無痕敲除法構(gòu)建食品安全級(jí)枯草芽孢桿菌無芽孢菌株

張明俐,柳鵬福,史吉平,曾　勇

(1.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東煙臺(tái) 264005;2.中國科學(xué)院上海高等研究院,綠色化學(xué)工程技術(shù)中心,上海 201210)

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無痕敲除法構(gòu)建食品安全級(jí)枯草芽孢桿菌無芽孢菌株

張明俐1,2,柳鵬福2,史吉平2,曾勇1,*

(1.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東煙臺(tái) 264005;2.中國科學(xué)院上海高等研究院,綠色化學(xué)工程技術(shù)中心,上海 201210)

利用同源重組法快速構(gòu)建枯草芽孢桿菌(Bacilussubtilis168)spo0A基因缺陷型無芽孢菌株B.subtilis168Δspo0A。經(jīng)PCR及核酸電泳驗(yàn)證,孢子形成率鑒定和芽孢染色鏡檢,確定最終獲得不產(chǎn)芽孢的B.subtilis168Δspo0A基因缺失突變菌株?；蚯贸瓿珊?菌株基因組不需引入抗性基因或其它任何篩選標(biāo)記,實(shí)現(xiàn)了對(duì)spo0A基因的無痕基因敲除。本研究對(duì)枯草桿菌的工業(yè)化生產(chǎn)及提高相關(guān)產(chǎn)品食品質(zhì)量安全性具有重要意義。

枯草芽孢桿菌(Bacilussubtilis168),無痕基因敲除,無芽孢菌株

近年來,隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展,枯草芽孢桿菌作為基因工程表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展迅速。2011年Wang等[1]通過對(duì)枯草芽孢桿菌的代謝途徑的改造進(jìn)行了維生素B2的生產(chǎn);2013年P(guān)han等[2]通過構(gòu)建枯草芽孢桿菌基因工程菌使得異源蛋白在枯草芽孢桿菌內(nèi)大量表達(dá);此外,還有很多應(yīng)用枯草芽孢桿菌進(jìn)行核糖生產(chǎn)[3]的報(bào)道。

枯草芽孢桿菌的胞外蛋白分泌能力強(qiáng)、生長(zhǎng)速率快,發(fā)酵周期短以及其公認(rèn)安全(Generally Recognized as Safe,GRAS)特性[4]使其成為微生物發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)研究熱點(diǎn)。在營(yíng)養(yǎng)缺乏的條件下,枯草芽孢桿菌會(huì)停止生長(zhǎng),產(chǎn)生抗逆性很強(qiáng)的內(nèi)源性孢子——芽孢。生成芽孢的枯草芽孢桿菌休眠體,對(duì)外源基因表達(dá)能力大大降低,使枯草芽孢桿菌的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用受到很大限制[5]。芽孢形成過程的初始階段是由spo0A基因參與調(diào)控spo0B,spo0E,spo0F等多個(gè)基因的共同表達(dá)而啟動(dòng)的[6]。1998年,Rowe-Magnus等[7]詳細(xì)闡述了spo0A基因在芽孢形成過程的作用機(jī)制。2004年,余志強(qiáng)等[8]通過同源重組法成功獲得了枯草桿菌spo0A基因缺失突變菌株。但該方法的敲除過程中引入了多余的抗性基因,限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。

本研究利用革蘭氏陽性菌的穿梭質(zhì)粒pMAD[9]構(gòu)建了spo0A基因敲除載體pMAD-Δspo0A,誘導(dǎo)敲除元件Δspo0A與宿主基因組發(fā)生兩次同源重組并取代B.subtilis168基因組上完整的spo0A基因?qū)崿F(xiàn)了對(duì)枯草芽孢桿菌spo0A基因的無痕敲除,并通過分子生物學(xué)手段和功能驗(yàn)證,證實(shí)該基因的缺失阻斷了芽孢的形成,達(dá)到了預(yù)期目的。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌株和質(zhì)粒枯草芽孢桿菌168菌株(B.subtilis168),用于同源重組的出發(fā)菌株,購自美國模式菌種收集中心(ATCC 23857);大腸桿菌DH5α(E.coliDH5α),用做DNA片段克隆與富集,為實(shí)驗(yàn)室保存菌株;pMAD質(zhì)粒,為革蘭氏陽性菌基因敲除載體,由法國Michel De’barbouille教授惠贈(zèng)[9];限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶TAKARA公司;KOD PCR Mix及BufferTOYOBO公司;PCR引物合成蘇州金維智公司;枯草桿菌基因組DNA抽提、質(zhì)粒抽提、DNA片段純化試劑盒Axygen公司。

