不補(bǔ)料酶膜耦合反應(yīng)制備牛乳蛋白ACE抑制肽的研究

龔　洋,馬海樂(lè),王　洋,茍文來(lái),熊　建,劉　芳

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇省食品物理加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

?

不補(bǔ)料酶膜耦合反應(yīng)制備牛乳蛋白ACE抑制肽的研究

龔洋,馬海樂(lè)*,王洋,茍文來(lái),熊建,劉芳

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇省食品物理加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

為了克服傳統(tǒng)酶解技術(shù)的不足,提高酶解反應(yīng)效率,采用不補(bǔ)料酶膜耦合反應(yīng)制備牛乳蛋白ACE抑制肽。考察超濾膜對(duì)牛乳蛋白及酶的截留、膜通量及濾出液的ACE抑制率和IC50的影響,確定出超濾膜最佳的截留分子量為5000 u;研究了反應(yīng)時(shí)間、底物濃度、加酶量和循環(huán)泵轉(zhuǎn)速對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率的影響,確定最優(yōu)酶解工藝條件:底物濃度7%(W/W)、加酶量2000 U/g、反應(yīng)時(shí)間100 min、循環(huán)泵轉(zhuǎn)速100 r/min,該條件下蛋白轉(zhuǎn)化率、單位酶產(chǎn)肽量、ACE抑制率分別達(dá)到53.16%、39.59 g肽/g酶、76.81%,與對(duì)照組相比蛋白轉(zhuǎn)化率、單位酶產(chǎn)肽量、ACE抑制率分別提高了16.99%、16.61%、18.55%;采用高效凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定超濾液中ACE抑制肽的分子量分布,發(fā)現(xiàn)樣品中分子量≤2253 u組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為94.62%,超濾膜對(duì)截留分子量大小控制準(zhǔn)確。因此不補(bǔ)料酶膜耦合反應(yīng)可為酶法制備牛乳蛋白ACE抑制肽提供一種更為高效的方法。

牛乳蛋白,酶膜耦合,ACE抑制肽,蛋白轉(zhuǎn)化率

牛乳蛋白是人類(lèi)膳食蛋白質(zhì)的重要來(lái)源,不僅為人類(lèi)提供豐富的營(yíng)養(yǎng),還包含具有降血壓活性的血管緊張素(Angiotensin I-converting enzyme,ACE)抑制肽等多種生物活性肽的序列,食用安全性高、無(wú)副作用[1-3]。傳統(tǒng)酶法制備ACE抑制肽采用先酶解再膜分離的制取工藝,存在產(chǎn)品均一性差、酶消耗量大、多肽產(chǎn)率低、工序繁瑣等缺點(diǎn)[4-5]。相比之下,酶膜耦合反應(yīng)制備ACE抑制肽,在酶解反應(yīng)的同時(shí),實(shí)現(xiàn)生物小分子多肽在線(xiàn)分離,減少產(chǎn)物抑制效應(yīng),產(chǎn)物分布集中,酶和大分子多肽及蛋白等未反應(yīng)的物質(zhì)則返回反應(yīng)體系繼續(xù)反應(yīng),提高了酶的利用率,從而得到更高的底物轉(zhuǎn)化率[6-7]。近年來(lái),大量研究表明酶膜耦合技術(shù)可以改善傳統(tǒng)間歇酶解制備ACE抑制肽的不足,顯著提高反應(yīng)效率及產(chǎn)物活性。丁青芝[8]等人以蛋白轉(zhuǎn)化率為指標(biāo),研究了三種酶膜耦合制備活性多肽的模型,結(jié)果表明連續(xù)酶膜耦合模型可大大提高活性多肽的產(chǎn)能;姜瞻梅[9]等采用10000 u和3000 u的超濾膜分離酪蛋白酶解物中的ACE抑制肽,證明超濾技術(shù)是一種分離ACE抑制肽的有效手段;Cheison[10]等人利用響應(yīng)面優(yōu)化乳清蛋白在切變流酶膜反應(yīng)器中的工藝參數(shù),重點(diǎn)研究了底物濃度、加酶量和膜通量對(duì)酶膜反應(yīng)器運(yùn)行狀況的影響。本文以牛乳蛋白為原料,在前期選酶及傳統(tǒng)酶解最優(yōu)工藝基礎(chǔ)上,考察酶膜耦合反應(yīng)過(guò)程中操作參數(shù)對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率的影響,探索制備牛乳蛋白ACE抑制肽的有效方法,并采用高效凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定其相對(duì)分子量分布,為酶膜耦合技術(shù)在食品加工中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

