反相HPLC法同時測定大麻植物中的三種有效成分

傅　強，舒　智，鄧　軻，羅　璇，曾昌廣（.德陽市公安局刑警支隊，四川 德陽 68000；.臨滄市公安局，云南 臨滄 677000）

反相HPLC法同時測定大麻植物中的三種有效成分

傅強1，舒智2，鄧軻1，羅璇1，曾昌廣1
（1.德陽市公安局刑警支隊，四川 德陽 618000；2.臨滄市公安局，云南 臨滄 677000）

目的 建立同時測定大麻植物中四氫大麻酚（tetrahydrocannabinol，THC）、大麻二酚（cannabidiol，CBD）和大麻酚（cannabinol，CBN）三種有效成分的高效液相色譜（HPLC）法。 方法 采用通用C18色譜柱，以乙腈-磷酸鹽緩沖液（0.015mol/L KH2PO4）為流動相，流速為1.0mL/min，檢測波長為220nm，同時收集波長190～400nm的紫外光譜圖，并以此光譜圖及保留時間作為定性依據(jù)。結(jié)果 所建方法能良好地分離THC、CBD和CBN，三種成分在0.4～40μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2≥0.9993），回收率大于87%，最低檢出限分別為1.8、2.0和1.3ng，日內(nèi)精密度與日間精密度均小于5%。結(jié)論 反相HPLC法簡便、快速、準(zhǔn)確，適用于大麻植物中THC、CBD和CBN的定性定量檢測。

法醫(yī)毒理學(xué)；高效液相色譜；大麻屬；四氫大麻酚；大麻二酚；大麻酚

大麻植物（Cannabis sativa L.）中所含化學(xué)成分十分復(fù)雜，現(xiàn)在能從大麻植物中提煉和鑒別出的化合物已經(jīng)有400多種，其中最主要的活性成分是四氫大麻酚（tetrahydrocannabinol，THC）、大麻二酚（cannabidiol，CBD）和大麻酚（cannabinol，CBN）。其中，THC具有強烈的致幻作用，是造成大麻具有精神活性的“元兇”。根據(jù)其THC含量的高低，大麻植物可分為毒品大麻和工業(yè)大麻兩類［1］。毒品大麻因THC含量高，被一部分人當(dāng)毒品利用，大麻與海洛因、可卡因被稱為全球三大傳統(tǒng)毒品。2003年1月，云南省公安廳制定了《云南省工業(yè)用大麻管理暫行規(guī)定》，規(guī)定THC含量小于0.3%的大麻品種為允許種植的工業(yè)大麻。工業(yè)大麻不具備毒品利用價值，是經(jīng)典的生產(chǎn)資料，廣泛應(yīng)用于紡織、造紙、食品、醫(yī)藥、衛(wèi)生、日化、皮革、汽車、建筑、裝飾、包裝等領(lǐng)域。因此，有必要建立大麻植物中THC、CBD和CBN的定性定量分析方法，其中對THC的準(zhǔn)確定量尤為重要。目前，國內(nèi)外關(guān)于THC、CBD與CBN的檢測方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）、氣相色譜-火焰離子化檢測器（GC-FID）、高效液相色譜（HPLC）法等［2-4］。本研究采用通用型C18反相柱和DAD檢測器，擬建立較為簡便、快速、準(zhǔn)確地測定大麻植物中THC、CBD與CBN的反相HPLC方法。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

儀器：Agilent 1100高效液相色譜檢測儀（包括G1311A四元泵、G1315B-DAD陣列二極管檢測器、HP色譜工作站，美國安捷倫公司），Millipore超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

藥品與試劑：甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）均購自美國Fisher公司，超純水（電阻＞18MΩ）由Millipore超純水系統(tǒng)制得，THC、CBD和CBN對照品（1.0mg/mL，0.3 mL/支）均購于北京芬格爾安科技有限責(zé)任公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2色譜條件