S1000 PCR儀、MicroPulser電穿孔儀、0.2 cm電轉(zhuǎn)杯、Gel Dox XR+凝膠成像系統(tǒng)美國BIO-RAD;EPS-300電泳儀、HE-90核酸電泳槽上海天能;ZDP-A2160A電熱培養(yǎng)箱、ZHWY-2110B搖床上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基用于大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)。

電轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基配方:LB培養(yǎng)基,山梨醇0.5 mol/L。

RM培養(yǎng)基(用于菌種復(fù)蘇)配方:LB培養(yǎng)基,山梨醇0.5 mol/L,甘露醇0.38 mol/L。

枯草桿菌芽孢誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方按甄靜[10]的方法配制。

根據(jù)需要在培養(yǎng)基中添加抗生素或X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷),配制時(shí)過濾除菌。其中氨芐青霉素(Amp)工作濃度為100 μg/mL,紅霉素(erm)工作濃度為10 μg/mL,用乙醇溶解配制,X-gal工作濃度為50 μg/mL,用二甲基酰胺溶解配制。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1PCR引物的設(shè)計(jì)上游同源臂spo0A-up擴(kuò)增引物a1/s1,下游同源臂spo0A-down擴(kuò)增引物a2/s2,單交換鑒定引物a3/s4和a4/s3,擴(kuò)增敲除片段Δspo0A的overlap PCR[11]及雙交換完成鑒定引物a1/s2(引物序列見表1/引物位置見圖1)。

表1　PCR擴(kuò)增片段引物信息Table 1　Information of PCR amplification segments’ primer

1.3.2PCR方法同源臂片段及基因敲除驗(yàn)證的PCR擴(kuò)增體系為:2×KOD Mix 25 μL,上下游引物各1 μL,DNA 1 μL,H2O 22 μL。PCR條件為:預(yù)變性94 ℃、5 min,變性94 ℃、30 s,退火52 ℃、30 s,延伸68 ℃、1 min/kb。25個(gè)循環(huán)。68 ℃延伸10 min,終止。

兩段同源臂片段連接成Δspo0A敲除元件采用重疊延伸PCR(overlap PCR)法拼接到一起,反應(yīng)體系為:2×KOD Mix 25 μL,上下游引物(a1/s2)各1 μL,上下游同源臂片段DNA各5 μL,H2O 13 μL。PCR條件為:預(yù)變性94 ℃、5 min,變性94 ℃、30 s,退火 50 ℃、50 s,延伸68 ℃、3 min,25個(gè)循環(huán)。68 ℃延伸10 min,結(jié)束。

1.3.3敲除載體pMAD-Δspo0A的構(gòu)建將上述PCR擴(kuò)增獲得的spo0A基因上下游同源臂的DNA片段用BamHI和EcoRI雙酶切,片段清潔回收后與同樣經(jīng)過BamHI和EcoRI雙酶切的質(zhì)粒pMAD連接,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α進(jìn)行擴(kuò)增,得到的重組質(zhì)粒即為可用于后續(xù)基因敲除的載體pMAD-Δspo0A。

