常廣寧 吳春華**侯秀明 趙彩云 安冬(遼寧省大連市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,遼寧大連116036)
·食用菌·
栽培條件優(yōu)化對(duì)蛹蟲草及其菌絲體生長(zhǎng)的影響*
常廣寧 吳春華**侯秀明 趙彩云 安冬
(遼寧省大連市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,遼寧大連116036)
為了確定人工栽培蛹蟲草最適宜的環(huán)境條件,我們開展了不同環(huán)境對(duì)蛹蟲草菌絲體生長(zhǎng)影響試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明,制作液體菌種時(shí)以剛長(zhǎng)滿試管的母種最佳,液體培養(yǎng)基最適pH值為7.0,蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)最適溫度為15~25℃,子實(shí)體原基分化和發(fā)育的最適宜溫度為17~23℃,子實(shí)體生長(zhǎng)最適宜濕度為70%~75%,蛹蟲草轉(zhuǎn)色和子實(shí)體生長(zhǎng)最適宜光照強(qiáng)度為700~1100Lx,每d所需補(bǔ)光12h,蛹蟲草栽培最適宜通風(fēng)量為早晚各1次,每次30min。
蛹蟲草;菌絲體;栽培條件
蛹蟲草[Cordycepsmilitaris(L.ex.fr)link.]是蟲草屬類中的1種真菌[1],含有多種營(yíng)養(yǎng)元素。為了確定人工栽培蛹蟲草最適宜的環(huán)境條件,提高蛹蟲草栽培子實(shí)體產(chǎn)量[5],我們開展了不同環(huán)境因子對(duì)蛹蟲草菌絲體生長(zhǎng)影響的試驗(yàn),現(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果總結(jié)如下。
1.1試驗(yàn)材料
供試菌株4個(gè),A由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)王成春教授提供,B由北京金貝爾生物工程研究所提供,C和D由大連市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供(自大連市莊河山區(qū)采集的蛹蟲草野生種經(jīng)多代馴化,并經(jīng)過分離提純的兩個(gè)新品系);供試藥劑為95%酒精、KH2PO4、Mg-SO4·7H2O、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂條、大米、小麥、土豆等;供試儀器為DL-CJ-2N高性能無(wú)菌試驗(yàn)臺(tái)、電子天平、立式高壓蒸汽滅菌器、冷藏柜、電磁爐、微波爐、往復(fù)式搖床等。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1培養(yǎng)基制備
(1)固體培養(yǎng)基制備:固體培養(yǎng)基為改良的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)。培養(yǎng)基配方:去皮馬鈴薯20%、葡萄糖2%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.1%、蛋白胨0.3%、瓊脂條2%、水適量。主要用于蛹蟲草野生種的馴化分離、提純和母種的培養(yǎng)及冷藏保存。(2)液體培養(yǎng)基制備:液體培養(yǎng)基的組分與固體培養(yǎng)基基本相同,去掉瓊脂條即可,其余組分不變。定容后分裝于250mL輸液瓶,每瓶裝液量100mL,用耐高溫高壓的聚丙烯塑料膜封口后于立式高壓蒸汽滅菌器內(nèi)消毒滅菌30min即成。(3)栽培培養(yǎng)基制備:東北優(yōu)質(zhì)大米50g加入60mL水或1%葡萄糖水溶液制成大米培養(yǎng)基,選用無(wú)霉變的干凈小麥籽粒50g加入65~70mL水或1%葡萄糖水溶液制成小麥培養(yǎng)基,將上述材料分別裝入780mL廣口玻璃罐頭瓶中,用OPP亮紙和乳膠圈封口,于立式高壓蒸汽滅菌器內(nèi)消毒1h即成。