光明脫脂奶粉蛋白含量34%,市售;血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)酶活力4.2 U/mL;馬尿酰組氨酰亮氨酸(N-Hippuryl-L-histidyl-L-leucine,HHL)Sigma公司;Neutrase(中性蛋白酶)酶活力119987 U/mL,南京誠(chéng)納化工有限公司;乙腈德國(guó)默克MERCK公司;牛血清白蛋白(67000 u)、細(xì)胞色素C(12500 u)、桿菌酶(1450 u)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(451 u)、色氨酸(204 u)Sigma公司;鹽酸、三氟乙酸、氫氧化鈉國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Pellicon小型超濾系統(tǒng)包含截留分子量為5000、3000、1000 u的再生纖維素復(fù)合膜,美國(guó)Millipore公司;BT600S型蠕動(dòng)泵保定雷弗流體科技有限公司;WFJ7200型可見(jiàn)分光光度計(jì)尤尼柯(上海)儀器有限公司;PHS-3C酸度計(jì)上海鴻蓋儀器有限公司;Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)美國(guó)安捷倫公司;Waters 1525型高效液相色譜儀美國(guó)Waters公司。

1.2酶膜耦合反應(yīng)實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1超濾膜截留分子量的選擇實(shí)驗(yàn)以超濾膜通量、透過(guò)液ACE抑制率為考核指標(biāo),通過(guò)傳統(tǒng)的酶解實(shí)驗(yàn),確定最佳的超濾膜截留分子量。在底物濃度9%、加酶量1500 U/g、水解溫度50 ℃、pH7.0的條件下酶解60 min,沸水浴滅酶10 min,5000 r/min離心10 min后取上清液,采用不同截留分子量(5000、3000、1000 u)的膜進(jìn)行超濾。超濾過(guò)程中循環(huán)泵轉(zhuǎn)速設(shè)為100 r/min,料液溫度維持50 ℃,操作壓力0.09 MPa。測(cè)定膜通量、透過(guò)液ACE抑制率。

1.2.2超濾膜對(duì)蛋白質(zhì)和酶截留情況的評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)對(duì)于酶膜耦合反應(yīng),需要評(píng)價(jià)膜對(duì)蛋白和蛋白酶的截留情況[11-12]。

對(duì)蛋白的截留情況實(shí)驗(yàn):取m1(81 g)牛奶粉配制成9%的溶液,在溫度50 ℃、轉(zhuǎn)速100 r/min、壓力0.09 MPa的條件下過(guò)5000 u的膜循環(huán)1 h,收集滲透液并濃縮凍干,稱(chēng)重為m2(2 g),截留率即為97.53%。

對(duì)蛋白酶的截留情況實(shí)驗(yàn):在底物濃度9%、加酶量1500 U/g、溫度50 ℃,pH7、壓力0.09 MPa的條件下,以5000 u的膜進(jìn)行酶膜耦合反應(yīng)100 min,每隔20 min測(cè)透過(guò)液和截留液的酶活。截留率為截留液中酶活力單位總數(shù)與原始反應(yīng)液中酶活力單位總數(shù)的百分比,透過(guò)率為透過(guò)液中酶活力單位總數(shù)與原始反應(yīng)液中酶活力單位總數(shù)的百分比。

