 μg/mL,respectively.In the pH3.0 environment,the viable bacteria rate of NR7 was 99.50% and able to tolerate 0.3% bile salts. Therefore,NR7 strain was selected as the target strain,and the production adaptability had to be further researched.After inoculating 4 h,it can produce acid quickly.It can also grow under 15～40 ℃,and be able to tolerate 8% NaCl and 200 mg/kg NaNO2.After the vacuum freeze drying,the rate of survival live was 93.62%. After preserving 30 d at 4 ℃,the survival rate of bacteria was 89.99%.The NR7 strain was identified asLactobacillusplantarumby 16S rRNA sequencing.

cured beef;cholesterol;nitrite;Lactobacillusplantarum;fermentation performance

2015-10-16

宋小娟(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：食品微生物，E-mail:juanxiaosong1029@163.com。

何臘平(1972-)，男，博士,教授，研究方向：發(fā)酵工程/生物催化與生物轉(zhuǎn)化，E-mail:helaping@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31160002)；貴州省豬肉制品工程技術(shù)研究中心項(xiàng)目(黔科合農(nóng)G字[2013]4001號(hào))；貴州省重大專項(xiàng)項(xiàng)目：貴州省豬肉特色制品深加工關(guān)鍵技術(shù)研究及產(chǎn)業(yè)化示范(黔科合作重大專項(xiàng)字[2015]6004號(hào))。

TS201.3

A

1002-0306(2016)09-0159-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.023