東紫蘇(Elsholtizabodinieri Vaniot)總黃酮的提取及其抗氧化、免疫活性的研究

毛　媛,呂留莊,劉克武,劉克海，*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306;2.黑龍江省林副特產(chǎn)研究所,黑龍江省非木質(zhì)林產(chǎn)品研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江牡丹江 157011)

?

東紫蘇(ElsholtizabodinieriVaniot)總黃酮的提取及其抗氧化、免疫活性的研究

毛媛1,呂留莊1,劉克武2,劉克海1，*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306;2.黑龍江省林副特產(chǎn)研究所,黑龍江省非木質(zhì)林產(chǎn)品研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江牡丹江 157011)

東紫蘇,總黃酮,抗氧化,免疫

東紫蘇別名鳳尾茶、野山茶、小山茶、小香薷、牙刷草等,是唇形科香薷屬的矮小半灌木狀植物,主產(chǎn)于我國(guó)云南、貴州、甘肅等地[1]。據(jù)報(bào)道,東紫蘇是香薷屬植物中現(xiàn)存的唯一食藥兩用的植物[2]。東紫蘇外形美觀,植株含揮發(fā)油,氣味清香,還含有黃酮類、甾體、萜類、酚類、鞣質(zhì)、氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、多糖、苷類等活性成分,且含有多種有益的微量元素,具有較高的食用、藥用和觀賞價(jià)值[1]。

據(jù)研究表明,東紫蘇中黃酮含量豐富,高達(dá)10%以上,不同產(chǎn)地有所差異[3]。目前對(duì)東紫蘇的研究多集中在揮發(fā)油,但對(duì)其黃酮研究較少,除木犀草素和槲皮素的抑菌活性外,其他活性尚未見(jiàn)報(bào)道。黃酮化合物藥理作用主要包括降血脂、抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等。本文通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)提取了東紫蘇的總黃酮,并首次對(duì)其清除自由基活性、免疫活性進(jìn)行研究,為東紫蘇的開(kāi)發(fā)利用提供了一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

東紫蘇購(gòu)買于云南省文山,常溫避光儲(chǔ)藏;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品純度>96.6%,購(gòu)買于Sigma;魯米諾純度≥97%,Sigma,購(gòu)買于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙醇、甲醇、正丁醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、EDTA、雙氧水、鄰苯三酚、印度墨水等:分析純,購(gòu)買于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

ICR小鼠SPF級(jí),18～20 g,上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,合格證號(hào):2007000577656.動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)前在動(dòng)物房環(huán)境中適應(yīng)一周。

毛細(xì)管100 mm,1.8～2.2 mm,購(gòu)買于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司粉碎機(jī)，F(xiàn)W100型,上海安銳自動(dòng)化儀表有限公司;水浴鍋HH2型,上海比朗儀器制造有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52C型,上海青浦滬西儀器廠;分光光度計(jì)PharmaSpec UV-3600,日本shimadzu公司;酶標(biāo)儀SH-1000型,北京華拓鴻達(dá)科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1東紫蘇總黃酮含量的測(cè)定

1.2.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制東紫蘇中總黃酮含量的測(cè)定方法采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH分光光度法[4]。準(zhǔn)確稱取10 mg干燥的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶中,加無(wú)水乙醇定容,搖勻。分別吸取該溶液0,1,2,3,4,5 mL于25 mL容量瓶中,加入1 mL 5%的NaNO2溶液,搖勻,還原6 min后,加入1 mL 10%的Al(NO)3溶液,搖勻,絡(luò)合6 min后,加入10 mL 4%的NaOH溶液,搖勻,顯色15 min后,用水定容,繼續(xù)靜置15 min,在500 nm處測(cè)定各溶液的吸光度,并以吸光度值(A)作為縱坐標(biāo),溶液濃度(C)作為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出線性方程。

1.2.1.2樣品測(cè)定取0.1 mL提取液,按上述方法,測(cè)定各提取液在500 nm處的吸光度。根據(jù)所得線性方程及稀釋倍數(shù)計(jì)算東紫蘇中總黃酮的含量,計(jì)算公式為:

式中:w-東紫蘇中總黃酮的含量;c-根據(jù)樣品吸光度及標(biāo)品線性方程得出的濃度;a-提取液的稀釋倍數(shù);V-萃取溶劑的體積;m-東紫蘇的質(zhì)量。

1.2.2東紫蘇總黃酮的提取

1.2.2.1提取流程?hào)|紫蘇洗凈→烘干、剪碎→粉碎→稱量→乙醇回流→上清液→蒸干→水復(fù)溶→正丁醇萃取→正丁醇相→蒸干→乙醇溶解→4 ℃保存[4]

1.2.2.2提取工藝優(yōu)化采用1.2.2.1的提取工藝流程,根據(jù)前期單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇提取溫度、回流時(shí)間和料液比3個(gè)因素,采用L9(34)正交表按照表1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3東紫蘇總黃酮抗氧化活性的研究