1.2.3不補(bǔ)料酶膜耦合反應(yīng)條件的優(yōu)化以牛奶蛋白轉(zhuǎn)化率為考核指標(biāo),通過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化不補(bǔ)料模式下最佳酶膜耦合反應(yīng)的條件。選用中性蛋白酶、5000 u再生纖維素復(fù)合膜,對(duì)牛奶蛋白進(jìn)行連續(xù)循環(huán)酶膜耦合反應(yīng)。超濾裝置如圖1所示,在中性蛋白酶產(chǎn)品提供的最適溫度50 ℃和pH7.0下,考察酶解反應(yīng)時(shí)間、底物濃度、加酶量、循環(huán)泵轉(zhuǎn)速對(duì)牛奶蛋白轉(zhuǎn)化率的影響。各單因素的取值分別為:在底物濃度9%、加酶量1500 U/g、循環(huán)泵轉(zhuǎn)速100 r/min下,酶解反應(yīng)時(shí)間20、40、60、80、100、120、140、160 min;在酶解反應(yīng)時(shí)間100 min、加酶量1500 U/g、循環(huán)泵轉(zhuǎn)速100 r/min下,底物濃度3%、5%、7%、9%、11%、13%;在酶解反應(yīng)時(shí)間100 min、底物濃度7%、循環(huán)泵轉(zhuǎn)速100 r/min下,加酶量1000、1500、2000、2500、3000 U/g;在酶解反應(yīng)時(shí)間100 min、底物濃度7%、加酶量2000 U/g下,循環(huán)泵轉(zhuǎn)速60、80、100、120 r/min。

圖1　不補(bǔ)料連續(xù)酶膜耦合反應(yīng)裝置示意圖Fig.1　Demonstration of continuous membranereactor without new material feeding

1.2.4超濾透過(guò)液組分的相對(duì)分子量分布采用高效凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定超濾液的相對(duì)分子量分布[13]。Waters液相色譜系統(tǒng):Waters 1525泵,Waters 2998 PDA檢測(cè)。色譜條件:色譜柱為T(mén)SK-GEL G2000SW×L(7.8 mm×300 mm,5 μm);流動(dòng)相A,水∶三氟乙酸=100∶0.1;流動(dòng)相B,乙腈∶三氟乙酸=100∶0.1;檢測(cè)波長(zhǎng):UV 220 nm;流速0.5 mL/min;柱溫30 ℃;進(jìn)樣體積30 μL;洗脫條件:梯度洗脫,可使復(fù)雜樣品中性質(zhì)差異較大的組分能按各自適宜的容量因子k達(dá)到良好的分離目的,使峰型得以改善,增加靈敏度。依據(jù)樣品的色譜數(shù)據(jù)計(jì)算超濾液中多肽的相對(duì)分子量及其分布范圍所占質(zhì)量分?jǐn)?shù)。梯度洗脫條件如表1所示。

表1　梯度洗脫條件

蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制:準(zhǔn)確稱(chēng)取牛血清白蛋白(67000 u)、細(xì)胞色素C(12500 u)、桿菌酶(1450 u)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(451 u)、色氨酸(204 u)各0.1 g,分別溶于流動(dòng)相(乙腈∶水∶三氟乙酸=45∶55∶0.1)100 mL,再各取25 mL混合制成混標(biāo)。在上述條件下進(jìn)樣,記錄相應(yīng)保留時(shí)間,以蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣分子量對(duì)數(shù)值對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣保留時(shí)間作圖,得出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程。

1.2.5對(duì)照酶解實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)酶解最優(yōu)條件下進(jìn)行酶解[14-16],即底物濃度9%、加酶量1500 U/g、水解溫度50 ℃、pH7.0、酶解時(shí)間60 min,酶解結(jié)束后滅酶(沸水浴10 min)、離心(5000 r/min),取上清液過(guò)5000 u的超濾膜,測(cè)定透過(guò)液的ACE抑制率、蛋白轉(zhuǎn)化率及單位酶產(chǎn)肽量。

1.3主要指標(biāo)的測(cè)定方法

1.3.1膜通量的測(cè)定

式中:J-透過(guò)速率,mL·(m2·min)-1;V-透過(guò)組分的體積,mL;A-超濾膜有效面積,m2(本實(shí)驗(yàn)用的膜包面積為0.1 m2);t-超濾時(shí)間,min。

1.3.2蛋白酶的活力測(cè)定采用中華人民共和國(guó)專(zhuān)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10317-1999測(cè)定蛋白酶活力。

1.3.3蛋白轉(zhuǎn)化率的計(jì)算蛋白含量采用福林酚法[17]進(jìn)行測(cè)定。蛋白轉(zhuǎn)化率X(%)以透過(guò)液中蛋白質(zhì)含量占原料液中蛋白含量的百分比計(jì)算。