1.3.4spo0A基因敲除的操作步驟將敲除載體質(zhì)粒pMAD-Δspo0A電轉(zhuǎn)化進(jìn)枯草芽孢桿菌168菌株,涂布X-gal加紅霉素抗性平板,30 ℃過夜培養(yǎng)。挑取顯藍(lán)色轉(zhuǎn)化子,液體LB培養(yǎng)基中30 ℃過夜培養(yǎng),按5%接種量轉(zhuǎn)接至5 mL紅霉素抗性的LB培養(yǎng)基,30 ℃孵育2 h,升溫至42 ℃繼續(xù)孵育6 h,稀釋(10-2～10-5)涂布含有X-gal和紅霉素的平板,42 ℃過夜培養(yǎng)。用a3/s4和a4/s3菌落PCR驗(yàn)證,每個(gè)菌都做兩個(gè)PCR,擴(kuò)增時(shí)間2 min,電泳選擇能擴(kuò)出來?xiàng)l帶的即為單交換完成的陽性克隆。挑取陽性單菌落于30 ℃和無抗性LB培養(yǎng)基中孵育6 h,升溫至42 ℃繼續(xù)孵育3 h,稀釋(10-2～10-5)涂布含有X-gal的無抗性LB平板,42 ℃過夜培養(yǎng)。挑取顯白斑的單菌落做菌落PCR鑒定,引物用a1/s2,擴(kuò)增時(shí)間3 min,電泳檢測(cè)片段大小應(yīng)為2.4 kb的為陽性克隆。

1.3.5spo0A基因缺陷型菌株的鑒定方法按照Agaisse H等[12]的方法分別對(duì)野生型枯草芽孢桿菌與spo0A基因缺陷型菌株進(jìn)行芽孢形成率檢測(cè)和菌體及芽孢染色,鑒定spo0A基因的敲除是否成功阻斷了菌株芽孢的形成。

1.3.6菌種生長(zhǎng)曲線的測(cè)定將-80 ℃冰箱凍存的菌種接入LB培養(yǎng)基中37 ℃搖床活化培養(yǎng)12 h,將活化后的菌種以1%的量轉(zhuǎn)接至含有50 mL LB培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中,37 ℃,200 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng),培養(yǎng)時(shí)間72 h。每隔8 h取樣,測(cè)定吸光值的變化。設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn),采用偏差不大于15%的數(shù)據(jù)作為有效數(shù)據(jù)。以培養(yǎng)時(shí)間作為橫坐標(biāo),相應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)繪制菌種生長(zhǎng)曲線。

2　結(jié)果與討論

2.1spo0A基因敲除的原理

敲除載體的構(gòu)建及同源重組發(fā)生過程如圖1所示:①,②,③片段分別表示spo0A基因上游1200 bp片段,spo0A基因編碼序列(804 bp),spo0A基因下游1201 bp片段。

(A)以野生型菌株基因組為模板,設(shè)計(jì)引物a1/s1,a2/s2,PCR分別擴(kuò)增spo0A基因上下游同源臂。連接兩段同源臂構(gòu)建成敲除元件Δspo0A。(B)敲除元件插入pMAD質(zhì)粒構(gòu)建成完整敲除載體pMAD-Δspo0A。(C)敲除載體進(jìn)入細(xì)菌后,42 ℃溫度誘導(dǎo)下,首先與基因組發(fā)生單交換,敲除載體pMAD-Δspo0A可由兩個(gè)位點(diǎn)插入B.subtilis168基因組。一次同源重組發(fā)生后pMAD-Δspo0A質(zhì)粒從不同位置整合入菌株基因組,此時(shí)菌株攜帶質(zhì)粒紅霉素抗性,設(shè)計(jì)引物a3/s4,a4/s3驗(yàn)證單交換的發(fā)生,引物一端位于插入基因組的pMAD質(zhì)粒序列內(nèi)部,一端位于原始基因組序列上,長(zhǎng)度約為1750 bp。(D)選擇發(fā)生單次交換的菌株繼續(xù)培養(yǎng),插入片段發(fā)生二次同源重組,B.subtilis168菌株基因組上的pMAD-spo0A片段脫落丟失,形成B.subtilis168Δspo0A菌株。

