肌動蛋白在不同襯底上的組裝

張學強胡修源雷豪志汪 穎胡 鈞張 益（中國科學院上海應用物理研究所 嘉定園區(qū) 上海 0800）（中國科學院大學 北京 00049）

肌動蛋白在不同襯底上的組裝

張學強1，2胡修源1，2雷豪志1，2汪 穎1胡 鈞1張 益11
（中國科學院上海應用物理研究所 嘉定園區(qū) 上海 201800）2
（中國科學院大學 北京 100049）

采用兔骨骼肌Actin作為研究對象，通過搭建原子力顯微鏡（Atomic force microscope， AFM）液相實時進樣裝置觀察并對比G-actin在不同襯底上的組裝過程。實驗中發(fā)現(xiàn)，Actin在云母襯底上組裝時形成較少的成核位點，然后組裝成長達幾十微米的纖維；而在帶有正電荷的磷脂膜（DPPC：DPTAP=4：1）襯底上則快速大量地成核，組裝形成較短的纖維。成像時所用的機械力應≤ 50 pN，所用的襯底應帶有一定的正電荷。研究結(jié)果為構(gòu)建Actin軌道上的納米分子馬達運輸系統(tǒng)提供了依據(jù)。

原子力顯微鏡，肌動蛋白，自組裝，分子馬達

原子力顯微鏡（Atomic-force microscope， AFM）是由Binnig等［21］于1986年發(fā)明的高分辨顯微鏡，與傳統(tǒng)的電子顯微鏡相比，其主要優(yōu)點是可以在常溫、液體環(huán)境下實現(xiàn)樣品的高分辨成像，橫向分辨率可達原子級，尤其適用于需要保持活性的生物樣品的溶液狀態(tài)下成像［22-23］。利用 AFM的液相原位成像技術(shù)，研究者們觀察了眾多存在于緩沖溶液當中并且具有生物學活性狀態(tài)時的生物樣品的結(jié)構(gòu)，如細胞［24-25］、DNA［26-27］、生物膜及相關蛋白［28-29］、多肽［30-31］以及Actin［4，32-33］等，為理解生物體的結(jié)構(gòu)與功能的關系作出了重要貢獻。

在細胞內(nèi)，F(xiàn)-actin作為負責囊泡輸運的蛋白質(zhì)分子馬達肌球蛋白（Myosin）的運動軌道，承擔著重要的生物學功能。而近年來的研究表明，F(xiàn)-actinmyosin體系可以被用來設計和構(gòu)建具有特定功能的人工集成納米生物機器［34］，在物質(zhì)的微觀輸運方面有巨大的應用潛力。由于人工納米生物機器需要在不同的基底上運行，因此，研究Actin在不同基底的組裝行為，將為構(gòu)建人工集成納米生物機器打下基礎。本文使用AFM在液相下實時原位成像的技術(shù)，觀察了體外條件下由G-actin自組裝形成纖維F-actin的過程，并對比了不同基底上G-actin的組裝情況，分析了不同組裝表現(xiàn)的可能原因，提出了G-actin在不同固液界面處可能的內(nèi)在組裝機理。

1　材料與方法

1.1材料

AFM 實驗所用的探針型號為 BL-AC40TS-C2 （BioLever mini， Olympus），針尖懸臂梁的名義彈性常數(shù)為～0.09 N/m，液相中的共振頻率為～25 kHz。云母（KAl2（Si3AlO10）（OH）2）購自四川美豐云母工業(yè)有限責任公司。磷脂膜 DPPC （1，2-dipalmitoyl-snglycero-3-phosphocholine）和DPTAP （1，2- dipalmitoyl-3-trimethylammonium-propane）購買自Avanti Lipids Polar， Inc.，制備方法同文獻［35］。APTES （（3-aminopropyl）triethoxysilane）修飾的云母的制備方法見文獻［36］。Muscle Actin，純度＞99%，購買自美國Cytoskeleton公司。Tris堿、ATP（腺苷-5′-三磷酸 二鈉鹽 水合物），均為生物純，購買自美國Sigma公司。HCl、CaCl2、MgCl2、KCl，均為化學純，購買自中國國藥集團化學試劑有限公司。