表1　因素水平表Table 1　Factor and level

1.2.3.2清除雙氧水能力(H2O2)的測(cè)定東紫蘇總黃酮清除雙氧水的能力通過(guò)魯米諾-過(guò)氧化氫化學(xué)發(fā)光體系測(cè)定[6]。配制0.1 mmol/L 的魯米諾碳酸鹽緩沖液(Na2CO3-NaHCO30.05 mol/L,pH=9.4)和0.15 mol/L的H2O2,將樣品溶液用60%乙醇稀釋成50、100、150、200 μg/mL、1 mg/mL。測(cè)量時(shí),樣品組依次加入樣品10 μL、雙氧水10 μL、魯米諾-磷酸鹽緩沖溶液150 μL;對(duì)照組依次加入蒸餾水10 μL、雙氧水10 μL、魯米諾-磷酸鹽緩沖溶液150 μL。在20 ℃下,每隔0.6 s記錄一次發(fā)光強(qiáng)度,連續(xù)記錄30 s。

自由基清除率計(jì)算公式為:

式中:R-自由基清除率,%;Lc-對(duì)照組的發(fā)光強(qiáng)度;Ls-樣品組的發(fā)光強(qiáng)度。

1.2.4東紫蘇總黃酮免疫活性的研究免疫活性通過(guò)碳粒廓清實(shí)驗(yàn)測(cè)定[7-8]。將24 只小鼠隨機(jī)分為4組,每組6只。分別為模型對(duì)照組、黃酮低劑量組(100 mg/kg)、黃酮中劑量組(150 mg/kg)、黃酮高劑量組(200 mg/kg)。每天稱重、灌胃提取液1次,模型對(duì)照組給以生理鹽水(0.2 mL/10 g)。于第14 d給藥1 h后,對(duì)每只小鼠尾靜脈注射用生理鹽水稀釋5倍的印度墨汁(0.1 mL/10 g),待墨汁注入,立即計(jì)時(shí)。2 min(T1)和10 min(T2)后,分別從每只小鼠眼眶取血100 μL,加到4 mL 0.1%的NaHCO3溶液中,在660 nm處測(cè)其吸光度值,計(jì)算碳粒廓清指數(shù)K。然后將小鼠處死,取肝臟、脾臟,用濾紙吸干表面的血液,稱其重量,計(jì)算吞噬指數(shù)α。計(jì)算公式如下:

式中:K-碳粒廓清指數(shù);OD1、OD2-2 min和10 min時(shí)采血的吸光值;T2、T1-兩次采血的時(shí)間差,min。

式中:α-吞噬指數(shù);BW-小鼠的體重,g;LW-小鼠的肝臟重量,g;SW-小鼠的脾臟重量,g。

2　結(jié)果與分析

2.1總黃酮含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

以干燥的蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH分光光度法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖1?；貧w方程為Y=15.400X+0.0128,r=0.9989。標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示,在0.008～0.04 mg/mL的濃度范圍內(nèi),蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的500 nm處的吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系。

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of rutin

2.2總黃酮提取工藝的優(yōu)化

提取溫度、回流時(shí)間和料液比3個(gè)因素正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知,對(duì)東紫蘇總黃酮提取效果的影響因素大小依次為料液比>回流時(shí)間>提取溫度。由表3可知,B、C具有顯著性差異,為影響黃酮提取工藝的主要因素,而A則不具有顯著性意義,為次要因素。

表2　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2　Result of orthogonal experiment

對(duì)主要因素B、C水平選擇,從綜合評(píng)分B3>B2>B1、C2>C1>C3,宜分別選B3、C2;因素A影響較小,為節(jié)約能源,應(yīng)選A1。故確定優(yōu)化條件為A1B3C2,即提取溫度為60 ℃,回流提取為3 h,料液比為1∶20(g/mL)。

表3　方差分析Table 3　Analysis of variance

注:F0.05(2,4)=6.94，F(xiàn)0.01(2,4)=18.00。

2.3東紫蘇總黃酮抗氧化活性

清除率的影響(n=4，x±s)

組別濃度(μg/mL)超氧陰離子清除率(%)對(duì)照組50074.51±1.62樣品1組5026.36±4.46**樣品2組10053.63±5.79**樣品3組15067.25±1.11**樣品4組20073.94±1.83**

注:與對(duì)照組對(duì)照,**p<0.01,差異極顯著;表5同。

2.3.2雙氧水(H2O2)清除能力在堿性條件下,H2O2會(huì)氧化冷發(fā)光劑魯米諾,產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。通過(guò)測(cè)定發(fā)光信號(hào)的變化來(lái)檢驗(yàn)樣品對(duì)H2O2的清除能力[5]。同2.3.1,由發(fā)光強(qiáng)度與樣品濃度的關(guān)系可知東紫蘇總黃酮對(duì)H2O2的清除率,由表5可知,東紫蘇總黃酮的濃度越高,對(duì)H2O2的清除率越大,并且在50～200 μg/mL的濃度范圍內(nèi),清除率為48.56%～77.39%,半抑制濃度IC50為 50.59 μg/mL,表明東紫蘇總黃酮對(duì)H2O2具有較高的清除作用。