色譜柱為 Agilent ZORBAX SB-C18柱（150× 4.6mm，5μm，美國安捷倫公司），流動相為V（乙腈）∶V（KH2PO4緩沖液）=75∶25，流速為1.0mL/min，柱溫為25℃，檢測波長為220nm，同時收集190～400nm全光譜，進(jìn)樣量為10μL。

1.3標(biāo)準(zhǔn)品、緩沖溶液及樣品配制

標(biāo)準(zhǔn)品制備：精密吸取THC、CBD和CBN對照品（1.0mg/mL）200μL于2mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，混勻，制成質(zhì)量濃度均為0.1 mg/mL的儲備液，4℃冰箱備用。

磷酸鹽緩沖液制備：準(zhǔn)確稱取KH2PO41.020g于500mL容量瓶，用超純水定容至刻度線并混勻，即得0.015mol/L KH2PO4溶液，然后用磷酸調(diào)節(jié)pH值至4.0。

樣品制備：將大麻樣品研磨呈粉末狀，精密稱取200mg，共3份，加入8mL V（環(huán)己烷）∶V（乙酸乙酯）= 9∶1，超聲10 min，浸泡30 min后，離心取上清液于10 mL棕色容量瓶中，加V（環(huán)己烷）∶V（乙酸乙酯）= 9∶1溶液定容至10mL，搖勻，備用。

2　結(jié)果與討論

2.1檢測波長的選擇

THC與CBD的紫外光譜圖相似，吸收峰位于209nm附近，CBN有兩個吸收峰分別位于220、285nm處（圖1）。由于209nm處于吸收末端，干擾較大，為了兼顧檢測靈敏度及色譜圖基線，本實驗選擇了CBN的吸收峰220nm為檢測波長。實驗證實220nm為檢測波長時，三者靈敏度佳，基線平穩(wěn)，故本實驗選擇220nm為檢測波長。

2.2流動相優(yōu)化試驗

以乙腈-KH2PO4緩沖液作為流動相，考察不同濃度（0.015、0.02、0.03mmol/L）和不同 pH值（3.0、4.0、5.0）的緩沖液對THC、CBD及CBN測定的影響。在選定范圍內(nèi)不同濃度及pH值的緩沖液鹽對THC、CBD 及CBN的對稱因子、分離度均無明顯影響。于是本研究選定緩沖液為0.015mmol/L KH2PO4溶液，用磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至4.0。

考察V（乙腈）∶V（磷酸鹽緩沖液）不同體積比（80∶20、75∶25、70∶30）對目標(biāo)物測定的影響。當(dāng)流動相為 V（乙腈）∶V（磷酸鹽緩沖液）=75∶25，流速為1.0mL/min時，THC、CBD、CBN三者保留時間適宜，分離度達(dá)1.5，且15 min內(nèi)可以完成單個樣品的測定（圖2）。故最后選定V（乙腈）∶V（磷酸鹽緩沖液）= 75∶25作為分析流動相。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

用磷酸鹽緩沖液稀釋THC、CBD和CBN儲備液，配成質(zhì)量濃度分別為0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、10.0、16.0、28.0、40.0μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液10μL進(jìn)樣，記錄相應(yīng)的峰面積，并對色譜峰面積（y）及質(zhì)量濃度（x）（μg/mL）進(jìn)行線性回歸，分別得THC的回歸方程為：y=45.202 x+7.193，R2=0.999 8，檢測限為1.8 ng（S/N≥3）；CBD的回歸方程為y=47.562 x+22.256，R2=0.999 5，檢測限為2.0 ng （S/N≥3）；CBN的回歸方程為：y=46.826 x+25.351，R2=0.9993，檢測限為1.3ng（S/N≥3）。將標(biāo)準(zhǔn)曲線最低質(zhì)量濃度0.4 μg/mL稀釋10倍后分析，以信噪比（S/N≥3）計算檢出限。