1.2.2蛹蟲草液體菌種培養(yǎng)條件優(yōu)化
(1)pH值對(duì)蛹蟲草液體菌種生物量的影響:制作液體培養(yǎng)基定容時(shí)將pH值分別調(diào)至3~11.5,梯度為0.5,滅菌冷卻,分別接入大米粒大小的母種表層菌皮,在恒溫振蕩器中20℃、160r/min培養(yǎng)5d,4000rpm離心10min后取出菌絲體在恒溫干燥箱內(nèi)50℃烘干并稱重。(2)菌株保存時(shí)間對(duì)液體菌種生物量的影響:正常制備液體培養(yǎng)基,定容、分裝、滅菌、冷卻后分別接入在冷藏柜4℃環(huán)境中保存30d、15d和0d的菌種,在恒溫振蕩器中20℃、160r/min培養(yǎng)5d,4000rpm離心10min后取菌絲體在恒溫干燥箱內(nèi)50℃烘干并稱重。
1.2.3蛹蟲草栽培環(huán)境條件優(yōu)化
(1)培養(yǎng)溫度對(duì)蛹蟲草生長(zhǎng)的影響:正常制備小麥培養(yǎng)基,滅菌、冷卻、接種A菌株后分別置于3個(gè)不同培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)管理,培養(yǎng)室設(shè)定溫度15℃、20℃、25℃,每個(gè)培養(yǎng)室1000瓶,每個(gè)處理均詳細(xì)調(diào)查從蛹蟲草培養(yǎng)基接種到菌絲封面所需天數(shù)、蛹蟲草子實(shí)體長(zhǎng)滿瓶所需天數(shù),最終調(diào)查各個(gè)溫度梯度下每千瓶所產(chǎn)出子實(shí)體的產(chǎn)量(干重),從而得到平均每瓶子實(shí)體產(chǎn)量,3次重復(fù)。(2)空氣濕度對(duì)蛹蟲草生長(zhǎng)的影響:利用小麥培養(yǎng)基開展?jié)穸忍荻扔绊懺囼?yàn),通過微電腦噴灌系統(tǒng)嚴(yán)格控制培養(yǎng)室內(nèi)的空氣相對(duì)濕度,將空氣相對(duì)濕度分作4個(gè)梯度處理,分別為>75%、70%~75%、65%~70%和<65%。菌絲培養(yǎng)期培養(yǎng)室溫度保持20~22℃,待菌絲封面后再降低環(huán)境溫度進(jìn)行出草管理,白天溫度設(shè)定19℃、夜間20℃。設(shè)3次重復(fù),每個(gè)重復(fù)栽培蛹蟲草1000瓶。調(diào)查從蛹蟲草培養(yǎng)基接種到菌絲封面所需天數(shù)、蛹蟲草子實(shí)體長(zhǎng)滿瓶所需天數(shù),最終調(diào)查各個(gè)濕度梯度下每千瓶所產(chǎn)出子實(shí)體產(chǎn)量(干重),計(jì)算得到每瓶的平均子實(shí)體產(chǎn)量。(3)光照對(duì)蛹蟲草生長(zhǎng)的影響:①光照強(qiáng)度對(duì)蛹蟲草生長(zhǎng)的影響。采用小麥培養(yǎng)基,全部接種C菌株,菌絲培養(yǎng)溫度20~22℃、空氣濕度自然,子實(shí)體原基分化及子實(shí)體生長(zhǎng)期培養(yǎng)溫度19~21℃、空氣濕度70%~75%,利用日光燈的數(shù)量控制補(bǔ)光的強(qiáng)度,設(shè)3個(gè)處理,分別為400~700Lx、700~1100Lx、1100Lx以上,3次重復(fù)。②日光照時(shí)間對(duì)蛹蟲草生長(zhǎng)的影響。采用小麥培養(yǎng)基,接種D菌株,溫度、濕度管理與光照強(qiáng)度試驗(yàn)相同,光照強(qiáng)度為700~1100Lx,利用微電腦定時(shí)開關(guān)控制培養(yǎng)室的燈光電路總電源,補(bǔ)光時(shí)間分別設(shè)定為8~16時(shí)、8~20時(shí)、6~22時(shí)。每個(gè)處理栽培500瓶,3次重復(fù)。(4)日通風(fēng)量對(duì)蛹蟲草生長(zhǎng)的影響:試驗(yàn)管理除補(bǔ)光12h外,其它條件與光照時(shí)間試驗(yàn)相同,采用B菌株,3個(gè)處理分別為每d通風(fēng)1次、2次、3次,每次均為0.5h。每個(gè)處理1000瓶,3次重復(fù)。
