應用微生物菌群鑒定陰道分泌液

鄒凱南，胡　萌，黃江平，周懷谷（.上海市公安局物證鑒定中心 法醫(yī)物證學現(xiàn)場應用技術公安部重點實驗室 上海市現(xiàn)場物證重點實驗室，上海 00083；.鐵道警察學院，河南 鄭州 450053）

應用微生物菌群鑒定陰道分泌液

鄒凱南1，胡萌2，黃江平1，周懷谷1
（1.上海市公安局物證鑒定中心 法醫(yī)物證學現(xiàn)場應用技術公安部重點實驗室 上海市現(xiàn)場物證重點實驗室，上海 200083；2.鐵道警察學院，河南 鄭州 450053）

目的 探究特異性存在于陰道分泌液中的微生物菌群。方法 收集陰道分泌液16份、唾液樣本16份、糞便樣本16份、精液樣本8份、外周血樣本8份、尿液樣本5份及鼻腔分泌液樣本4份，對卷曲乳桿菌、加氏乳桿菌、詹氏乳桿菌、惰性乳桿菌和阿托波氏菌的16S rRNA基因進行擴增，PCR產物采用3130xl型遺傳分析儀進行檢測。結果 卷曲乳桿菌、加氏乳桿菌、詹氏乳桿菌、惰性乳桿菌和阿托波氏菌在陰道分泌液中的檢出份數(shù)分別為15、5、8、14和3份。卷曲乳桿菌和詹氏乳桿菌特異性存在于陰道分泌液中。

結論 檢測卷曲乳桿菌和詹氏乳桿菌對鑒定陰道分泌液具有潛在的應用價值。

法醫(yī)遺傳學；微生物學；遺傳標記；陰道分泌液

DNA檢驗技術一直是法醫(yī)學研究的前沿領域，DNA檢驗結果也是鎖定嫌犯、輔助法庭對嫌犯定罪量刑的重要證據(jù)之一，但對于一個犯罪現(xiàn)場，我們更希望了解嫌犯的作案過程，常規(guī)的DNA檢驗技術無法實現(xiàn)，而人體生物性物質來源鑒定對作案過程的重建具有重要意義。例如性侵案件中，從男性陰莖上檢測到受害人陰道分泌液物質即可證明嫌犯的性侵行為，因此找到女性陰道分泌液中特異性遺傳標記物質實現(xiàn)陰道分泌液的來源鑒定是此類工作的核心。

陰道分泌液由女性的前庭大腺、子宮頸腺體、子宮內膜的分泌物，陰道黏膜的滲出液，脫落的陰道上皮細胞以及微生物菌群混合而成。正常女性陰道中可分離出20余種微生物，平均每個婦女可分離出6～8種微生物，陰道正常菌群包括：（1）革蘭氏陽性需氧菌及兼性厭氧菌（乳桿菌、棒狀桿菌、非溶血性鏈球菌、腸球菌及表皮葡萄球菌）；（2）革蘭氏陰性需氧菌及兼性厭氧菌（加德納菌、大腸埃希菌及摩根菌）；（3）專性厭氧菌（消化球菌、消化鏈球菌、類桿菌、動彎桿菌、梭桿菌及普雷沃菌）；（4）支原體及假絲酵母菌。多種微生物菌群在陰道中保持生態(tài)平衡，使陰道免受外源病原體的入侵從而保持陰道健康。國外法醫(yī)學工作者對陰道分泌液中特異性微生物菌群研究［1-4］較多，但國內相關報道較少。本研究以中國漢族無關個體來源的樣本為研究對象，對陰道分泌液、唾液、糞便、精液、外周血、尿液及鼻腔分泌液中微生物菌群的種類和分布特征進行探索，旨在篩選出漢族女性陰道分泌液中的特異性微生物菌群，并以此為標志鑒別陰道分泌液。