表5　東紫蘇總黃酮對(duì)雙氧水(H2O2) 清除率的影響(n=4,x±s)Table 5　Effect of flavonoids from EBV on H2O2(n=4,x±s)

2.4東紫蘇總黃酮免疫活性

碳粒廓清實(shí)驗(yàn)是通過(guò)測(cè)定血液中碳粒的消失速度來(lái)反映單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞食異物的能力,碳粒廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α越大,表明其體內(nèi)免疫作用越強(qiáng)[8]。由表6可知,相對(duì)于對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組的K值和α值都有提高,并且高劑量組呈現(xiàn)了極顯著性差異(p<0.01),說(shuō)明東紫蘇黃酮可以明顯增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能,具有促進(jìn)小鼠免疫功能的作用。有研究表明:減少過(guò)氧化脂質(zhì)LPO損傷,可提高機(jī)體的免疫作用[9]。因此,推測(cè)東紫蘇總黃酮的免疫功能與其具有良好的抗氧化活性和清除自由基能力,從而降低LPO損傷免疫細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[10]。但其確切的作用機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

表6　東紫蘇總黃酮對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞 吞噬功能的影響Table 6　Effect of flavonoids from EBV on carbon clearance test of ±s)

注:與模型組對(duì)照,*p<0.05,**p<0.01。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)篩選了回流提取東紫蘇總

黃酮的最佳工藝條件:料液比1∶20(g/mL)、溫度60 ℃、時(shí)間3 h,且料液比對(duì)提取效果的影響最大,其次為時(shí)間,溫度對(duì)其影響較小。此外,東紫蘇總黃酮的含量豐富,并且對(duì)超氧陰離子自由基和雙氧水的清除效果明顯,IC50分別為108.07 μg/mL和50.59 μg/mL,表明東紫蘇總黃酮具有良好的抗氧化作用,是一種天然抗氧化劑。通過(guò)小鼠體內(nèi)碳粒廓清實(shí)驗(yàn),表明東紫蘇總黃酮可增強(qiáng)小鼠體液免疫,對(duì)小鼠體質(zhì)有一定的改善作用。本實(shí)驗(yàn)對(duì)東紫蘇的進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù),今后有必要對(duì)東紫蘇黃酮的具體成分,以及與活性相關(guān)的成分進(jìn)行深入研究。

[1]云南省植物研究所.云南植物志[M].北京:科學(xué)出版社,1997,1:731.

[2]Gong MX,Zhou GP.Textual reserch of Elsholtzia plants.Beijing Tradit Chin MedPress,1996.

[3]陳海云,高言明.分光光度法對(duì)鳳尾茶中總黃酮的含量分析[J].微量元素與健康研究,2006,23(6):18-19.

[4]庫(kù)詠峰.肉桂總黃酮提取分離分析及抗氧化活性研究[D].廣西:廣西大學(xué),2012.

[5]郭曉青,陳曉靚,楊春梅,等.紫蘇葉活性成分及抗氧化性研究[J].食品與機(jī)械,2014,30(4):179-185.

[6]李書藝,周瑋婧,孫智達(dá),等.荔枝皮原花青素的體外抗氧化活性和對(duì)DNA損傷的保護(hù)作用[J].食品科學(xué),2010,31(1):14-18.

[7]王欽博.桑黃抗氧化活性成分的篩選及其分離純化[D].上海:上海師范大學(xué),2011.

[8]George A,Chinnappan S,Choudhary Y,et al. Immunomodulatory activity of an aqueous extract of Polugonum minus Huds on Swiss albino mice using carbon clearance assay[J].Asian Pacific Journal of Tropical Disease,2014,4(5):398-400.

[9]羅千古,周玖瑤,李毓祺,等.黃芪丹參提取液對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的影響[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2011,8(2):23-24.

[10]儲(chǔ)岳峰.九種中藥成分的免疫增強(qiáng)活性及其作用機(jī)理研究[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2003.

Extraction and its antioxidant,immune activities of total flavonoids fromElsholtziabodinieriVaniot

MAO Yuan1,LV Liu-zhuang1,LIU Ke-wu2,LIU Ke-hai1，*

(1.College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China;2.Heilongjiang Forest By-Product and Speciality Research Institute,Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Non-wood Forest Product Development,Mudanjiang 157011,China)

ElsholtizabodinieriVaniot;flavonoids;antioxidant activity;immune activity

2015-11-05

毛媛(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)與工程,E-mail:13262975153@163.com。

劉克海(1977-)，男，博士，副教授，研究方向：中藥新制劑,E-mail：khliu@shou.edu.cn。

上海市教育委員會(huì)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(J50704)；黑龍江省森林工業(yè)總局攻關(guān)項(xiàng)目(sgzjY201402)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)09-0085-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.008