1.2方法

使用配備Nanoscope IIIa控制器、Multimode頭部的AFM進行Actin組裝研究。使用Liquid cell裝置進行體外液相實時加樣聚合，并選用 Tapping mode in fluid模式進行成像和顯微操縱。實驗中，通過調(diào)解Setpoint和Drive Amplitude產(chǎn)生所需要施加的不同大小的力。

取1 mg兔骨骼肌肌肉G-actin粉末（Cytoskeleton， Inc.）溶于濃度5 mmol/L ，pH=8.0的Tris-HCl、0.2 mmol/L CaCl2和0.2 mmol/L ATP組成的緩沖液中，冰上孵育60 min， 溫度4 ℃條件下14 000 r/min離心15 min以除去可能聚集的肌動蛋白，取上清中的游離活化的 G-actin進行實時體外聚合實驗，［G-actin］=400 μg/mL。聚合時，取適量的游離G-actin加入2 mmol/L MgCl2和50 mmol/L的KCl室溫下聚合約 1 h即可得到 F-actin。制備好的 F-actin經(jīng)Oregon Green? 488 Phalloidin （Life technologies）染色 20 min，聚合緩沖液沖洗 3次，通過Fluoromount?（Sigma）膠將F-actin樣品固定在載玻片和蓋玻片之間，過夜放置固定后置于LeicaSP8激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察。

2　結(jié)果與討論

2.1肌動蛋白的形態(tài)表征

鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）可特異性地與 F-actin結(jié)合，而不與G-actin結(jié)合［37］。由此通過給Phalloidin連上不同的染色分子，我們就可以利用熒光顯微鏡觀察到形成的F-actin纖維。在實驗中，我們使用染色分子 Oregon Green 488連接的 Phalloidin（Life technologies）來標記F-actin，然后利用激光共聚焦光學顯微鏡對所制備的樣品進行了表征。圖1（a）為激光共聚焦熒光圖像，可以很清楚地觀察到纖維狀的F-actin已經(jīng)形成。但限于光學顯微鏡的分辨率，我們并不能分辨出單根的F-actin纖維。圖1（b）為使用原子力顯微鏡的Tapping in Fluid觀察到的組裝好的F-actin在APTES-Mica上面的圖像，可以清楚地看到單根的F-actin纖維，并測得了單根F-actin的高度在（5±1） nm，纖維長度可達幾十微米，考慮到在成像過程中，原子力顯微鏡的針尖會對樣品施加一定大小的相互作用力，進而造成樣品有輕微的形變，因此測得的高度值略小于理論值，如圖1（d）所示。

2.2原子力顯微鏡下肌動蛋白在云母/水界面的實時組裝過程

為了進一步了解G-actin的組裝過程，我們搭建了AFM的液相實時進樣裝置，如圖2所示。通過連續(xù)進樣蠕動泵推動微量注射器緩慢地將聚合緩沖液注入到充滿G-actin單體的AFM液池中，從而可以讓G-actin較為緩慢地發(fā)生自組裝形成F-actin，便于實驗的觀察。

G-actin的體外自組裝需要滿足兩個條件，一是需要加入聚合緩沖液，二是單體的濃度要達到最低臨界濃度［38］。聚合緩沖液通常由MgCl2、KCl、ATP組成，最低臨界濃度隨溫度、緩沖液濃度而變化，本實驗條件下G-actin的臨界濃度約為30 μg/mL，實驗中所采用的單體的濃度［G-actin］=40 μg/mL，略高于臨界濃度，以保證單體能夠順利地組裝形成F-actin纖維。在加入聚合緩沖液的同時，通過AFM在原位進行連續(xù)的掃描成像，從而記錄下組裝過程中發(fā)生的變化，得到的一組圖像如圖3所示。