式中:X-蛋白轉(zhuǎn)化率(%);C0-原料液蛋白含量(mg·mL-1);V0-原料液總體積(mL);C1-透過(guò)液蛋白含量(mg·mL-1);V1-透過(guò)液總體積(mL)。

1.3.4單位酶產(chǎn)肽量單位酶產(chǎn)肽量Q(g肽/g酶)定義為單位質(zhì)量酶產(chǎn)生目標(biāo)肽制品的質(zhì)量,以肽制品的質(zhì)量與蛋白酶的質(zhì)量比計(jì)算。超濾液真空冷凍干燥后得到的產(chǎn)品質(zhì)量即為肽制品質(zhì)量。

1.3.5ACE抑制率的測(cè)定參照吳瓊英的測(cè)定方法并適當(dāng)改進(jìn)[18]。吸取10 μL樣品溶液,加入25 μL ACE溶液(用加鹽的硼酸緩沖液稀釋10倍),在37 ℃的水浴鍋中反應(yīng)10 min后加入40 μL HHL,在37 ℃條件下繼續(xù)反應(yīng)30 min,盡快加入85 μL 1 mol/L HCl終止反應(yīng),得到反應(yīng)液。將反應(yīng)液用0.22 μm濾膜過(guò)濾后用于HPLC分析。同時(shí)用10 μL pH8.3的硼酸緩沖液替代樣品溶液制備反應(yīng)液,作為空白對(duì)照組。液相色譜條件:色譜柱:ZORBAX SB-C18分析用色譜柱(4.6 mm×150 mm,填料粒徑為5 μm);流動(dòng)相:乙腈-超純水(體積比為25∶75,各含0.05%體積分?jǐn)?shù)的三氟乙酸),等梯度洗脫;流速:1 mL/min;柱溫:25 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。

式中:ACEI-ACE抑制率,%;A-空白對(duì)照組Hip的峰面積;B-添加ACE抑制肽組Hip的峰面積。

稱(chēng)取一定質(zhì)量樣品配成不同濃度的溶液(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL),以濃度為橫坐標(biāo),抑制率為縱坐標(biāo)繪成圓滑的曲線(xiàn),從曲線(xiàn)中計(jì)算IC50值。

1.4數(shù)據(jù)處理

2　結(jié)果與討論

2.1超濾膜的選擇

2.1.1不同截留分子量膜對(duì)膜通量的影響圖2為不同截留分子量膜對(duì)膜通量的影響。由圖2可以看出,在壓力0.09 MPa條件下5000 u的膜對(duì)酶解液具有較高的膜通量,其平均值分別是3000 u膜的1.2倍和1000 u膜的4倍左右,因此從膜通量的角度來(lái)看,5000 u的膜比較合適。

圖2　超濾時(shí)間對(duì)膜通量的影響Fig.2　Influence of ultra-filtration time on flux of membrane

2.1.2不同截留分子量膜對(duì)透過(guò)液ACE活性的影響圖3為不同截留分子量膜對(duì)透過(guò)液ACE抑制活性的影響。由圖3可以看出,未經(jīng)超濾的酶解液其ACE抑制率較低,而經(jīng)過(guò)超濾膜處理的酶解液其ACE抑制率有了大幅度的提高,通過(guò)SPSS分析四者ACE抑制活性有顯著性差異,這表明超濾可以實(shí)現(xiàn)ACE抑制肽活性成分的分離與濃縮,為制取高活性的ACE抑制肽提供一種更為有效的方法。但是3000 u和1000 u的膜通量與5000 u的膜比相對(duì)較小,因此為了提高原料的利用率和生產(chǎn)效率,綜合考慮選用5000 u分子量的膜作為酶膜耦合的實(shí)驗(yàn)用膜。與未經(jīng)超濾相比,5000 u膜過(guò)濾液ACE抑制率提高了45.22%,IC50下降了31.03%。

圖3　不同超濾膜透過(guò)液ACE抑制率及其IC50Fig.3　Inhibitory rate of ACE and IC50by ultra-filtration of various membrane