1.2.4品種間子實(shí)體產(chǎn)量差異
將A、B、C、D4個(gè)菌株分別栽培于2000瓶小麥培養(yǎng)基上,試驗(yàn)溫度、濕度、光照強(qiáng)度、補(bǔ)光時(shí)間與每d通風(fēng)量試驗(yàn)相同,每d早晚各通風(fēng)0.5h。調(diào)查菌絲生長(zhǎng)速度、子實(shí)體長(zhǎng)滿瓶所需時(shí)間及每瓶平均產(chǎn)量,3次重復(fù)。
2.1蛹蟲草液體菌種生物量的影響因素
2.1.1pH值對(duì)蛹蟲草液體菌種生物量的影響
在不同pH值梯度的液體培養(yǎng)基中接種蛹蟲草C菌株,每個(gè)處理接種10瓶,置于恒溫振蕩器中20℃、160r/min振蕩培養(yǎng)5d,離心后收取菌絲體烘干并稱重,結(jié)果見圖1。由圖1可以看出,在相同的培養(yǎng)條件下,不同pH值的液體培養(yǎng)基內(nèi)的菌絲體(菌球)生長(zhǎng)量有較大差異,在酸性環(huán)境中蛹蟲草菌絲均生長(zhǎng)良好,可大量繁殖菌絲體,并且隨著pH值的升高,菌絲體生物量逐漸增加。pH值為7.0時(shí)可獲得最高的生物量;當(dāng)pH值達(dá)到7.5時(shí),菌絲體生物量開始下降;在pH>7.5的堿性條件下菌絲體生物量急劇下降,只有極少量的菌絲體可以存活。因此在蛹蟲草生產(chǎn)制種時(shí)應(yīng)盡量將液體培養(yǎng)基的pH值調(diào)到中性或者微酸。
圖1 pH值對(duì)液體菌種生物量的影響
2.1.2菌株保存時(shí)間對(duì)液體菌種生物量的影響
分別將新長(zhǎng)好的蛹蟲草母種和已在冷藏柜保存15d、30d的C菌株各接種5瓶于液體培養(yǎng)基,在恒溫振蕩器中20℃、160r/min培養(yǎng)5d,離心取菌絲體烘干并稱重。
由表1可知,將菌株母種保存于冷藏柜中對(duì)菌株活性有一定影響,保存時(shí)間越長(zhǎng),用其制作液體菌種所獲得的生物量越少,并且經(jīng)過多重比較發(fā)現(xiàn),未冷藏菌株與冷藏菌株間已達(dá)到極顯著差異水平,而冷藏15d和30d兩種處理間無(wú)顯著差異。所以在生產(chǎn)栽培制作液體菌種時(shí)以利用剛發(fā)滿試管的母種最佳,可獲得最多的菌絲體(菌球),如使用冷藏柜中保存的菌種,必須經(jīng)過提純復(fù)壯,否則嚴(yán)重影響液體菌種的質(zhì)量和活性。
表1 各菌株保存時(shí)間處理液體菌種的生物量
2.2培養(yǎng)條件對(duì)蛹蟲草子實(shí)體生長(zhǎng)的影響
2.2.1培養(yǎng)溫度對(duì)蛹蟲草生長(zhǎng)的影響
溫度是蛹蟲草菌絲培養(yǎng)和子實(shí)體發(fā)育的極其重要的環(huán)境因子,為得到適宜蛹蟲草人工栽培的環(huán)境溫度,我們分別在15℃、20℃、25℃培養(yǎng)室開展栽培試驗(yàn),培養(yǎng)室內(nèi)實(shí)際溫度在設(shè)定溫度上下浮動(dòng)。每個(gè)處理1000瓶,3次重復(fù)。
