利用蝦頭內源酶模擬胃腸道消化制備短肽的研究

田　申,李貽杰,曹文紅,3,*,祝亞輝,章超樺,3

(1.廣東海洋大學食品科技學院,廣東湛江 524088;2.廣東省水產品加工與安全重點實驗室,廣東湛江 524088;3.水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室,廣東湛江 524088)

?

利用蝦頭內源酶模擬胃腸道消化制備短肽的研究

田申1,2,李貽杰1,曹文紅1,2,3,*,祝亞輝1,章超樺1,2,3

(1.廣東海洋大學食品科技學院,廣東湛江 524088;2.廣東省水產品加工與安全重點實驗室,廣東湛江 524088;3.水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室,廣東湛江 524088)

本文利用蝦頭內源性蛋白酶構建模擬胃腸道的消化系統,酶解蝦頭蛋白制備短肽。結果表明,在模擬消化過程中,蝦頭蛋白釋放量、水解度和水解產物低于3000 u分子量的組分呈現出兩次顯著增加趨勢,顯示蝦頭內源性類胃蛋白酶和類胰蛋白酶在模擬消化不同階段起到的酶解作用。在模擬胃部消化條件下制備的產物其分子質量集中在2000～3000 u左右;在模擬腸道消化條件下制備的產物其分子量主要集中在1000 u以下。以上結果表明,利用蝦頭內源性蛋白酶模擬胃腸道消化可制備高附加值的短肽產物,實現蝦頭蛋白的高效回收。

凡納濱對蝦,蝦頭,內源酶,模擬消化,短肽

食源性短肽是以食品蛋白為原料,通過酶解或發(fā)酵制得的蛋白水解產品。食源性短肽不僅安全性極高,而且還具有很多生理調節(jié)功能特性[1-2],如參與機體的降血壓[3]、抗氧化[4]、抗血栓[5]、免疫調節(jié)[6]等,是當前食品科技界熱門的研究課題。目前具有特殊生理活性的食源性短肽不斷被發(fā)現并應用于食品配方、功能食品以及食品添加劑等。但其口服后,容易被胃腸道消化系統酶系降解而失去原有的生理活性,這是制約食源性短肽研究開發(fā)與應用的瓶頸問題。有研究表明:食源性蛋白由消化系統酶水解制備的短肽有良好的抗消化酶降解能力[7],并且比相同組成的游離氨基酸更容易被機體吸收[8]。因此目前國內外食品科技界主要采用商業(yè)蛋白酶模擬消化進行制備短肽[9-10]。但使用商品酶制備短肽存在著成本高的問題。

在對蝦加工過程中,占蝦體質量30%～40%的蝦頭常被剔除成為加工廢棄物。對蝦生理結構非常獨特,大部分消化器官集中在蝦頭,因此蝦頭含有豐富的內源性蛋白酶[11]。有研究者從蝦頭中檢測出類胰蛋白酶[12]和類胃蛋白酶[13]兩種主要蛋白酶。利用蝦頭內源性蛋白酶對蝦頭蛋白進行降解,制備成短肽、氨基酸等小分子物質,將能實現蝦頭蛋白質的回收。本課題組前期研究證實紫外輻射能顯著提高蝦頭內源蛋白酶活性[14-15]。本文擬采用紫外輻射的方法充分激活蝦頭內源酶酶活,在此基礎上利用蝦頭內源性蛋白酶對蝦頭蛋白進行模擬消化降解制備短肽,以提高蝦頭蛋白質的利用價值,研究結果對水產品加工廢棄物蛋白質的高值化利用具有重要的參考意義。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

蝦頭:鮮活凡納濱對蝦購于廣東省湛江市東風市場,取蝦頭,分裝放置于-75 ℃冰箱備用。多肽分子質量標準品:N-Hippuryl-His-Leuhydrate(429.47 u)購自于美國Sigma公司,Triosephosphate isomerase(26625 u),Myoglobin(16950 u),α-Lactalbumin(14437 u),Aprotinin(6512 u),Insulin b chain oxidized(MW 3496 u)和Bacitracin(1423 u)購自于美國Biorad公司。其它分析試劑均為國產分析純。

PHS-3C型精密pH計上?？祪x儀器股份有限公司;HH-6型數顯恒溫水浴鍋江蘇金壇市佳美儀器有限公司;CR22G Ⅱ型高速冷凍離心機日本日立有限公司;UV-2550紫外可見分光光度計上海旦鼎國際貿易有限公司;LC-20AD高效液相色譜儀日本島津公司;高效液相凝膠色譜柱Protein-PAK60(WAT085250)美國waters公司;BIFLEX Ⅲ型MALDI-TOF質譜儀美國Bruker Daltonics公司。