2.1.3超濾膜對(duì)原料及酶的截留及透過(guò)情況評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),超濾100 min,5000 u的膜對(duì)牛奶蛋白原料的截留率高達(dá)97.53%,說(shuō)明5000 u的再生纖維素復(fù)合膜對(duì)原料具有良好的截留性。

圖4為截留液中酶的活力截留率和透過(guò)液中酶的活力透過(guò)率隨時(shí)間的變化圖。由圖4可以看出,透過(guò)液中酶活力透過(guò)率始終維持較低水平(<5%),說(shuō)明所用的5000 u的膜對(duì)中性蛋白酶幾乎完全截留,而截留液中維持著較高的酶活力截留率(>90%),這表明在酶膜耦合的反應(yīng)過(guò)程中,酶得到了充分地循環(huán)利用,因此5000 u的再生纖維素復(fù)合膜可以作為實(shí)驗(yàn)用膜。

圖4　超濾膜對(duì)蛋白酶的截留及透過(guò)情況Fig.4　Proteases retension and permeation of 5000 u ultra-filtration membrane

2.2不補(bǔ)料酶膜耦合反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.2.1酶膜耦合反應(yīng)時(shí)間對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率的影響蛋白轉(zhuǎn)化率隨酶膜耦合反應(yīng)時(shí)間的變化趨勢(shì)如圖5所示。由圖5可知,反應(yīng)初期隨著酶膜耦合時(shí)間的延長(zhǎng),蛋白轉(zhuǎn)化率快速增長(zhǎng),而100 min以后其增長(zhǎng)的趨勢(shì)平緩,蛋白轉(zhuǎn)化率不再顯著增加。酶膜耦合反應(yīng)可以顯著提高蛋白轉(zhuǎn)化率的主要原因在于小分子肽的及時(shí)排除,減小了產(chǎn)物抑制效應(yīng)。酶解100 min以后,底物逐漸不足,受酶催化蛋白質(zhì)的解聚過(guò)程趨于結(jié)束,且反應(yīng)過(guò)程失去大量的水,反應(yīng)體系中料液粘稠致使膜通量下降,影響了蛋白轉(zhuǎn)化率的繼續(xù)提升[19]。所以,最終確定100 min為酶膜耦合反應(yīng)時(shí)間。

圖5　酶膜耦合反應(yīng)時(shí)間對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5　Influence of time on conversion ratio of protein

2.2.2底物濃度對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率的影響底物濃度對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率的影響見(jiàn)圖6。由圖6可知,底物濃度越高,蛋白轉(zhuǎn)化率反而越低。這主要是因?yàn)殡S著底物濃度的不斷增大,物料粘度增加使膜通量相應(yīng)降低,膜通量的減小影響了透過(guò)液的體積,從而使蛋白轉(zhuǎn)化率降低。

圖6　不同底物濃度對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6　Influence of different substrate concentration on conversion ratio of protein

圖7為不同底物濃度對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率及ACE抑制活性的影響。由圖7可知,就底物濃度對(duì)酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性的影響而言,過(guò)低的底物濃度會(huì)造成產(chǎn)物ACE抑制活性降低,隨著底物濃度的增加產(chǎn)物ACE抑制活性顯著升高。酶解100 min時(shí),底物濃度3%的蛋白轉(zhuǎn)化率為62.39%,ACE抑制率僅為40.69%;底物濃度13%的蛋白轉(zhuǎn)化率為28.41%,ACE抑制率高達(dá)80.31%。綜合考慮蛋白轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物ACE抑制率,選擇底物濃度為7%,其蛋白轉(zhuǎn)化率和ACE抑制率分別為47.92%和74.11%。

圖7　不同底物濃度對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率及ACE抑制率的影響Fig.7　Influence of different substrate concentration on conversion ratio of protein and inhibitory rate of ACE

2.2.3加酶量對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率的影響加酶量對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率的影響如圖8所示。由圖8可以看出,在相同時(shí)間內(nèi),加酶量低于2000 U/g時(shí),蛋白轉(zhuǎn)化率隨著加酶量的增加有明顯的提高;而加酶量高于2000 U/g時(shí),蛋白轉(zhuǎn)化率無(wú)明顯增加,其直接原因在于底物蛋白已被蛋白酶所飽和,再增加酶濃度對(duì)體系的反應(yīng)無(wú)明顯影響[20],綜上所述,選擇加酶量為2000 U/g。