圖1　重組質(zhì)粒pMAD-Δspo0A的構(gòu)建與spo0A基因敲除原理Fig.1　Principle of recombinant plasmid pMAD-Δspo0A construction and spo0A gene knockout

2.2敲除片段的克隆與鑒定

按1.3方法所示的PCR條件與引物在spo0A基因的上下游分別PCR擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度為1200 bp左右的同源片段spo0A-up,spo0A-down(圖2)。同源片段清潔回收備用。

圖2　spo0A上下游同源臂的擴(kuò)增Fig.2　Amplification of spo0A upstream and downstream homologous arm segments 注：1、2：spo0A-up片段； 3、4：spo0A-down片段； 5：Marker。

Overlap PCR拼接同源片段spo0A-up,spo0A-down,PCR條件按1.3所示overlap PCR條件。獲得長(zhǎng)度約為2400 bp的Δspo0A長(zhǎng)片段(圖3)。

圖3　spo0A敲除元件PCR拼接Fig.3　spo0A knockout module PCR link 注：1:Marker；2、3：敲除元件Δspo0A。

2.3敲除載體的構(gòu)建與鑒定

分別用限制性內(nèi)切酶BamHI,EcoRI在37 ℃條件下酶切溫敏型穿梭質(zhì)粒pMAD約3 h,獲取攜帶兩個(gè)酶切位點(diǎn)的線性pMAD質(zhì)粒,清潔回收該質(zhì)粒備用。用T4 DNA ligase 16 ℃連接敲除片段Δspo0A與pMAD,獲取完整的敲除載體pMAD-Δspo0A。

2.4spo0A基因敲除

電穿孔轉(zhuǎn)化法將敲除載體pMAD-Δspo0A導(dǎo)入到菌株B.subtilis168中,30 ℃過夜培養(yǎng),紅霉素(erm)抗性平板生長(zhǎng)的單菌落即為轉(zhuǎn)入了整合載體的轉(zhuǎn)化子。

挑取轉(zhuǎn)化子繼續(xù)培養(yǎng),由于敲除載體存在spo0A基因上下游序列同源序列,可以通過單交換整合于基因組spo0A的上游或下游上,提高培養(yǎng)溫度到42 ℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h,溫敏型敲除載體丟失,涂布紅霉素抗性和X-gal的平板,能夠生長(zhǎng)的藍(lán)色菌落為發(fā)生了單次交換的突變體。用兩對(duì)鑒定引物a3/s4,a4/s3同時(shí)對(duì)一個(gè)單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證單交換的發(fā)生,其中一對(duì)引物能夠擴(kuò)增出約1750 bp條帶,另一對(duì)引物不能擴(kuò)增出條帶的為陽性克隆(圖4)。一次重組的突變體在30 ℃無抗生素壓力的條件下繼續(xù)培養(yǎng),無抗環(huán)境進(jìn)一步誘導(dǎo)發(fā)生第二次同源重組,繼續(xù)在42 ℃培養(yǎng)過夜,質(zhì)粒序列脫離菌株基因組丟失。經(jīng)過兩次同源重組,敲除片段Δspo0A交換到枯草芽孢桿菌基因組上替換spo0A基因序列,或者發(fā)生回復(fù)突變。鑒定引物a1/s2 PCR驗(yàn)證雙交換的完成,擴(kuò)增出2400 bp條帶的克隆為spo0A基因敲除成功的菌株,擴(kuò)增出3200 bp條帶的克隆為發(fā)生回復(fù)突變的菌株(圖5)。

圖4　單交換PCR驗(yàn)證Fig.4　Single crossover validation 注：1、5、6：分別在兩個(gè)重組位點(diǎn)發(fā)生單交換1750 bp； 2、3、4：分別在兩個(gè)重組位點(diǎn)未發(fā)生單交換；7：Marker。

圖5　spo0A基因敲除成功驗(yàn)證Fig.5　spo0A knockout over validation 注：1：Marker； 2、3、4：Δspo0A 2400 bp； 5、6、7 ：B.subtilis168未敲spo0A基因3200 bp。