1　材料與方法

1.1樣本

73份DNA樣本取自中國漢族無關個體（年齡22～45歲），包括16份女性陰道分泌液樣本、16份唾液樣本、16份糞便樣本、8份精液樣本、8份外周血樣本、5份尿液樣本和4份鼻腔分泌液樣本。每份樣本用無菌棉簽采集，室溫條件下陰干后置于-20℃保存。所有樣本由上海市第一人民醫(yī)院檢驗科提供，均取得觀察對象的知情同意。

1.2DNA提取

每份無菌棉簽剪取3mm×3mm作為檢測樣，微生物菌群DNA的提取和純化采用QIAamp?DNA Mini試劑盒（德國QIAGEN公司），操作按說明書進行。為充分裂解微生物細胞壁，每個反應體系加入200U/mL變溶菌素50μL和20mg/mL溶解酵素50μL（美國Sigma公司）對檢材進行前期孵育，孵育條件為50℃ 60min。

1.3PCR擴增和結果檢測

本研究選取國外研究報道較多的卷曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus）、加氏乳桿菌（Lactobacillus gasseri）、詹氏乳桿菌（Lactobacillus jensenii）、惰性乳桿菌（Lactobacillus iners）和阿托波氏菌（Atopobium vaginae）作為研究對象，擴增目的基因為微生物菌群的16S rRNA基因，并采用6-FAM熒光標記其上游引物5′端，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列特征見表1。

表1　陰道微生物菌群16S rRNA基因的引物序列

PCR反應體系為25 μL：Identifiler?Plus試劑盒（美國AB公司）緩沖液10μL，10μmo/L引物1～5μL，模板DNA 2 μL，雙蒸水8～12 μL。PCR擴增使用9700型PCR擴增儀（美國AB公司）。熱循環(huán)參數(shù)：95℃ 11 min；94℃ 30 s，52～60℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃ 10min。擴增產物用3130xl型遺傳分析儀（美國AB公司）進行毛細管電泳檢測。

1.4靈敏度檢測

利用實時熒光定量PCR技術對倍比稀釋濃度卷曲乳桿菌和詹氏乳桿菌的DNA提取產物進行定量，并對已測DNA濃度的樣本通過3130xl型遺傳分析儀進行毛細管電泳檢測，以是否出現(xiàn)信號峰來檢測兩種微生物菌群的檢測靈敏度。探針采用Oligo Primer Analysis Software Version 7（美國Molecular Biology Insights公司）軟件進行設計，卷曲乳桿菌16S rRNA基因的探針為5′6-FAM-CGGATGGGTGAGTAAC ACG-BHQ1 3′，詹氏乳桿菌16S rRNA基因的探針為5′6-FAM-CAGATGCTAATACCGGATAAAAGCTACT TTCG-BHQ1 3′。

PCR反應體系為50μL：1×Real-time PCR Master Mix（日本TOYOBO公司）25μL，10μmol/L的寡核苷酸引物2 μL（上游和下游），5 μmo/L探針2 μL，模板DNA 5 μL，雙蒸水16 μL。選擇QuantifilerTMHuman DNA定量試劑盒（美國AB公司）中的Quantifiler? Duo DNA Standard作為DNA定量標準品。PCR擴增使用7500型實時熒光定量PCR儀（美國AB公司）。熱循環(huán)參數(shù)：95℃ 1 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)。其中卷曲乳桿菌和詹氏乳桿菌各選取3份DNA樣本擴增，每份DNA樣本稀釋7～10個梯度以檢測微生物菌群的擴增靈敏度。

1.5STR分型

對本研究所提取的73份中國漢族無關個體DNA樣本采用Identifiler?Plus試劑盒（美國AB公司）進行人類常染色體STR分型［3］。使用9700型PCR擴增儀（美國AB公司）進行擴增，在3130xl型遺傳分析儀上進行電泳檢測。