1.2實驗方法

1.2.1蝦頭紫外輻射的方法紫外輻射蝦頭促進內源酶活力工藝參考Cao等[15]的方法,并作一定的改進。取適量凡納濱對蝦蝦頭勻漿,平鋪于托盤上(蝦漿厚度小于5 mm),置于紫外燈下輻射激活內源酶(紫外輻射條件為:紫外燈波長253.7 nm、功率30 W,紫外燈高于托盤20 cm,輻射時間為20 min)。

1.2.2蝦頭內源性蛋白酶模擬胃部消化紫外輻射后的蝦漿分裝30 g于廣口瓶中,按固液比1∶3(m∶v)加入4 ℃蒸餾水,震蕩混勻,調節(jié)pH為3,置于50 ℃恒溫水浴中保溫,每10 min震蕩一次,并于0、0.5、1、2、3、4、5 h時間點取樣,檢測酶活。

1.2.3蝦頭內源性蛋白酶模擬腸道消化將凡納濱對蝦蝦頭勻漿,紫外輻射后,分裝30 g于廣口瓶中,固液比1∶3(m∶v)加入4 ℃蒸餾水,震蕩混勻,調節(jié)pH為8.5,置于到55 ℃恒溫水浴中保溫,每10 min震蕩一次,于0、0.5、1、2、3、4、5 h時間點取樣,檢測酶活。

1.2.4利用蝦頭內源酶模擬胃腸道消化模擬胃腸道消化參照John[16]的方法并加以改進。將凡納濱對蝦蝦頭勻漿,紫外輻射后,分裝30 g于廣口瓶中,固液比1∶3(m∶v)加入90 mL 4 ℃蒸餾水,震蕩混勻,調節(jié)pH為3,置于到50 ℃恒溫水浴中保溫,每10 min震蕩一次,根據類胃蛋白酶酶活變化規(guī)律,選擇1.5 h后轉入模擬腸道消化條件,調節(jié)樣品pH為8.5,水浴溫度調整為55 ℃繼續(xù)自降解。于0、0.5、1、1.5、2、3、4、5 h時間點取樣,沸水浴15 min滅酶,冷卻后離心(9000 r/min、4 ℃、20 min),上清液收集于廣口瓶中備用。

1.2.5酶活的檢測方法將每個時間點取的樣品高速離心(9000 r/min、4 ℃、20 min),取上清液即粗酶液,采用福林酚試劑法[17]檢測酶活,平行檢測三次。

1.2.6蛋白含量檢測微量凱氏定氮法[18]。

1.2.7自降解水解度(DH)的檢測采用甲醛滴定法測定酶解前后體系中α-氨基態(tài)氮的含量[19];原料總氮和非蛋白氮含量采用微量凱氏定氮法[18]測定,計算公式[20]如下:

式中:A為原料中總氮量;B為水解液中的氨基氮量;C為原料中游離的氨基氮量;D為原料中的非蛋白氮量。

1.2.8蝦頭模擬消化酶解產物分子質量分布的測定采取高效體積排阻色譜法檢測蝦頭模擬消化酶解產物的分子質量分布。以0.05 mol/L Tris-HCl(pH7.2)緩沖溶液作為流動相,流動相流速為0.7 mL/min,檢測波長為214 nm,柱溫25 ℃。將自降解產物的上清液配制成可溶性蛋白含量為5 mg/mL的溶液,經針頭式濾頭過濾后,上樣20 μL至Waters-Protein-Pak 60柱進行洗脫。利用由蛋白標品建立的分子質量回歸方程考察紫外脅迫下蝦頭自降解產物的分子質量分布?；貧w方程為log M=-0.2448t+6.4433,決定系數為0.99。

1.2.9蝦頭模擬消化酶解產物的肽質譜分析將樣品液與適量的基質溶液混合后,取約1 μL溶液,滴加在樣品靶上,待溶劑揮發(fā),樣品結晶后,送入質譜儀,進行質譜分析:激光波長為337 nm,采用延時引出(Delayed extraction)和反射(Reflection)的工作方式,加速電壓 19.5 kV,反射電壓 20 kV,延時引出電壓14.5～16.5 kV,延時時間為50～200 ns,正離子檢測。累加10～50次單次掃描信號得到肽質譜圖。