隨著質(zhì)粒丟失,突變菌株失去紅霉素抗性,在X-gal和無抗LB平板上為白斑菌落。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)平板上白斑菌落有兩種表觀差異明顯的菌落,兩種菌落都具有枯草桿菌基本形態(tài)特征:白色,表面粗糙不平滑,邊緣波狀。兩種菌分別經(jīng)PCR驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn):菌落形態(tài)比較規(guī)則,透光性差的菌落為野生型菌落(圖6);形狀比較不規(guī)則,更加透明的菌落為基因敲除成功克隆(圖7)。

圖6　野生型B. subtilis168在LB平板上的菌落形態(tài)Fig.6　The colony characteristics of wild-type B. subtilis168 on LB plating medium

圖7　突變型B. subtilis168Δspo0A在LB平板上的菌落形態(tài)Fig.7　The colony characteristics of B. subtilis168Δspo0A on LB plating medium

2.5B.subtilis168Δspo0A與B.subtilis168芽孢形成及生長(zhǎng)周期比對(duì)

2.5.1野生型B.subtilis168與B.subtilis168Δspo0A孢子形成率按照1.3.5所述芽孢率形成鑒定方法,在80 ℃下加熱10 min基本能夠完全殺死枯草芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞,而芽孢具有強(qiáng)抗逆性,活力基本不會(huì)受到影響。

分別將野生型枯草芽孢桿菌菌株和spo0A缺陷型菌株設(shè)置三組平行,使用枯草芽孢桿菌芽孢形成培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)24 h后,取樣梯度稀釋,分別取10-6、10-7、10-8三個(gè)梯度各100 μL,涂平板,測(cè)定菌種濃度;同時(shí)將這三組剩余菌液置于80 ℃水浴鍋加熱15 min,殺死營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞,涂平板,測(cè)定芽孢形成率。37 ℃倒置培養(yǎng)24 h后計(jì)算兩組菌種芽孢形成率。

從表2數(shù)據(jù)可以看出,野生型菌株誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h后形成芽孢。敲除spo0A基因可以完全阻斷枯草芽孢桿菌芽孢的形成。

表2　野生型B.subtilis 168與B.subtilis168 Δspo0A菌株芽孢形成率測(cè)定Table 2　Sporulation ratio of wild type B.subtilisand 168Δspo0A strains bacillus

2.5.2野生型B.subtilis168與B.subtilis168Δspo0A芽孢染色鏡檢分別將野生型枯草桿菌與spo0A基因缺陷型菌株(B.subtilis168Δspo0A)接入枯草桿菌芽孢形成培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h,進(jìn)行革蘭氏染色,孔雀綠染液加熱染色5 min,番紅復(fù)染1 min后鏡檢,經(jīng)革蘭氏染色后芽孢呈現(xiàn)初染液孔雀綠的綠色,營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞呈現(xiàn)番紅復(fù)染液的紅色(圖8、圖9)。對(duì)比可以看出相同條件下培養(yǎng)24 h后,B.subtilis168Δspo0A視野內(nèi)沒有芽孢生成,而野生型B.subtilis168生成大量芽孢休眠體。

圖8　B.subtilis168Δspo0A用芽孢形成 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h染色結(jié)果(1000×)Fig.8　Stain and microscopic examination result of B.subtilis168 Δspo0A cultured in sporulation medium for 24 h(1000×)

圖9　 野生型B.subtilis168用芽孢 形成培養(yǎng)基24 h染色結(jié)果(1000×)Fig.9　Stain and microscopic examination result of Wild type B.subtilis168 cultured in sporulation medium for 24 h(1000×)