圖8　加酶量對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率的影響Fig.8　Influence of enzyme concentration on conversion ratio of protein

2.2.4蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率的影響蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率的影響如圖9所示。隨著蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速增加,蛋白轉(zhuǎn)化率相應(yīng)提高。這是由于蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速增加,有利于多肽在線(xiàn)分離和底物轉(zhuǎn)化,促使蛋白轉(zhuǎn)化率提升[21-22]。但是轉(zhuǎn)速過(guò)快,會(huì)導(dǎo)致酶與底物接觸時(shí)間減少,造成酶解不充分,如圖9所示出現(xiàn)了轉(zhuǎn)速為120 r/min時(shí)蛋白轉(zhuǎn)化率低于80 r/min的蛋白轉(zhuǎn)化率。經(jīng)測(cè)定轉(zhuǎn)速100 r/min以后膜通量增加不明顯,維持在120.13 mL·(m2·min)-1左右,其蛋白轉(zhuǎn)化率達(dá)最大值,因此選擇100 r/min作為實(shí)驗(yàn)最優(yōu)循環(huán)轉(zhuǎn)速。

圖9　不同蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率的影響Fig.9　Influence of different cycle pump speed on conversion ratio of protein

通過(guò)單因素逐級(jí)優(yōu)化實(shí)驗(yàn),得到最佳的酶膜耦合反應(yīng)條件為:酶膜耦合時(shí)間100 min、底物濃度7%(W/W)、加酶量2000 U/g、循環(huán)泵轉(zhuǎn)速100 r/min。在此條件下,蛋白轉(zhuǎn)化率為53.16%、ACE抑制率為76.81%,單位酶產(chǎn)肽量為39.59 g肽/g酶。利用傳統(tǒng)的酶解方法,蛋白轉(zhuǎn)化率為45.44%、ACE抑制率為64.79%、單位酶產(chǎn)肽量為33.95 g肽/g酶。因此,就牛奶蛋白的不補(bǔ)料酶膜耦合反應(yīng)而言,蛋白轉(zhuǎn)化率、ACE抑制率、單位酶產(chǎn)肽量分別提高了16.99%、18.55%、16.61%。

2.3超濾透過(guò)液組分的相對(duì)分子量分布

以標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)分子量對(duì)數(shù)值對(duì)保留時(shí)間作圖,得出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程:Y=-0.283X+7.981(R2=0.998),式中X為保留時(shí)間,Y為相對(duì)分子量對(duì)數(shù)值。

采用高效凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定最優(yōu)條件下超濾透過(guò)液組分的相對(duì)分子量分布,由圖10可以看出,大面積的峰其保留時(shí)間靠后,超濾液中絕大部分物質(zhì)的分子量較小,這表明酶膜耦合能較為準(zhǔn)確地控制超濾液的分子量大小[23-24],使透過(guò)液的分子量主要集中在5000 u以下。

圖10　超濾組分高效凝膠排阻色譜圖Fig.10　The high performance size exclusionchromatography of the permeate fraction

使用GPC數(shù)據(jù)處理軟件,將樣品的色譜數(shù)據(jù)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程中計(jì)算,即可得到超濾液中多肽的相對(duì)分子量及其分布范圍所占質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果如表2所示。從表2中可知,超濾液中相對(duì)分子量分布在2253 u及其以下組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為94.62%。本課題組多年研究發(fā)現(xiàn),具有ACE抑制活性的多肽主要為3000 u以下的小分子片段[25],由此可見(jiàn)酶膜耦合可以富集這些高活性物質(zhì),從而提高產(chǎn)物的ACE抑制活性。