1.3數據統計分析

實驗結果用“平均值+標準偏差”表示,重復三次。顯著性采用SPSS20.0軟件統計分析,p<0.05為顯著差異。

2　結果與討論

2.1模擬胃部消化和腸道消化過程中蝦頭內源性蛋白酶酶活變化

由圖1與圖2可得,凡納濱對蝦蝦頭在模擬胃部消化和腸道消化的條件下,內源性蛋白酶均顯示酶活。圖1顯示,在模擬胃部條件消化過程中,類胃蛋白酶酶活在1～2 h內下降較快,因此模擬胃部消化可在較短的時間內進行。圖2顯示,在模擬腸道條件消化過程中,類胰蛋白酶酶活在1～3 h內下降較快,但在3～5 h仍保持400～600 U/g蝦頭的較高酶活。因此利用蝦頭內源性蛋白酶模擬胃腸道消化制備短肽的過程設計為:模擬胃部條件消化1.5 h,隨后轉入模擬腸道條件消化1.5～5 h制備短肽。

圖1　模擬胃部消化過程中蝦頭類胃蛋白酶酶活變化Fig.1　Activity change of pepsin-like protease during the simulated gastro digestion of shrimp head

圖2　模擬腸道消化過程中類胰蛋白酶酶活變化Fig.2　Activity change of trypsin-like protease during the simulated intestinal digestion of shrimp head

2.2利用蝦頭內源蛋白酶模擬消化制備短肽

2.2.1模擬消化過程中蝦頭蛋白質的釋放規(guī)律在內源蛋白酶的催化作用下,蝦頭中的蛋白質被降解,以蛋白質、肽和氨基酸的形式釋放出來。圖3是蝦頭在模擬胃腸道消化過程中在不同時間釋放的蛋白質量。由圖3可以看出蝦頭蛋白釋放量在0～1 h的模擬消化降解中迅速增加,每克蝦頭的蛋白質釋放量達103.4 mg,此時起作用的是以類胃蛋白酶活性為主體的酸性蛋白酶。在消化系統中,胃蛋白酶對蛋白質的專一性較寬,主要將蛋白質水解成分子量較大的肽類產物,供后續(xù)腸道酶系的進一步水解。隨后轉入模擬腸道消化條件,從圖3可以看出1.5～4 h內蝦頭釋放蛋白量仍有明顯上升趨勢,這是因為在模擬腸道消化階段中,蝦頭內源性類胰蛋白酶處于最適條件,酶活力達到最大值,對酸性條件下溶出的蛋白質和肽進行酶解,也繼續(xù)分解殘渣中蛋白。但上升趨勢明顯減緩,這可能是由于蛋白酶具有專一性,此時殘渣中蛋白已經殘留不多,并且內源性類胰蛋白酶酶活已經有所降低。模擬消化進行到4 h后,蝦頭釋放的總蛋白含量增加趨勢趨于平緩,表明酶促降解反應結束。

圖3　模擬消化過程中蝦頭蛋白釋放量的變化Fig.3　Protein released during the simulated digestion of shrimp head

2.2.2模擬消化過程中蝦頭蛋白水解度的變化蛋白質被酶水解時的水解度能體現酶解產物的大致組成,水解度越高,則酶解產物中低分子組分越多。如圖4所示,在模擬消化的0～1 h內,蝦頭內源性類胃蛋白酶酶活處于較高值,此時水解度上升很快,隨后1～1.5 h水解度增加趨勢變緩,原因可能是蝦頭內源性類胃蛋白酶的作用底物變少并且酶活降低導致。隨后調整到模擬腸道消化條件,蝦頭內源性類胰蛋白酶被激活,開始分解蛋白、多肽等,水解度增加速度隨之變大。在模擬腸道消化階段3～5 h內水解度增加趨勢逐漸變緩,這可能是由于內源酶專一性作用底物已經殘余較少,酶活有所降低。利用內源酶模擬胃腸道消化降解蝦頭蛋白制備短肽基本進行完成,水解度達到35.2%,與戴程程等[21]研究南極磷蝦自溶酶解結果接近。

圖4　模擬消化過程中蝦頭蛋白水解度的變化Fig.4　Degree of hydrolysis during the simulated digestion of shrimp head

2.2.3蝦頭模擬消化過程中產物的分子質量分布在利用蝦頭內源蛋白酶模擬胃腸道消化制備短肽的過程中,蝦頭蛋白經歷了內源性類胃蛋白酶以及類胰蛋白酶的先后作用,最終生成肽和氨基酸產物。圖5為蝦頭模擬胃腸道消化過程中產物的高效體積排阻色譜圖。從圖5中可以看出,在0～5 h模擬消化過程中大分子峰明顯減小,小分子峰則逐步增大。低于3000 u以下酶解產物在模擬胃部消化和腸道消化兩個階段均呈現出增加趨勢,說明在兩個階段初期,內源性類胃蛋白酶和類胰蛋白酶分別被激活,分解大分子物質速率快。3～5 h增加趨勢變緩,可能是因為此階段作為底物的大分子蛋白質已被大部分分解,并且蝦頭內源性蛋白酶在長時間處于較高溫度下逐漸失活。模擬消化5 h后3000 u以下組分含量占酶解產物的78.51%(圖6)。與朱國萍等[22]僅在堿性條件下利用自溶酶酶解凡納濱對蝦蝦頭相比,效果較好。