云母基底在水溶液中由于表面的鉀離子脫離進入到體相溶液中，從而造成云母的表面帶有一定的負電性。同時由于G-actin在單體緩沖溶液中帶有一定的負電性，所以云母表面只有較少的 G-actin單體，如圖3（a）所示。當加入聚合緩沖液后，溶液中含有了Mg2+，它可以中和云母和G-actin的負電性，在云母表面形成較多的 G-actin聚集體，如圖 3（b）所示。隨著云母表面的 G-actin越來越多，G-actin單體之間相互碰撞，形成一些三聚體，這一步成為肌動蛋白組裝的成核過程，成核過程由于能壘較高，是肌動蛋白組裝的限速步驟［39］。成核之后，溶液中的G-actin單體會快速地沿著所成的核自組裝，形成較長的F-actin纖維，這一步也稱為肌動蛋白組裝的延長過程。延長過程所需的能量較低，能夠以很快的速度發(fā)生，最終形成長達幾十微米的F-actin，如圖3（c）～（f）所示。

實驗中同時發(fā)現(xiàn)，肌動蛋白對AFM成像時針尖所施加到樣品上的作用力的大小反應極為敏感，只有當所施加的力≤50 pN時才能保證組裝形成的F-actin的結(jié)構(gòu)不被施加的力所破壞。

2.3原子力顯微鏡下肌動蛋白在生物膜襯底上的自組裝

肌動蛋白在非肌細胞中主要分布在細胞膜的內(nèi)表面形成內(nèi)皮層，起到維持細胞形態(tài)、信號轉(zhuǎn)導、細胞變形等作用［15］。為了更真實地模擬細胞中肌動蛋白所處的微環(huán)境，我們進一步地研究了肌動蛋白在磷脂膜上的組裝行為。

圖4記錄了G-actin在帶有部分正電荷的磷脂膜上的組裝過程。與在云母基底上的組裝行為相似，G-actin首先組裝形成較短的寡聚體，然后快速地組裝形成較長的F-actin纖維。不同的是，在帶正電荷的磷脂膜上組裝形成的 F-actin長度較短，由單體G-actin組裝形成F-actin纖維的時間也較短，這可能是由于磷脂膜所帶的正電荷能夠極大地促進G-actin組裝的成核過程，從而能夠在較短的時間內(nèi)形成大量的成核位點；由于大量快速地成核以及后續(xù)的F-actin的生產(chǎn)阻擋了其它F-actin在基底上的延伸，因此只能形成較短的F-actin纖維。需要指出的是，G-actin在帶正電荷的磷脂膜上的組裝不需要添加聚合緩沖溶液［35］，可能的原因是磷脂膜上的正電荷屏蔽了G-actin單體所帶的負電荷，并提高了磷脂膜表面的G-actin單體的局部濃度，從而使其更容易地發(fā)生自組裝行為形成大量的F-actin纖維。

3　結(jié)論

利用激光共聚焦顯微鏡和AFM對體外組裝的肌動蛋白纖維進行了形貌表征和實時組裝過程的探究，通過實驗發(fā)現(xiàn)，肌動蛋白在云母襯底上組裝時形成較少的成核位點，然后組裝成長達幾十微米的纖維；而在帶有正電荷的磷脂膜襯底上則快速大量地成核，組裝形成較短的纖維。成像時所用的機械力應≤ 50 pN，所用的襯底應帶有一定的正電荷。本實驗的研究為進一步通過原子力顯微鏡構(gòu)建基于肌動蛋白的分子馬達軌道［40-41］及納米生物運輸系統(tǒng)［42］打下了基礎。

致謝 感謝劉知曉博士提供的 F-actin染色標記方面的幫助，感謝王少朋博士在激光共聚焦顯微成像工作上的支持。

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Study on the actin assembly on different substrates

ZHANG Xueqiang1，2HU Xiuyuan1，2LEI Haozhi1，2WANG Ying1HU Jun1ZHANG Yi11
(Shanghai Institute of Applied Physics, Chinese Academy of Sciences, Jiading Campus, Shanghai 201800, China)2
(University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