2　結　果

2.1特異性檢測結果

通過檢測16S rRNA基因是否存在，間接檢測卷曲乳桿菌、加氏乳桿菌、詹氏乳桿菌、惰性乳桿菌和阿托波氏菌在陰道分泌液、唾液、糞便、精液、外周血、尿液（男、女）及鼻腔分泌液中的分布特征（表2）。結果顯示，卷曲乳桿菌、加氏乳桿菌、詹氏乳桿菌、惰性乳桿菌和阿托波氏菌在陰道分泌液中的檢出份數(shù)分別為15、5、8、14和3。詹氏乳桿菌特異性存在于陰道分泌液中；卷曲乳桿菌同時存在于陰道分泌液和女性尿液中；加氏乳桿菌、惰性乳桿菌和阿托波氏菌同時存在于陰道分泌液和其他多種人體生物性物質中，特異性較差。

表2　五種微生物菌群16S rRNA基因在人體各生物性物質中的檢出情況?。ǚ荩?/p>

2.2靈敏度檢測結果

3份DNA提取樣本稀釋的質量濃度分別為0.098～6 424、0.038～2 492、0.135～8 864 pg/μL，卷曲乳桿菌的檢出質量濃度分別為0.392、0.152、0.541pg/μL，平均檢測靈敏度為0.362pg/μL；另3份DNA提取樣本稀釋的質量濃度分別為0.067～1088、0.107～438.272、0.013～213 pg/μL，詹氏乳桿菌的檢出質量濃度分別為0.268、0.428、0.052 pg/μL，平均檢測靈敏度為0.249pg/μL。

2.3STR檢測結果

73份DNA提取樣本采用Identifiler?Plus試劑盒（美國AB公司）均可成功進行人類常染色體STR分型檢測。

3　討　論

本研究以卷曲乳桿菌、加氏乳桿菌、詹氏乳桿菌、惰性乳桿菌和阿托波氏菌為研究對象，通過檢測各微生物菌群16S rRNA基因在陰道分泌液、唾液、糞便、精液、外周血、尿液及鼻腔分泌液共73份中國漢族無關個體樣本中的分布特征，探究特異性存在于陰道分泌液中的微生物菌群，以期達到鑒定陰道分泌液的目的。結果顯示，卷曲乳桿菌和詹氏乳桿菌特異性存在于陰道分泌液中，而加氏乳桿菌、惰性乳桿菌和阿托波氏菌在陰道分泌液和其他人體生物性物質中均存在，此檢測結果與Akutsu等［3］報道的相一致。卷曲乳桿菌和詹氏乳桿菌在16份陰道分泌液中的檢出份數(shù)分別為15和8，即在陰道分泌液中存在檢測不到卷曲乳桿菌或詹氏乳桿菌的情況，因此，卷曲乳桿菌和詹氏乳桿菌檢測的陽性結果可以確定為陰道分泌液，陰性結果則不能排除為陰道分泌液。此外，筆者發(fā)現(xiàn)卷曲乳桿菌同時存在于陰道分泌液和女性尿液中，這很可能由于女性尿道緊鄰陰道導致的污染。本研究選擇實驗室日常用于人類DNA提取的QIAamp?DNA Mini試劑盒進行微生物菌群DNA提取，操作步驟均按照說明書進行，只是在提取前加入變溶菌素和溶解酵素孵育檢材以充分裂解微生物細胞壁，73份樣本均成功獲得人類常染色體STR分型結果。此法不僅實現(xiàn)了人類DNA和微生物DNA的共提取，提高提取效率，同時也起到節(jié)約檢材的作用。

本研究對利用微生物菌群鑒定陰道分泌液作了初探，但要用于法醫(yī)學實踐還需要更多的研究和探討，如人體生物性物質中的微生物菌群是否會因為生活環(huán)境、年齡以及身體狀態(tài)等存在數(shù)量或種類的變化，不同溫、濕度或極端條件下的檢材檢測結果如何，陰道分泌液中是否存在更多的特異性微生物菌群等。另外，逐個微生物菌群的檢測給陰道分泌液來源鑒定帶來一定的工作量，將各微生物菌群整合在一起聯(lián)合鑒定其來源才是未來的發(fā)展方向。

［1］Giampaoli S，Berti A，Valeriani F，et al.Molecular identification of vaginal fluid by microbial signature［J］. Forensic Sci Int Genet，2012，6（5）：559-564.