由表2可知,溫度對(duì)蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)和子實(shí)體生長(zhǎng)影響均較大。在菌絲生長(zhǎng)速度方面,蛹蟲草菌絲和一般食用菌對(duì)溫度的表現(xiàn)類似,溫度越低菌絲生長(zhǎng)越慢,溫度越高菌絲生長(zhǎng)越快,菌絲長(zhǎng)滿料面所需時(shí)間越短;在蛹蟲草子實(shí)體生長(zhǎng)過程中,較長(zhǎng)時(shí)間處于高溫環(huán)境會(huì)出現(xiàn)蛹蟲草子實(shí)體頂端分叉或呈珊瑚狀等畸形現(xiàn)象,產(chǎn)量下降明顯。通過對(duì)蛹蟲草產(chǎn)品干品產(chǎn)量比較可以看出,低溫養(yǎng)菌、子實(shí)體生長(zhǎng)管理對(duì)最終產(chǎn)量亦有一定影響,但比高溫對(duì)產(chǎn)量的影響要小很多。由此得出,蛹蟲草栽培生產(chǎn)中菌絲培養(yǎng)階段的最適宜溫度為24~25℃,即蛹蟲草栽培生產(chǎn)中采用高溫養(yǎng)菌可有效縮短菌絲封面所需時(shí)間,從而縮短整個(gè)生產(chǎn)周期。子實(shí)體培養(yǎng)階段最適宜溫度為17~23℃,采用高溫養(yǎng)菌、降溫出草的管理方式可有效提高產(chǎn)量,從而使蛹蟲草栽培獲得更高的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益。
表2 各溫度處理蛹蟲草的生長(zhǎng)情況及產(chǎn)量
2.2.2空氣相對(duì)濕度對(duì)蛹蟲草生長(zhǎng)的影響
在4個(gè)試驗(yàn)條件相同的培養(yǎng)室內(nèi),通過微噴灌系統(tǒng)控制培養(yǎng)室內(nèi)的空氣相對(duì)濕度,使空氣相對(duì)濕度分別達(dá)<65%、65%~70%、70%~75%和>75%,每個(gè)培養(yǎng)室接種培養(yǎng)蛹蟲草1000瓶,重復(fù)3次。
由表3可知,空氣相對(duì)濕度也是對(duì)蛹蟲草生長(zhǎng)產(chǎn)生重大影響的環(huán)境因子。在蛹蟲草接種以后的菌絲培養(yǎng)階段對(duì)空氣相對(duì)濕度并不敏感,空氣濕度對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度沒有產(chǎn)生重要影響;在子實(shí)體生長(zhǎng)階段空氣相對(duì)濕度對(duì)產(chǎn)量有一定影響,尤其對(duì)蛹蟲草菌絲扭結(jié)分化子實(shí)體原基產(chǎn)生重要影響。空氣相對(duì)濕度太低或者過高都不利于蛹蟲草子實(shí)體原基分化,子實(shí)體原基分化又直接關(guān)系到蛹蟲草栽培產(chǎn)量,所以在菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基表面后嚴(yán)格控制空氣相對(duì)濕度尤為重要。試驗(yàn)數(shù)據(jù)還表明,空氣相對(duì)濕度控制在70%~75%時(shí),蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量最高,65%~70%次之,低于65%時(shí)產(chǎn)量明顯下降,而在子實(shí)體生長(zhǎng)后期空氣相對(duì)濕度高于75%時(shí)容易出現(xiàn)腐爛變質(zhì)現(xiàn)象,嚴(yán)重影響子實(shí)體的品質(zhì)和產(chǎn)量。因此,我們可以確定蛹蟲草生產(chǎn)的菌絲培養(yǎng)階段不需要對(duì)空氣相對(duì)濕度進(jìn)行特殊控制,保持自然的空氣相對(duì)濕度即可,而在子實(shí)體生長(zhǎng)階段要將空氣濕度控制在70%~75%,以獲得更高的產(chǎn)量和更優(yōu)良的品質(zhì)。
表3 各濕度處理蛹蟲草的生長(zhǎng)情況及產(chǎn)量
2.2.3光照對(duì)蛹蟲草生長(zhǎng)的影響
為了掌握蛹蟲草栽培對(duì)光照條件的需求,我們分別設(shè)計(jì)了不同光照強(qiáng)度和每d光照時(shí)間試驗(yàn)。試驗(yàn)采用780mL玻璃質(zhì)罐頭瓶,每個(gè)處理500瓶,3次重復(fù),調(diào)查蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量。