圖5　蝦頭模擬消化過程中酶解產物的高效液相色譜圖Fig.5　HPSEC of the enzymatic hydrolysis products during the simulated digestion of shrimp head

圖6　蝦頭模擬消化過程中3000 U 以下組分在酶解產物中的比例Fig.6　Proportion of the components under 3000 U in the enzymatic hydrolysis products during the simulated digestion of shrimp head

2.2.4蝦頭模擬消化過程中產物的肽質譜分析圖7為蝦頭模擬消化過程中產物的飛行時間質譜。從質譜圖中可以看出,在利用蝦頭內源性蛋白酶模擬胃腸道消化制備短肽的過程中,0～1.5 h是模擬胃部條件自降解階段,模擬消化開始時分子質量0～5000 u范圍內各種肽分布較平均,0～1 h內分子質量2000～4000 u左右肽迅速增加,并且5000 u以上多肽也有所增加,這是由于此過程中殘渣中固體蛋白被內源性類胃蛋白酶分解成水溶性的多肽和氨基酸等,1～1.5 h自降解過程,5000 u以上多肽含量減少,分子量2000～3000 u范圍肽含量增多;1.5～5 h是模擬腸部消化過程,在此模擬消化過程中可以發(fā)現分子質量1000 u左右肽含量增加比較迅速,說明此時內源性類胰蛋白酶被激活,分解多肽,使小分子質量的短肽增加,與此同時分子質量在5000 u的多肽含量有微量增加,這是由于內源性類胰蛋白酶被激活,繼續(xù)分解殘渣蛋白所致。肽質譜圖變化與模擬消化產物分子量分布變化相吻合。

圖7　蝦頭模擬消化酶解產物的飛行時間質譜圖Fig.7　TOF-MS of the enzymatic hydrolysis products during the simulated digestion of shrimp head

3　結論

利用蝦頭內源性蛋白酶可模擬胃腸道對蝦頭蛋白質的消化作用,實現蝦頭蛋白質的高值化回收利用。在模擬胃腸道消化過程中,蝦頭蛋白釋放量、水解度和低于3000 u以下水解產物含量均有兩次增加趨勢。蝦頭蛋白經過模擬消化1.5 h,生成產物大部分分子量集中在2000～3000 u左右,經過模擬消化4～5 h后,3000 u以下組分占酶解產物的比重達78.51%,且多集中在分子質量1000 u左右。利用蝦頭內源酶構建模擬胃腸道消化體系降解蝦頭蛋白制備短肽,進而進一步開發(fā)肽類保健品或營養(yǎng)品,可極大提高蝦頭蛋白質的利用價值。

[1]Aneiros A,Garateix A. Bioactive peptides from marine sources:pharmacological properties and isolation procedures[J]. Journal of Chromatography B,2004,803(1):41-53.

[2]M?ller N P,Scholz-Ahrens K E,Roos N,et al. Bioactive peptides and proteins from foods:indication for health effects [J]. European Journal of Nutrition,2008,47(4):171-182.

[3]Kapel R,Rahhou E,Lecouturier D,et al. Characterization of an antihypertensive peptide from an Alfalfa white protein hydrolysate produced by a continuous enzymatic membrane reactor[J]. Process Biochemistry,2006,41(9):1961-1966.

[4]Je J Y,Qian Z J,Byun H G,et al. Purification and characterization of an antioxidant peptide obtained from tuna backbone protein by enzymatic hydrolysis[J]. Process Biochemistry,2007,42(5):840-846.

[5]Jollès P,Caen J P. Parallels between milk clotting and blood clotting:opportunities for milk-derived products[J]. Trends in Food Science & Technology,1991,2:42-43.

[6]Gauthier S F,Pouliot Y,Saint-Sauveur D. Immunomodulatory peptides obtained by the enzymatic hydrolysis of whey proteins[J].International Dairy Journal,2006,16(11):1315-1323.

[7]Zhang C,Cao W,Hong P,et al. Angiotensin I-converting enzyme inhibitory activity of Acetes chinensis peptic hydrolysate and its antihypertensive effect in spontaneously hypertensive rats[J]. International Journal of Food Science & Technology,2009,44(10):2042-2048.

