菊芋花盤酚類物質提取和體外抗氧化活性研究

王海濤,于　濤

(東北林業(yè)大學鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心,東北油田鹽堿植被恢復與重建教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150040)

?

菊芋花盤酚類物質提取和體外抗氧化活性研究

王海濤,于濤*

(東北林業(yè)大學鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心,東北油田鹽堿植被恢復與重建教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150040)

目的:明確不同的提取劑對菊芋(Helianthustuberosus)花盤中次生代謝物質含量和體外抗氧化活性的影響,并探究花盤中的主要的酚類物質。方法:以菊芋花盤干粉為實驗材料,使用了不同體積分數(shù)的乙醇、甲醇、丙酮等有機溶劑對材料進行提取,測定了總酚、總黃酮含量,并使用FRAP、DPPH、ABTS三種抗氧化方法測定樣品的抗氧化活性。通過超效液相色譜的方法測定菊芋花盤中主要的酚類物質。結果:60%乙醇提取的情況下總酚含量最高,70%丙酮提取的情況下總黃酮含量最高,菊芋花盤的抗氧化活性較強并且液相分析結果表明槲皮素是其最主要酚類物質。結論:不同的提取液對菊芋花盤的次生代謝物提取含量影響顯著,不同的抗氧化方法均表明菊芋花盤有較強的抗氧化活性,槲皮素作為菊芋花盤的主要酚類物質可以進一步開發(fā)利用。

菊芋,花,總酚,總黃酮,抗氧化活性,槲皮素

菊芋(Helianthustuberosus)原產于北美洲,當?shù)氐耐林用窈茉缰熬蛯ζ溥M行了栽培,然后在世界范圍內廣泛傳播種植[1]。菊芋是一種菊科向日葵屬的多年生草本被子植物,莖高1～3 m,開黃色花,葉子為橢圓形,具有葉毛,地下根莖系統(tǒng)發(fā)達,能結出很多塊莖[2-3]。與傳統(tǒng)的農作物相比,菊芋擁有一系列的優(yōu)點:較高的生長率,比較強的抗寒、抗旱能力,可以在比較貧瘠的土壤中生長,并且對害蟲和一些植物類疾病有很強的抵御能力[4]。傳統(tǒng)上,菊芋被當作食物或者動物飼料,而在過去的兩個世紀里,人們開始開發(fā)利用菊芋中的菊粉、低聚果糖和果糖等作為功能性食品的添加劑[5-6]。

生物體氧化過程中可以產生以超氧陰離子為代表的活性氧自由基,許多人類疾病包括早衰、癌癥、心血管疾病、神經衰弱等都與體內過量的自由基有關,使用抗氧化劑來治療這些疾病是有效的應對方法。由于使用合成的藥物有一定的風險[7-8],人們把越來越多的注意力轉向了自然界中天然存在的抗氧化物質,這些物質可以清除各種各樣的自由基,例如DPPH、ABTS、FRAP和一些有氧細胞產生的活性氧[9-10]。許多研究發(fā)現(xiàn)菊芋葉片中總酚、總黃酮的含量很高,并具有良好的抗氧化活性,說明菊芋葉片可以作為一種潛在的天然抗氧化物質[11-12]。菊芋的花盤一般在側枝和主干的末端獨立或者成群分布,被許多小的黃色管狀圓形花圍在中心。目前對菊芋花盤的研究還是空白的,本研究旨在對菊芋花盤的抗氧化物質的提取和測定進行探索,并通過超效液相色譜的方法對花盤中的主要酚類物質種類和含量進行研究和鑒定。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菊芋來自課題組東北林業(yè)大學種植園,在2014年9月中旬花期旺盛時采摘,去除花瓣,65 ℃烘干,粉碎,備用。Folin-Ciocalteus試劑、沒食子酸、蘆丁、ABTS、甲醇Sigma;Trolox、DPPH、TPTZ日本;過硫酸鉀、冰乙酸、FeCl3、NaOAC·3H2O、濃HCl等均為國產分析純。

超效液相色譜系統(tǒng)UPLC-PAD,Waters,USA,ACQUITY UPLC H-Class;液質聯(lián)用儀系統(tǒng)LC-MS,Waters-AB,USA,AB SCIEX QTRAP 5500;色譜柱Waters ACQUITY UPLC? HSS T3 Column(2.1×50 mm,1.8 μm);旋轉蒸發(fā)儀Eppendorf Concentrator Plus;高速萬能粉碎儀泰斯特;恒溫水浴鍋SY21-KP4;電熱鼓風干燥箱賽多利斯101-2AB等。