［2］Fleming RI，Harbison S.The use of bacteria for the identification of vaginal secretions［J］.Forensic Sci Int Genet，2010，4（5）：311-315.

［3］Akutsu T，Motani H，Watanabe K，et al.Detection of bacterial 16S ribosomal RNA genes for forensic identification of vaginal fluid［J］.Leg Med（Tokyo），2012， 14（3）：160-162.

［4］Haas C，Hanson E，Anjos MJ，et al.RNA/DNA coanalysis from human menstrual blood and vaginal secretion stains：results of a fourth and fifth collaborative EDNAP exercise［J］.Forensic Sci Int Genet，2014，8（1）：203-212.

［5］Zozaya-Hinchliffe M，Lillis R，Martin DH，et al. Quantitative PCR assessments of bacterial species in women with and without bacterial vaginosis［J］.J Clin Microbiol，2010，48（5）：1812-1819.

［6］Yan DH，Lü Z，Su JR.Comparison of main lactobacillus species between healthy women and women with bacterial vaginosis［J］.Chin Med J（Engl），2009，122（22）：2748-2751.

［7］De Backer E，Verhelst R，Verstraelen H，et al.Quantitative determination by real-time PCR of four vaginalLactobacillus species，Gardnerellavaginalisand Atopobiumvaginaeindicatesaninverserelationship between L.gasseri and L.iners［J］.BMC Microbiology，2007，7（25）：1-13.

（本文編輯：李莉）

Identification of Vaginal Fluid Using Microbial Signatures

ZOU Kai-nan1，HU Meng2，HUANG Jiang-ping1，ZHOU Huai-gu1
（1.Shanghai Key Laboratory of Crime Scene Evidence，Key Laboratory of Forensic Evidence and Science Technology，Ministry of Public Security，Institute of Forensic Science，Shanghai Public Security Bureau，Shanghai 200083，China；2.Railway Police College，Zhengzhou 450053，China）

Objective To investigate the specific microbial signatures in vaginal fluid.Methods Vaginal fluid（16 samples），saliva（16 samples），feces（16 samples），semen（8 samples），peripheral blood （8 samples），urine（5 samples），and nasal secretion（4 samples）were collected respectively.The 16S rRNA genes of Lactobacillus crispatus，Lactobacillus gasseri，Lactobacillus jensenii，Lactobacillus iners，and Atopobium vaginae were amplified.PCR production was detected via a 3130xl Genetic Analyzer.Results The detected number of Lactobacillus crispatus，Lactobacillus gasseri，Lactobacillus jensenii，Lactobacillus iners，and Atopobium vaginae were 15，5，8，14，and 3 in all vaginal fluid samples，respectively.Lactobacillus crispatus and Lactobacillus jensenii existed specifically in vaginal fluid.Conclusion There is a potential application value to detect Lactobacillus crispatus and Lactobacillus jensenii for the identification of vaginal fluid.

forensic genetics；microbiology；genetic markers；vaginal fluid

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2016.04.004

1004-5619（2016）04-0254-03

公安部科技強警基礎工作專項（2016GABJC42）；上海市科學技術委員會科研計劃項目（14JG0500400）

鄒凱南（1983—），女，碩士，主檢法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)DNA分析技術的應用和研究；E-mail：kitty_zkn@126.com通信作者：周懷谷，男，博士，主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)DNA分析技術的應用和研究；E-mail：hgzhou803@hotmail.com

2016-02-17）