表2　超濾透過(guò)液的相對(duì)分子量分布

3　結(jié)論

實(shí)驗(yàn)確定了5000 u的再生纖維素復(fù)合膜為分離富集產(chǎn)物的適宜膜包,對(duì)牛奶蛋白和中性蛋白酶具有較好的截留功能。

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定的酶膜耦合最佳反應(yīng)工藝為:底物濃度7%(W/W)、加酶量2000 U/g、反應(yīng)時(shí)間100 min、循環(huán)泵轉(zhuǎn)速100 r/min,在最優(yōu)條件下酶解,蛋白轉(zhuǎn)化率為53.16%、ACE抑制率為76.81%,單位酶產(chǎn)肽量為39.59 g肽/g酶。與對(duì)照組相比,蛋白轉(zhuǎn)化率、ACE抑制率、單位酶產(chǎn)肽量分別提高了16.99%、18.55%、16.61%。

采用高效凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定了超濾液中ACE抑制肽的分子量分布,其分子量≤2253 u的組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為94.62%,表明酶膜耦合可以較準(zhǔn)確地控制截留分子量大小,可以富集高活性物質(zhì),提高產(chǎn)物的ACE抑制活性。

通過(guò)產(chǎn)物的在線(xiàn)分離和酶的循環(huán)利用,酶膜耦合反應(yīng)技術(shù)克服了傳統(tǒng)酶解技術(shù)的不足,提高了蛋白轉(zhuǎn)化率和單位酶產(chǎn)肽量,從而節(jié)約了生產(chǎn)成本,提高了生產(chǎn)效率,可為工業(yè)化生產(chǎn)牛乳蛋白ACE抑制肽提供參考和依據(jù)。

[1]于曉慶,王雄,司佳. 酶法制備乳源ACE抑制肽[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā),2011,32(9):134-136.

[2]Fitzgerald R J,Meisel H. Milk protein-derived peptide inhibitors of angiotensin-I-converting enzyme[J]. British Journal of Nutrition,2000,84:33-37.

[3]洪偉. 酪蛋白中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制肽的研究[D]. 蕪湖:安徽工程大學(xué),2010.

[4]魏春燕. 酪蛋白非磷肽酶膜耦合法制備ACE抑制肽[D]. 無(wú)錫:江南大學(xué),2011.

[5]崔潔,孔祥珍,周惠明,等. 小麥面筋蛋白預(yù)處理及酶膜耦合連續(xù)反應(yīng)研究[J]. 食品工業(yè)科技,2011,32(6):188-191.

[6]熊治清,徐志宏,魏振承,等. 酶膜反應(yīng)器在蛋白酶解過(guò)程中的研究進(jìn)展[J]. 食品科技,2010,35(1):88-92.

[7]QU Wenjuan,MA Haile,ZHAO Weirui,et al. ACE-inhibitory peptides production from defatted wheat germ protein by continuous coupling of enzymatic hydrolysis and membrane separation:Modeling and experimental studies[J]. Chemical Engineering Journal,2013,226:139-145.

[8]丁青芝,馬海樂(lè),駱琳,等. 酶解-膜分離耦合技術(shù)制備米糠蛋白活性多肽的研究[J]. 高?；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào),2009,23(4):632-638.

[9]姜瞻梅,田波,吳剛,等. 酶解牛乳酪蛋白制備ACE抑制肽的研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào),2007,7(6):39-43.

[10]Seronei C C,ZHANG Wang,ZHANG Wang. Hydrolysis of whey protein isolate in a tangential flowfilter membrane reactor Ⅱ[J]. Journal of Membrane Science,2006,286:322-332.

[11]姚喜梅. 連續(xù)式酶膜耦合反應(yīng)制備魔芋葡甘露寡糖[D]. 北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2011.

[12]齊崴,何志敏,何明霞. 酶解反應(yīng)與膜分離耦合連續(xù)制備酪蛋白磷酸肽[J]. 化學(xué)工程,2006,34(4):43-46.

[13]劉妍妍,張麗萍. 牛乳酪蛋白源降血壓肽的分離及其分子量分布研究[J]. 中國(guó)乳品工業(yè),2006,34(5):26-28.

[14]徐鑫,蔡麗麗,劉國(guó)艷,等. 響應(yīng)曲面法優(yōu)化酶解條件制備乳源ACE抑制肽[J]. 食品科學(xué),2012,33(5):208-212.

[15]張艷,胡志和,閆星,等. 胃蛋白酶水解酪蛋白制備ACE抑制肽的條件[J]. 食品科學(xué),2010,31(14):42-46.