1.2提取

稱取0.l g菊芋花盤的干粉作為一個樣品,進行不同濃度的甲醇、乙醇、丙酮等提取試劑的比較,每個樣品加入提取試劑2 mL。混合后的樣品在頻率100 kHz、功率120 W、溫度45 ℃的條件下超聲1 h,過夜靜置。離心10 min,取上清轉移至新的離心管中,使用旋轉蒸發(fā)儀45 ℃旋轉蒸發(fā)至干燥,然后向管中加入1 mL甲醇∶水(1∶1)溶液進行溶解,離心30 min,上清轉移至新管備用,每種提取試劑重復3次。

1.3總酚含量的測定

總酚含量的測定使用福林酚試劑法,選取沒食子酸作為標品[13]。吸取50 μL的樣品加入5 mL離心管中,加入450 μL甲醇∶水(1∶1)溶液補齊到0.5 mL,然后加入0.5 mL福林酚試劑,混勻后加入1.5 mL 10%碳酸鈉溶液,把混合液放在75 ℃水浴中反應10 min,760 nm測定吸光光度值?？偡雍恳詍g GAE/g DW表示。

1.4總黃酮含量的測定

標曲的測定,選取蘆丁作為標品[14]。吸取125 μL的樣品加入到5 mL離心管中,然后加入5%亞硝酸鈉溶液搖勻,放置6 min;加入10%硝酸鋁溶液125 μL,放置6 min;加入4%氫氧化鈉溶液1.0 mL,再加入1.125 mL乙醇定容到2.5 mL?？傸S酮含量以mg QE/g DW表示。

1.5FRAP抗氧化實驗

FRAP抗氧化實驗根據(jù)以前的方法報道,選取Trolox作為標品[15]。30 μL的樣品加入到3 mL配制好的FRAP溶液,混合后在黑暗下反應5 min,595 nm測定吸光光度值,每個樣品重復3次。FRAP總還原力以mg TE/g DW表示。

1.6DPPH抗氧化實驗

DPPH抗氧化實驗根據(jù)以前的方法報道,選取Trolox作為標品[16]。30 μL的樣品加入到3 mL配制好的DPPH溶液,混合后在黑暗下反應30 min,517 nm測定吸光光度值,每個樣品重復3次。自由基清除能力以X%來表示,清除率按以下公式計算。

X(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

式中:Ai為30 μL樣品溶液+3 mL DPPH試劑混合液的吸光度;Aj為30 μL樣品溶液+3 mL空白溶劑(無水甲醇)混合液的吸光度;Ac為3 mL DPPH溶液+30 μL空白溶劑混合液的吸光度。

1.7ABTS抗氧化實驗

ABTS抗氧化實驗根據(jù)以前的方法報道,選取Trolox作為標品[17]。30 μL的樣品加入到3 mL配制好的ABTS溶液,混合后在黑暗下反應6 min,734 nm測定吸光光度值,每個樣品重復3次。自由基清除能力以X%來表示,清除率按以下公式計算。

X(%)=[(Ai-Aj)/Ai]×100

試中:Ai為30 μL空白溶劑(無水甲醇)+3 mL混合液的吸光度;Aj為30 μL樣品溶液+3 mL DPPH試劑混合液的吸光度。

1.8使用UPLC和LC-MS技術進行酚的定量分析

選擇60%的乙醇花盤提取物,進行酚類物質的定量分析。選取了14種酚類物質標品,進行LC-MS分析,質譜檢測方式為正離子檢測,掃描方式為多反應檢測。通過樣品與標準品酚類物質的離子對、CE及保留時間等信息的比對來鑒定和測定菊芋花盤的酚類物質種類和含量。

1.9數(shù)據(jù)分析

采用spss13.0統(tǒng)計軟件對不同濃度有機溶劑提取得到的總酚、總黃酮和不同的抗氧化結果分別進行單因素方差分析,結果用平均數(shù)±標準差表示,顯著水平為p<0.05。

2　結果與分析

2.1不同濃度種類有機溶劑提取得到的總酚結果

表1　不同濃度有機溶劑提取得到的總酚含量(mg GAE/g DW)Table 1　The total phenolic content of different concentration solvents extract(mg GAE/g DW)