[8]曹文紅,章超樺. 生物活性肽的吸收機制[J]. 藥物生物技術,2006,13(5):384-388.

[9]宋茹,汪東風,謝超,等. 黃鯽胃蛋白酶酶解液體外抗氧化,抑菌作用研究[J]. 食品科學,2010(3):127-131.

[10]Je J Y,Qian Z J,Byun H G,et al. Purification and characterization of an antioxidant peptide obtained from tuna backbone protein by enzymatic hydrolysis[J]. Process Biochemistry,2007,42(5):840-846.

[11]Meunpol O,Hall M R,Kapoor V. Partial characterisation and distribution of kynurenine aminotransferase activity in the Black Tiger prawn(Penaeus monodon)[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Biochemistry and Molecular Biology,1998,120(1):139-143.

[12]Osnes K K,Mohr V. On the purification and characterization of three anionic,serine-type peptide hydrolases from Antarctic krill,Euphausia superba[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Comparative Biochemistry,1985,82(4):607-619.

[13]莊志凱,杜嵇華,吉宏武,等. 南美白對蝦蝦頭內源酸性蛋白酶的分離純化及其酶學特性研究[J]. 食品工業(yè)科技,2012,33(18):116-120.

[14]章超樺,鄧尚貴,洪鵬志,等.刀額新對蝦的快速自溶技術[J].水產學報,1991,23(4):387-391.

[15]Cao W,Tan C,Zhan X,et al. Ultraviolet irradiation and gradient temperature assisted autolysis for protein recovery from shrimp head waste[J]. Food Chemistry,2014,164:136-141.

[16]Johns P,Cheng L,Dowlati L. Analytical method for the determination of infant formula protein digestibility in vitro:U.S. Patent Application 10/464,052[P]. 2003-6-18.

[17]李建武，余瑞元，袁明秀，等.生物化學實驗原理和方法[M].北京:北京大學出版社,1994

[18]AOAC(1990).Official methods of analysis(16th ed.). Washington,DC:Association of Official Analytical,Chemists.

[19]趙謀明,劉洋,孫為正,等. 草魚抗氧化肽的美拉德反應特性研究[J]. 現代食品科技,2013,29(12):2805-2809.

[20]姚玉靜,崔春,邱禮平,等. pH-stat法和甲醛滴定法測定大豆蛋白水解度準確性比較[J]. 食品工業(yè)科技,2008,29(9):269-270.

[21]戴程程,汪秋寬,任丹丹,等. 南極磷蝦自溶酶解工藝的研究[J]. 食品科技,2012(7):145-149.

[22]朱國萍,曹文紅,章超樺,等. 凡納濱對蝦蝦頭自溶動力學[J]. 水產學報,2010,34(3):395-403.

Preparation for short peptides from shrimp head in a simulated gastrointestinal tract digestion system based on its endogenous enzymes

TIAN Shen1,2,LI Yi-jie1,CAO Wen-hong1,2,3,*,ZHU Ya-hui1,ZHANG Chao-hua1,2,3

(1.College of Food Science and Technology,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China;2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety,Zhanjiang 524088,China;3.Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution,Zhanjiang 524088,China)

Gastrointestinal tract digestion system was simulated,in which endogenous protease from shrimp head was used to obtain short peptides by degrading protein in shrimp head.The results demonstrated that the release amount of shrimp head protein,the degree of hydrolysis and the proportion of the components under 3000 u in the hydrolysate showed all significantly increase twice during the process of simulated digestion,which meant that endogenous pepsin-like protease and trypsin-like protease worked in different stages of simulated digestion process,respectively.In simulated gastric digestion process,the molecular weight of the autolysis in shrimp head mainly focused on 2000～3000 u,and in simulated intestinal digestion process it focused on 1000 u or less.The results suggested that short peptides with high added values can be obtained by using endogenous proteases in shrimp head to simulate gastrointestinal digestion and in this way,proteins in shrimp head can be retrieved efficiently.

Litopenaeus vannamei;shrimp head;endogenous enzymes;simulated digestion;peptides

2015-09-24

田申(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：水產品深加工及貯藏工程，E-mail:tianshen9103@163.com。

曹文紅(1977-)，男，博士，教授，主要從事海洋生物活性物質研究， E-mail:cchunlin@163.com。

國家自然科學基金(41576151)；廣東省自然科學基金(S2013010012459)；廣東海洋大學創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(CXXL2014029)。

TS254.1

A

1002-0306(2016)09-0092-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.010