[16]OTTE J,SHALABY S M,ZAKORA M,et al. Angiotensin converting enzyme inhibitory activity of milk protein hydrolysates:Effect of substrate,enzyme and time of hydrolysis[J]. International Dairy Journal,2007,17:488-503.

[17]陳鈞輝,陶立,李俊,等. 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 北京:科學(xué)出版社,2003:59-61.

[18]吳瓊英,馬海樂(lè),駱琳,等. 高效液相色譜法測(cè)定血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑的活性[J]. 色譜,2005,23(1):79-81.

[19]陳耿華,王磊,王強(qiáng),等. 用于連續(xù)制備乳清蛋白ACE抑制肽的酶膜反應(yīng)器運(yùn)行條件優(yōu)化[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工,2011(9):4-7.

[20]YANG Sen,DING Wenyong,CHEN Hongzhang. Enzymatic hydrolysis of corn stalk in a hollow fiber ultrafiltration membrane reactor[J]. Biomass and Bioenergy,2009,33:332-336.

[21]黃文浩. 連續(xù)化酶膜耦合法制備高活性ACE抑制玉米肽研究[D]. 武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

[22]WU Shufen,QI Wei,LI Tonghe,et al. Simultaneous production of multi-functional peptides by pancreatic hydrolysis of bovine casein in an enzymatic membrane reactor via combinational chromatography[J]. Food Chemistry,2013,141:2944-2951.

[23]蔣菁莉,任發(fā)政,蔡華偉. 牛乳酪蛋白降血壓肽的超濾分離[J]. 食品科學(xué),2006,27(7):124-128.

[24]夏鎮(zhèn)波. 酪蛋白源血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽制備及分離純化研究[D]. 南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.

[25]李文,馬海樂(lè),王金斌. 酶解反應(yīng)與膜分離耦合連續(xù)制備紫菜降血壓肽[J]. 食品開(kāi)發(fā)與機(jī)械,2008(10):71-75.

ACE-inhibitory peptides derived from milk protein by continuous coupling of enzymatic hydrolysis and membrane separation without material feeding

GONG Yang,MA Hai-le*,WANG Yang,GOU Wen-lai,XIONG Jian,LIU Fang

(School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Jiangsu Provincial Key Laboratory for Food Physical Processing,Zhenjiang 212013,China)

To overcome disadvantage of traditional enzymatic hydrolysis and improve reaction effect,ACE-inhibitory peptides from milk protein were prepared by coupling of enzymatic hydrolysis and membrane separation. According to the comparison of protein retention,protease retention,membrane flux,permeates’ ACE-inhibitory activity and IC50,the molecular weight of ultra-filtration membrane was determined as 5000 u. The effects of reaction time,substrate concentration,enzymatic dosage and cycle pump speed on conversion ratio of protein were investigated respectively. The optimal conditions obtained from the single factor tests were:substrate concentration 7%(W/W),enzymatic dosage 2000 U/g,reaction time 100 min and cycle pump speed 100 r/min. Under the optimal conditions,conversion ratio of protein reached 53.16% with productivity of 39.59 g peptide·(g protease)-1and the inhibitory rate of ACE was 76.81%. Compared with the control group,the three contents were increased by 16.99%,16.61% and 18.55% respectively. The relative molecular weight of permeates was measured by high performance size exclusion chromatography(HPSEC). The results showed that the molecular weight could be effectively controlled by ultra-filtration and 94.62% of sample was less than 2253 u. Therefore,it is suggested that the reaction of coupling of enzymatic hydrolysis and membrane separation can provide a more effective method for the preparation of ACE-inhibitory peptides from milk protein.

milk protein;coupling of enzymatic hydrolysis and membrane separation;ACE-inhibitory peptides;conversion ratio of protein

2015-12-25

龔洋(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：食品分離及食品生物技術(shù)，E-mail：gongyangln@163.com。

馬海樂(lè)(1963-)，男，教授，研究方向：食品分離及食品生物技術(shù)，E-mail：mhl@ujs.edu.cn。

國(guó)家863計(jì)劃課題(2013AA102203)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)12-0166-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.024