注:不同大寫字母表示同一有機溶劑不同濃度間差異顯著(p<0.05)。ND代表沒有對相應濃度進行測定,表2～表5同。

表2　不同濃度有機溶劑提取得到的總黃酮含量(mg QE/g DW)Table 2　The total flavonoids content of different concentration solvents extract(mg QE/g DW)

表3　不同濃度有機溶劑提取物的FRAP抗氧化活性(mg TE/g DW)Table 3　The FRAP antioxidant performance of different concentration solvents extract(mg TE/g DW)

表4　不同濃度有機溶劑提取物的DPPH抗氧化活性(%)Table 4　The DPPH antioxidant performance of different concentration solvents extract(%)

乙醇、甲醇和丙酮是次生代謝物質提取過程中常用的有機溶劑,選取了這幾種有機溶劑對樣品進行提取,并探索相應的最佳提取濃度,并且有研究發(fā)現(xiàn)在菊芋葉片總酚提取的過程中發(fā)現(xiàn)在乙酸乙酯提取部位的酚含量最高[18],因此也選擇了乙酸乙酯∶水(1∶1)溶劑進行了提取。由表1可知,當選擇60%的乙醇進行提取時,提取得到的酚類物質含量最高,為5.54 mg GAE/g DW,60%的甲醇、丙酮的提取效果也較好,提取劑濃度較高時提取量顯著降低,可能是因為植物多酚既有水溶性的又有脂溶性的,因此中等濃度的有機溶劑更適合選取。使用甲醇∶乙酸乙酯(1∶1)進行提取時,得到總酚含量較低,為1.71 mg GAE/g DW,說明不適合直接使用乙酸乙酯對菊芋花盤進行提取,而選取別的有機溶劑粗提取后用乙酸乙酯進行萃取的效果有待進一步探索。

2.2不同濃度種類有機溶劑提取得到的總黃酮結果

由表2可知,當選擇70%的丙酮進行提取時,提取得到的黃酮類物質含量最高,為2.95 mg QE/g DW,而乙醇和甲醇的最佳提取濃度分別是40%和60%,分別為2.62 mg QE/g DW和2.16 mg QE/g DW,不過考慮到丙酮的毒性,實際應用中應選擇40%的乙醇。與總酚的提取類似,選取中等濃度的有機溶劑對總黃酮提取效果更好,也與黃酮類物質的溶解性有關,并且有研究發(fā)現(xiàn)使用不同濃度甲醇對菊芋葉片黃酮提取時最佳濃度是70%[12],也進一步證實了這個結論。使用甲醇∶乙酸乙酯(1∶1)進行提取時,提取得到的黃酮類物質含量最低,為0.52 mg QE/g DW。

2.3體外抗氧化實驗結果

為了探究菊芋花盤提取物的體外抗氧化能力,選擇了FRAP、DPPH、ABTS三種方法對提取到的樣品的抗氧化活性進行測定。由表3可知,當選擇70%的丙酮進行提取時,提取物的FRAP抗氧化活性最強,達到3.88 mg TE/g DW,并且這個濃度的丙酮提取得到的黃酮含量也最高,而甲醇和乙醇的最適提取濃度分別是50%和70%,含量分別為3.66 mg TE/g DW和3.59 mg TE/g DW。由表4可知,當選擇60%乙醇進行提取時,提取物的DPPH自由基清除能力最強,清除率達到42.65%,此時總酚類物質含量也最高,相同濃度(40%、60%、80%)的乙醇和甲醇提取物比較,乙醇提取物的DPPH自由基清除能力顯著高于甲醇。由表5可知,當選擇60%丙酮進行提取時,提取物的ABTS自由基清除能力最強,達到91.26%,而甲醇和乙醇最佳的提取濃度分別是50%和60%,分別達到85.79%和81.77%,并且與另外兩種方法相比,同種溶劑不同濃度間的測定結果變化幅度較大,可能此方法更靈敏。3種方法中的乙酸乙酯提取物的抗氧化活性都比較弱,可能與其提取得到的次生代謝物質較少有關。綜合來看中等濃度的甲醇、乙醇和丙酮提取物的體外抗氧化活性比較強,可能與其提取到的總酚和總黃酮含量比較高有關,并且前人已經做了許多研究證實植物的體外抗氧化能力主要是由植物中的次生代謝物決定的[19-21]。隨著人們越來越重視從天然植物中獲取抗氧化物質,改善人類的生活質量,菊芋花盤可以作為這樣的植物材料被開發(fā)利用。