2.4日內(nèi)、日間精密度

取高、中、低三種濃度的THC、CBD和CBN按上述色譜條件分別于1d內(nèi)測定6次，連續(xù)測定6d，測得峰面積，日內(nèi)和日間精密度結(jié)果見表1。

表1　THC、CBD和CBN測定的精密度（n=6）

2.5回收率實驗

分別加入高、中、低三個質(zhì)量濃度的THC、CBD 和CBN標(biāo)準(zhǔn)品溶液（各6份）于空白樹葉樣品（空白對照）中，用本實驗方法進(jìn)行測定，求得THC、CBD和CBN三種質(zhì)量濃度的平均回收率，結(jié)果見表2。

2.6實際應(yīng)用

云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所為培育工業(yè)大麻，送檢其培育的編號1～9號的大麻植物干燥葉樣品進(jìn)行THC含量分析。將送檢大麻葉樣品用本研究建立的方法處理后進(jìn)樣測定，結(jié)果送檢9份大麻葉樣品均檢出THC、CBD和CBN，其中THC的含量見表3。編號2、3、4、5、7、9樣品的THC含量小于0.3%為工業(yè)大麻。

表2　THC、CBD和CBN提取回收率（n=6，μg/mL）

表3　大麻葉樣品的THC含量

3　結(jié)論

本實驗采用反相HPLC法測定大麻中THC、CBD 和CBN的含量，適用于同時分析大麻植物中THC、CBD和CBN。

［1］王繼芬.大麻毒品濫用與檢驗［M］.北京：中國人民公安大學(xué)出版社，2009.

［2］Gambaro V，Dell’Acqua L，F(xiàn)arè F，et al.Determination of primary active constituents in Cannabis preparationsbyhigh-resolutiongaschromatography/flame ionization detection and high-performance liquid chromatography/UV detection［J］.Analytica Chimica Acta，2002，468（2）：245-254.

［3］牛勇，盧延旭，劉媛.大麻毒品的檢驗方法綜述［J］.刑事技術(shù)，2004，（6）：21-23.

［4］張崗，郭江寧，畢開順.高效液相色譜法測定火麻仁油中Δ9-四氫大麻酚的含量［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2003，20（4）：269-271.

（本文編輯：嚴(yán)慧）

Simultaneous Determination of Three Kinds of Effective Constituents in Cannabis Plants by Reversed-phase HPLC

FU Qiang1，SHU Zhi2，DENG Ke1，LUO Xuan1，ZENG Chang-guang1
（1.Criminal Police Branch，Deyang Public Security Bureau，Deyang 618000，China；2.Lincang Public Security Bureau，Lincang 677000，China）

Objective To establish a high performance liquid chromatographic（HPLC）method for simultaneous determination of three effective constituents，including tetrahydrocannabinol（THC），cannabidiol （CBD）and cannabinol（CBN）in Cannabis plants.Methods A C18column was used in this study，and acetonitrile-phosphate buffer（0.015mol/L KH2PO4）was used as mobile phase at a flow rate of 1.0mL/min. At a detection wavelength of 220mm，UV absorption spectra were collected at the wavelength range of 190-400 nm，and the spectra and retention time were counted as qualitative evidence.Results THC，CBD and CBN could be well separated by this method.Three components had good linear relationship in the range of 0.4-40μg/mL（R2≥0.999 3）.The recoveries were over 87%.The limits of detection were 1.8ng，2.0ng and 1.3ng，respectively.The relative standard deviation（RSD）were less than 5%for both inter-day and intra-day precisions.Conclusion Reversed-phase HPLC method is simple，rapid and accurate，and it is suitable for the qualitative and quantitative detection of THC，CBD and CBN in Cannabis plants.

forensic toxicology；high performance liquid chromatography；Cannabis；tetrahydrocannabinol；cannabidiol；cannabinol

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2016.04.006

1004-5619（2016）04-0261-03

傅強（1981—），男，碩士，工程師，主要從事毒物毒品檢驗；E-mail：qiang4303@sina.com

2015-02-03）