The assembly processes of actin on mica substrate and lipid membrane by real time imaging of atomic force microscope （AFM） and laser scanning confocal microscope were studied. It was found that on the bare mica substrate， the small amount of G-actin nucleating points formed and subsequently self-assembled into long actin filaments with lengths up to tens of micro-meters. While on the positively-charged lipid membrane （DPPC: DPTAP = 4:1）， large amounts of nucleating points quickly formed， leading to the formation of relatively shorter filaments. The proposed optimum condition for exploring actin assembly process with AFM in vitro is positively-charged substrates should be used while the AFM imaging force should be lower than 50 pN. These results laid foundation for construction of micro- and nano-scale transport systems based on actin.

Atomic force microscope （AFM）， Actin， Self-assembly， Molecular motor

CLC Q689

肌動蛋白（Actin）是一種廣泛存在于所有真核細胞中的高度保守的蛋白分子［1-2］，也是細胞蛋白中含量最為豐富的分子之一。在肌細胞中，肌動蛋白約達到細胞蛋白總量的10%；即使是在非肌細胞中，也占到了細胞蛋白總量的1%～5%［3］。肌動蛋白的存在形式有兩種：球形肌動蛋白（G-actin）和纖維肌動蛋白（F-actin）［4］。G-actin是游離的肌動蛋白單體，分子量為43 kD，經(jīng)X-射線衍射結(jié)果推算其理論大小約為3.5 nm×5.5 nm×5.5 nm［5］，由單根肽鏈折疊而成，結(jié)構(gòu)的內(nèi)部含有一條狹縫，可結(jié)合核苷酸和二價陽離子［6-7］。在合適的條件下，G-actin可發(fā)生自組裝形成F-actin。F-actin是直徑約為7 nm的類似雙螺旋狀結(jié)構(gòu)［8］，螺距約為 36 nm，結(jié)構(gòu)上具有不對稱性，可分為正極、負極兩端。F-actin的正極端的組裝速度大于去組裝的速度，而負極端的組裝速度小于去組裝的速度，兩者在某一蛋白濃度達到平衡，纖維的長度就保持恒定，這一現(xiàn)象稱為“踏車效應”［9-11］。F-actin也可在一定的條件下發(fā)生去組裝重新生成 G-actin。細胞中的肌動蛋白通過水解ATP將生物體內(nèi)的化學能轉(zhuǎn)化為機械能，進而使細胞能夠進行諸如遷移［9， 12-14］、胞質(zhì)環(huán)流［15］、分裂［16］、物質(zhì)運輸［17］、細胞黏附［18］、形成絲狀偽足［19-20］和片狀偽足［17］等功能，對生物體機能的正常運作起著至關重要的作用。

ZHANG Xueqiang （male） was born in October 1990 and graduated from Inner Mongolia University in 2011. Now he is a doctoral candidate in inorganic chemistry at Shanghai Institute of Applied Physics， CAS， E-mail: zhangxueqiang@sinap.ac.cn

21 March 2016； Accepted 16 April 2016

ZHANG Yi， professor， E-mail: zhangyi@sinap.ac.cn

Q689

10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.040701

國家重點基礎研究發(fā)展計劃（2013CB932801）、國家自然科學基金（11274334）、中國科學院（KJZD-EW-M03）項目資助第一作者：張學強，男，1990年10月出生，2011年畢業(yè)于內(nèi)蒙古大學，目前在中國科學院上海應用物理研究所攻讀博士學位，無機化學專業(yè)，E-mail: zhangxueqiang@sinap.ac.cn

張益，研究員，E-mail: zhangyi@sinap.ac.cn

初稿2016-03-21；修回2016-04-16

Supported by the National Basic Research Program of China （grant No. 2013CB932801）， the National Natural Science Foundation of China （grant No. 11274334）， and the Chinese Academy of Sciences （grant No. KJZD-EW-M03）