表5　不同濃度有機溶劑提取物的ABTS抗氧化活性(%)Table 5　The ABTS antioxidant performance of different concentration solvents extract(%)

表6　花盤中酚類物質含量Table 6　The phenolic compound content in the Jerusalem artichoke disk

2.4UPLC法測定酚類物質種類和含量

圖1　14種標準酚類物質和菊芋花盤UPLC分離圖譜Fig.1　UPLC chromatogram of the 14 responding standards and Jerusalem artichoke disk 標注:峰1～14分別為沒食子酸、原兒茶酸、 4-羥基苯甲酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、 表兒茶素、水楊酸、東莨菪內酯、3-羥基肉桂酸、 阿魏酸、芥子酸、4-羥基香豆素、槲皮素。

選取了60%乙醇提取條件下的花盤溶液進行超效液相色譜液相分析(圖1)。分別以14種標品不同梯度濃度混合進樣,建立了酚類物質的標準曲線,測得11種酚類物質的含量如表6,阿魏酸、芥子酸和4-羥基香豆素在樣品中未被測出。從圖1B中可以看出菊芋花盤中主要的酚類物質是槲皮素,峰面積遠遠高于其他種類的酚類物質,如表6槲皮素含量為2507.16 μg/g,而鑒定出來的另外10種酚類物質含量都很低,說明槲皮素在菊芋花盤中可能是富集的。

3　結論

選取了甲醇、乙醇和丙酮3種常見的有機溶劑對菊芋花盤中的總酚和總黃酮進行提取并對提取效果進行分析,結果表明:60%乙醇提取到的總酚含量最高,達到5.54 mg GAE/g DW;使用70%的丙酮提取得到的總黃酮含量最高,達到2.95 mg QE/g DW,不過考慮到丙酮的毒性,最好選擇40%的乙醇提取總黃酮。為了探究菊芋花盤提取物的體外抗氧化活性,選擇了FRAP、DPPH、ABTS三種方法進行抗氧化活性研究,結果表明:使用70%丙酮提取時,FRAP抗氧化活性最強,達到3.88 mg TE/g DW;使用60%乙醇,此時DPPH自由基清除能力最強,清除率達到42.65%;使用60%的丙酮得到的提取物ABTS抗氧化活性最強,達到91.26%。使用超效液相色譜技術測定出槲皮素是菊芋花盤的主要酚類物質,含量為2507.16 μg/g,幾乎占到總酚含量的一半。整體來看,菊芋花盤中酚和黃酮含量比較高,抗氧化活性較強,可以作為天然的抗氧化物質,而槲皮素作為花盤中最主要的酚類物質可以進一步開發(fā)利用。

[1]Yang L X,He Q S,Corscadden K,et al.The prospects of Jerusalem artichoke in functional food ingredients and bioenergy production[J].Biotechnology Reports,2015,5:77-88.

[2]Monti A,Amaducci M T,Venturi G.Growth response,leaf gas exchange and fructans accumulation of Jerusalem artichoke(Helianthus tuberosusL.)as affected by different water regimes[J].European Journal of Agronomy,2005,23(2):136-145.

[3]Tassoni A,Bagni N,Ferri M,et al.Helianthus tuberosus and polyamine research:past and recent applications of a classical growth model[J].Plant Physiolgy and Biochemistry,2010,48(7):496-505.

[4]Slimestad R,Seljaasen R,Meijer K,et al.Norwegian-grown Jerusalem artichoke(HelianthustuberosusL.):morphology and content of sugars and fructo-oligosaccharides in stems and tubers[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,2010,90(6):956-964.

[5]Kosaric N,Cosentino G P,Wieczorec A,et al.The Jerusalem artichoke as an agricultural crop[J].Biomass,1984,5(1):1-36.

[6]周東,隋丹,于濤，等.鹽堿土壤對菊芋菊糖含量的影響[J].中國調味品,2014,39(3):5-9.

[7]Viuda-Martos M,López-Marcos M C,Fernández-López J,et al.Role of fibre in cardiovascular diseases:A review[J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety,2010,9(2):240-258.

[8]Zhang W,Li C,You L J,et al.Structural identification of compounds from Toona sinensis leaves with antioxidant and anticancer activities[J].Journal of Functional Foods,2014,10:427-435.