2.5.3野生型B.subtilis168與B.subtilis168Δspo0A生長(zhǎng)曲線野生型B.subtilis168與B.subtilis168Δspo0A菌種按照1.3.6所述方法進(jìn)行培養(yǎng)并制作生長(zhǎng)曲線(圖10)?？梢钥闯鐾瑯优囵B(yǎng)條件下,無芽孢B.subtilis168Δspo0A生長(zhǎng)規(guī)律與野生型B.subtilis168存在明顯差異。野生型B.subtilis168在培養(yǎng)8 h后對(duì)數(shù)期結(jié)束,生長(zhǎng)速率減緩,在8～48 h為穩(wěn)定期,48 h后到達(dá)衰亡期。而B.subtilis168Δspo0A菌株在32 h內(nèi)均保持較快生長(zhǎng)速率,最高菌種濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過野生型菌株,但菌種活力對(duì)培養(yǎng)條件的變化更加敏感,隨著培養(yǎng)基的逐漸消耗,菌種在32 h后進(jìn)入衰亡期。

圖10　野生型B. subtilis 168與B. subtilis 168Δspo0A 在LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.10　Growth curve of wild B. subtilis 168 and B. subtilis 168Δspo0A

3　結(jié)論

spo0A基因是控制枯草芽孢桿菌芽孢生成的基因之一,在枯草桿菌穩(wěn)定期起始開始表達(dá),其表達(dá)產(chǎn)物不僅調(diào)節(jié)著其它芽孢生成相關(guān)基因的表達(dá),而且影響著枯草芽孢桿菌穩(wěn)定期其他相關(guān)代謝產(chǎn)物基因的表達(dá)。敲除spo0A基因后的枯草芽孢桿菌菌落形態(tài)發(fā)生了很大改變,菌落變得比較透明,形狀更加不規(guī)則。通過對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢基因spo0A基因的敲除,可以消除菌種生長(zhǎng)過程中芽孢的產(chǎn)生,對(duì)提高枯草芽孢桿菌工業(yè)生產(chǎn)效率有重要意義。

余志強(qiáng)等[6]曾利用同源重組整合法構(gòu)建spo0A基因缺陷型枯草芽孢桿菌菌株。在該同源重組過程中對(duì)枯草芽孢桿菌基因組引入了新霉素抗性基因(neor)作為基因缺陷型菌株篩選標(biāo)記。該方法獲得的改造菌株含有新霉素抗性,如繼續(xù)對(duì)該菌株進(jìn)行基因改造則不能再用新霉素抗性基因作為篩選標(biāo)記。因此這種同源重組法將對(duì)菌株的進(jìn)一步改造產(chǎn)生局限性,并且攜帶抗生素抗性的菌株引入了多余的抗性基因,其產(chǎn)物作為食品藥品添加成分會(huì)存在安全隱患。而本研究獲得的spo0A基因缺陷型枯草芽孢桿菌菌株不需引入抗性基因或其他篩選標(biāo)記,此類基因敲除過程稱為無痕敲除,對(duì)菌種的繼續(xù)改造無任何限制,并且不會(huì)引起食品藥品安全隱患,是一種可以廣泛應(yīng)用的基因改造方法。

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Construction of a food safe gradeBacillussubtilisnonspore strain with clean deletion

ZHANG Ming-li1,2,LIU Peng-fu2,SHI Ji-ping2,ZENG Yong1,*

(1.College of Life Sciences,Yantai University,Yantai 264005,China;2.Green Chemical Engineering Technology Center,Shanghai Advanced Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Pudong New District,Shanghai 201210,China)

Construction a nonsporeB.subtilis168 strain(B.subtilis168Δspo0A)by deleting thespo0Agene using the method of homologous recombination. The nonsporeB.subtilis168Δspo0Astrain was successfully got through PCR,nucleic acid electrophoresis,sporulation ratio and microscopy identification.The genome of this engineering strain does not need to insert resistance gene or any other selection marker gene afterspo0Agenes’ knockout which called clean deletion. This study is of great significance for industrial production ofB.subtilisas well as improve safety of food and drug.

Bacilussubtilis168;clean deletion;nonspore strain

2016-01-20

張明俐(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：微生物與免疫，E-mail:zml919201949@126.com。

曾勇(1967-)，男，副教授，研究方向：水生動(dòng)物的病原與免疫機(jī)制，E-mail:zy110cn@aliyun.com。

TS201.3

A

1002-0306(2016)14-0175-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.027