2.2.3.1光照強(qiáng)度對(duì)蛹蟲草生長(zhǎng)的影響在蛹蟲草栽培過程中,蛹蟲草從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)為生殖生長(zhǎng)需要一定的散射光才能完成,為了得到蛹蟲草菌絲轉(zhuǎn)色所需最適宜的光照強(qiáng)度,我們將補(bǔ)光強(qiáng)度分3種處理進(jìn)行栽培試驗(yàn)。
由表4可知,不同光照強(qiáng)度對(duì)蛹蟲草栽培也有較大影響。光照強(qiáng)度直接影響菌絲由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化,從而最終影響蛹蟲草的產(chǎn)量,當(dāng)光照強(qiáng)度過低(700Lx以下)和光照強(qiáng)度過高(1100Lx以上),蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量降低,因此蛹蟲草轉(zhuǎn)色和生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化的最適宜光照強(qiáng)度為700~1100Lx,嚴(yán)格控制補(bǔ)充光源的光照強(qiáng)度可以明顯提高子實(shí)體產(chǎn)量。此外,光照強(qiáng)度不同對(duì)蛹蟲草子實(shí)體的色澤也有一定影響,光照強(qiáng)度過低或者過高都會(huì)使子實(shí)體顏色變淺,降低子實(shí)體外觀品質(zhì),從而降低經(jīng)濟(jì)價(jià)值;將光照強(qiáng)度控制在700~1100Lx時(shí),子實(shí)體色澤最好,經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高。
表4 各光照強(qiáng)度處理蛹蟲草的生長(zhǎng)情況
2.2.3.2日光照時(shí)間對(duì)蛹蟲草生長(zhǎng)的影響為了調(diào)查每d光照時(shí)間對(duì)蛹蟲草生長(zhǎng)的影響,我們?cè)O(shè)計(jì)了每d光照時(shí)間對(duì)蛹蟲草生長(zhǎng)影響試驗(yàn),即在溫度、濕度、補(bǔ)光強(qiáng)度相同的情況下,利用微電腦時(shí)控開關(guān)控制每d日光燈補(bǔ)光時(shí)間分別為8h、12h、16h,每個(gè)處理500瓶,3次重復(fù),最終調(diào)查子實(shí)體產(chǎn)量。
由表5可知,每d補(bǔ)光時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)蛹蟲草產(chǎn)量也有一定影響,每d補(bǔ)光時(shí)間過短(8h以下)蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量下降明顯,但每d補(bǔ)光12h和16h處理之間沒有顯著差異。為了有效利用資源,節(jié)約成本,在蛹蟲草栽培生產(chǎn)中我們確保補(bǔ)光時(shí)間達(dá)到12h即可。
表5 各光照時(shí)間處理蛹蟲草子實(shí)體的產(chǎn)量
2.2.4日通風(fēng)量對(duì)蛹蟲草生長(zhǎng)的影響
蛹蟲草菌既不屬于厭氧菌又不屬于好氧菌[5],為了確定蛹蟲草生長(zhǎng)最適宜的空氣環(huán)境,我們開展了每d不同通風(fēng)量對(duì)蛹蟲草生長(zhǎng)影響試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理,分別為每d中午通風(fēng)1次、早晚各通風(fēng)1次、早中晚共通風(fēng)3次,每次通風(fēng)時(shí)間均為0.5h。每個(gè)處理栽培蛹蟲草1000瓶,通過總產(chǎn)量計(jì)算每瓶平均產(chǎn)量,并調(diào)查產(chǎn)品的粗細(xì)度。