[9]Benavente-García O,Castillo J,Lorente J,et al.Antioxidant activity of phenolics extracted from Olea europaeaL.leaves[J].Food Chemistry,2000,68(4):457-462.

[10]Matés J M,Sánchez-Jiménez F M.Role of reactive oxygen species in apoptosis:Implications for cancer therapy[J].

International Journal of Biochemistry and Cell Biology,2000,32(2):157-170.

[11]劉海偉,劉兆普,劉玲,等.菊芋葉片提取物抑菌活性與化學成分的研究[J].天然產物研究與開發(fā).2007,3:405-409.

[12]鄭曉濤,隆小華,劉玲，等.菊芋葉總黃酮提取工藝優(yōu)化及含量動態(tài)變化[J].天然產物研究與開發(fā),2012,11:1642-1645.

[13]Slinkard K,Singleton V L.Total phenol analysis:automation and comparison with manual methods[J].American Journal Enology and Viticulture,1977,28(1):49-55.

[14]楊明俊,王亮,吳婧，等.菊芋葉黃酮類化合物的體外抗氧化活性研究[J].貴州農業(yè)科學,2011,39(4):52-54.

[15]Benzie I F F,Strain J J.The ferric reducing ability of plasma as a measure of“antioxidant power”the FRAP assay[J]. Analytical Biochemistry,1996,239(1):70-76.

[16]Brand-Williams W,Cuvelier M E,Berset C.Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity[J].LWT-Food Science and Technology,1995,28(1):25-30.

[17]Roberta R,Nicoletta P,Anna P,et al.Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay[J].Free Radical Biology and Medicine,1999,26(9):1231-1237.

[18]Du Y G,Yuan X Y,Gao M Z,et al.Free radical scavenging activities and bioactive substances of Jerusalem

artichoke(Helianthus tuberosusL.)leaves[J].Food chemistry,2012,133(1):10-14.

[19]Amarowicz R,Karamac′ M,Weidner S,et al.Antioxidant activity of wheat caryopses and embryos extracts[J].Journal of Food Lipids,2002,9(3):201-210.

[20]Rathee J S,Hassarajani S A,Chattopadhyay S.Antioxidant activity of Nyctanthes arbor-tristis leaf extract[J].Food Chemistry,2007,103(4):1350-1357.

[21]Wettasinghe M,Shahidi F.Antioxidant and free radical-scavenging properties of ethanolic extracts of defatted borage(BoragoofficinalisL.)seeds[J].Food Chemistry,1999,67(4):399-414.

Study on the phenolic extraction andinvitroantioxidant activity of Jerusalem artichoke disk

WANG Hai-tao,YU Tao*

(Alkali Soil Natural Environmental Science Center,Northeast Forestry University;Key Laboratory of Saline-alkali Vegetation Ecology Restoration in Oil Field,Ministry of Education,Harbin 150040,China)

Objective:To study the effect of different extraction agents of Jerusalem artichoke(Helianthustuberosus)disk in secondary metabolism substance content andinvitroantioxidant activity.Methods:Using the disk powder of Jerusalem artichoke as raw material,the different volume fraction of ethanol,methanol,acetone and other organic solvents were used to extract the samples,the total phenolic and flavonoids content was determined,and three different types of radical scavenging capacities including the FRAP,DPPH and ABTS were chosen to determine theinvitroantioxidant activity of the samples.By ultra performance liquid chromatography(UPLC)method,the main phenolics of disk were studied.Results:The highest phenolic content was measured in 60% ethanol extraction.The highest content of total flavonoids was measured in 70% acetone extraction.The Jerusalem artichoke disk showed a stronginvitroantioxidant activity by all three methods and liquid phase analysis results,which showed that the quercerin was the main phenolic in Jerusalem artichoke disk.Conclusion:The different extract had great effect on the secondary metabolics content of Jerusalem artichoke disk and the antioxidant activity of disk was strong.

Jerusalem artichoke;disk;total phenolics;total flavonoids;antioxidant activity;quercetin

2015-11-02

王海濤(1990-)，男，碩士，研究方向：植物次生代謝和生物活性物質利用，E-mail：949977257@qq.com。

于濤(1969-)，男，學士,工程師，研究方向：植物次生代謝和生物活性物質利用，E-mail:aisingioro@dlou.edu.cn。

國家自然科學基金項目(31470647)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)09-0101-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.012