試驗(yàn)結(jié)果表明(見表6),每d通風(fēng)1次,培養(yǎng)室內(nèi)二氧化碳濃度高、氧氣不足,不利于蛹蟲草生長(zhǎng),產(chǎn)量較低,而每d通風(fēng)2次和3次處理產(chǎn)量較高。雖然二者產(chǎn)量并無(wú)太大差異,但是通過子實(shí)體品質(zhì)調(diào)查發(fā)現(xiàn),通風(fēng)量越大子實(shí)體越粗,品質(zhì)下降。因此每d通風(fēng)2次、每次0.5h,既可以獲得較高的產(chǎn)量,又能確保子實(shí)體產(chǎn)品品質(zhì),是蛹蟲草栽培生產(chǎn)最適宜的通風(fēng)量。
表6 各日通風(fēng)量處理蛹蟲草的產(chǎn)量
2.3品種差異對(duì)子實(shí)體產(chǎn)量的影響
在小麥培養(yǎng)基上分別接種栽培A、B、C、D4種菌株,每個(gè)菌株接種2000瓶,重復(fù)3次。接種后置于培養(yǎng)室養(yǎng)菌,菌絲培養(yǎng)溫度20~22℃、空氣濕度自然,子實(shí)體原基分化及子實(shí)體生長(zhǎng)期培養(yǎng)溫度19~21℃、空氣濕度70%~75%,每d6~18時(shí)進(jìn)行補(bǔ)光,補(bǔ)光光照強(qiáng)度為700~1100Lx,每d早晚各通風(fēng)0.5h,記錄菌絲生長(zhǎng)速度、子實(shí)體滿瓶日期和平均產(chǎn)量。
由表7可知,菌株D在試驗(yàn)中表現(xiàn)為菌絲活力弱,菌絲封面最晚,每瓶的平均產(chǎn)量也大大低于其它品種;菌種C表現(xiàn)最好,菌絲生活力旺盛,生長(zhǎng)速度快,最終每瓶子實(shí)體平均產(chǎn)量也最高,而菌種A和B居中。菌源優(yōu)劣是蛹蟲草栽培生產(chǎn)成功與否的又一極為重要因素,劣質(zhì)菌源將直接降低子實(shí)體產(chǎn)量。
表7 各參試菌株品種的產(chǎn)量
本試驗(yàn)明確了蛹蟲草菌適宜生存的酸堿度,在酸性條件下蛹蟲草菌絲均可正常生長(zhǎng)存活,堿性條件不利于蛹蟲草菌絲體生長(zhǎng)繁殖,當(dāng)液體培養(yǎng)基pH值為7.0時(shí)最有利于蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)存活,培養(yǎng)出的菌絲體生物量最高,因此蛹蟲草制種時(shí)應(yīng)將液體培養(yǎng)基的酸堿度調(diào)至中性為最佳。制作液體菌種時(shí)以剛發(fā)滿試管的母種為最佳,可獲得最多的菌絲體(菌球),如使用冷藏柜中保存的菌種必須經(jīng)過提純復(fù)壯,否則嚴(yán)重影響液體菌種的質(zhì)量和活性。本試驗(yàn)明確了影響蛹蟲草栽培生長(zhǎng)的環(huán)境因子,蛹蟲草菌絲在15~25℃均可生長(zhǎng)且溫度越高發(fā)菌越快,子實(shí)體原基分化和生長(zhǎng)的適宜溫度為17~23℃;蛹蟲草菌養(yǎng)菌階段不需要濕度調(diào)節(jié),子實(shí)體生長(zhǎng)最適宜濕度為70%~75%;蛹蟲草轉(zhuǎn)色和子實(shí)體生長(zhǎng)最適宜光照強(qiáng)度為700~1100Lx,每d所需補(bǔ)光時(shí)間為12h;蛹蟲草栽培最適宜通風(fēng)量為早晚各1次,每次30min即可。
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大連市科學(xué)技術(shù)局科技計(jì)劃項(xiàng)目—大連市食用菌種質(zhì)資源庫(kù)建立及栽培加工技術(shù)的產(chǎn)業(yè)鏈建設(shè)(2014B11NC076)。
**通訊作者。