響應(yīng)面法優(yōu)化菠蘿蜜果皮黃酮提取工藝

鄧夢琴,何夏怡,何慕怡,宋賢良,黃　葦,林曉瑛

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642)

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響應(yīng)面法優(yōu)化菠蘿蜜果皮黃酮提取工藝

鄧夢琴,何夏怡,何慕怡,宋賢良*,黃葦,林曉瑛

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642)

采用乙醇浸提法從菠蘿蜜果皮中提取黃酮,研究了液料比、乙醇濃度、提取時間和提取溫度等對菠蘿蜜果皮黃酮得率的影響并采用響應(yīng)面實驗設(shè)計和多元二次回歸分析優(yōu)化了此提取工藝。結(jié)果表明,乙醇濃度76%,料液比1∶22(g/mL),提取溫度68 ℃,提取時間2 h為最佳提取工藝條件。驗證實驗得到黃酮提取量為23.512 mg/g且黃酮對DPPH自由基的清除能力與VC相當(dāng)。各因素對菠蘿蜜黃酮得率的影響次序是:提取溫度>料液比>乙醇濃度>提取時間。因此,從菠蘿蜜果皮中也能獲得較高得率的黃酮,且該黃酮具有良好的抗氧化能力。

菠蘿蜜,黃酮,提取,響應(yīng)面法

菠蘿蜜(Artocarpus heterophyllus Lam.),又稱“樹菠蘿”、“木菠蘿”,是?？?Moraceae)桂木屬常綠喬木,素有“熱帶珍果”之稱[1-2]。據(jù)統(tǒng)計,我國熱帶地區(qū)菠蘿蜜種植面積達20萬畝,并有數(shù)家果肉加工廠,但菠蘿蜜可食用部分僅占果實的43.2%,而不可食的果皮果腱等約占40%[3],由于加工利用技術(shù)和相關(guān)研究的缺乏,大量菠蘿蜜果皮被丟棄成為農(nóng)業(yè)廢料,造成極大的資源浪費和環(huán)境污染。因此,研究菠蘿蜜皮渣的深加工及利用是提高農(nóng)業(yè)綜合生產(chǎn)能力與效益,保證農(nóng)業(yè)生產(chǎn)健康持續(xù)發(fā)展的必要途徑。

黃酮類化合物是植物的次級代謝產(chǎn)物,廣泛分布于自然界中。大量研究表明,黃酮類化合物具有抗氧化、抗菌消炎、改善血液循環(huán)等功效[4-6]。此外,黃酮作為天然色素、天然抗氧化劑等已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)[7]。近幾年來,從植物中分離提取黃酮類化合物開發(fā)保健食品、化妝品的研究也較多[8-9]。目前,國內(nèi)對菠蘿蜜中的黃酮類物質(zhì)研究甚少,多集中在菠蘿蜜葉的黃酮物質(zhì)研究[10,12],國外則側(cè)重于對菠蘿蜜根莖中黃酮物質(zhì)研究[13-14]。本研究以菠蘿蜜果皮為原料,采用有機溶劑浸提法提取黃酮類化合物,采用響應(yīng)面法優(yōu)化菠蘿蜜果皮中黃酮的提取工藝條件,以期為抗氧化保健食品的開發(fā)和新型天然抗氧化劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù),對提高菠蘿蜜加工副產(chǎn)物的生態(tài)效益、經(jīng)濟效益和社會效益具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菠蘿蜜皮廣州市農(nóng)貿(mào)市場;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品上海源葉生物科技有限公司;氫氧化鈉、氯化鈉、氯化鋁、亞硝酸鈉、乙醇等試劑均為分析純。

恒溫水浴鍋HH-4型,常州澳華儀器有限公司;紫外可見分光光度計752型,上海精密科學(xué)儀器有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱202型,廣州市富華測控科技有限公司;組織粉碎機FW100型,天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1提取工藝流程新鮮果皮清洗→烘干→粉碎→過篩(80目,-4 ℃冷藏備用)→溶劑提取→黃酮含量測定

溶劑提取過程:稱取5.0 g樣品置于250 mL錐形瓶中,加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液,一定溫度下浸提一定時間,流動水冷卻至室溫,抽濾,測量濾液體積,濾液以30%乙醇定容至100 mL容量瓶中備用。

1.2.2黃酮含量測定

1.2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg,用70%乙醇溶解并定容于100 mL容量瓶中(冷藏備用),分別準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲備液0、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10 mL于25 mL容量瓶中,加30%乙醇溶液至12.5 mL,加入5% 亞硝酸鈉溶液 0.75 mL,搖勻,放置6 min。加入 10% 硝酸鋁溶液 0.75 mL,搖勻,放置6 min。再加入1 mol/L氫氧化鈉溶液10 mL,用30%乙醇溶液定容,放置15 min,在波長510 nm處測定吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2樣品含量測定取3.0 mL提取液于25 mL容量瓶中,按1.2.2.1方法顯色,在510 nm處測定其吸光度,總黃酮含量計算公式如下:

Y=(C×V×D)/m

式中,Y-總黃酮提取量,mg/g;C-由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出的待測試液的總黃酮質(zhì)量濃度,mg/mL;V-待測試液的體積,mL;D-待測試液的稀釋倍數(shù);m-菠蘿蜜果皮粉質(zhì)量,g。

1.2.3單因素實驗在固定料液比(g/mL)為1∶25、提取溫度為70 ℃、提取時間為2 h的條件下,考察不同乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%)對黃酮提取量的影響;在固定乙醇濃度為70%、提取溫度為70 ℃、提取時間為2h的條件下,考察不同料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)對黃酮提取量的影響;在固定乙醇濃度為70%、料液比為1∶25、提取時間為2 h的條件下,考察不同提取溫度(50、60、70、80、90 ℃)對黃酮提取量的影響;在固定乙醇濃度為70%、料液比為1∶25、提取溫度為70 ℃的條件下,考察不同提取時間(1、2、3、4、5 h)對黃酮提取量的影響。

1.2.4響應(yīng)面法工藝優(yōu)化實驗在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,固定提取時間2 h,采用Design Expert 8.0 Trial建立3因素3水平的Box-Behnken模型,通過實驗確定最優(yōu)提取工藝。以乙醇濃度、料液比、提取溫度3個因素作為實驗因素,黃酮提取量為響應(yīng)值,自變量因素編碼及水平見表1。

1.2.5DPPH法測定抗氧化活性參考陳海光等[15]的方法,稍有改動。將菠蘿蜜果皮黃酮提取液稀釋10倍作為待測液,測得黃酮類物質(zhì)含量為0.153 mg/mL,以0.153 mg/mL的VC代替樣品做陽性對照,做3次平行。其中抗氧化劑的清除自由基能力采用清除DPPH自由基的IC50值表示,即DPPH自由基清除率為 50% 時所對應(yīng)的抗氧化劑溶液濃度。IC50值的測定通過根據(jù)不同濃度樣品的清除率作曲線求出。所需濃度越低,表明半清除率越高,清除效果越好。待測樣的DPPH自由基清除率按照以下公式進行計算:

式中,A0(對照):4.0 mL DPPH+0.5 mL無水乙醇;A1(反應(yīng)):4.0 mL DPPH+樣品溶液;A2(空白):4.0 mL無水乙醇+樣品溶液。

表1　Box-Behnken設(shè)計實驗因素水平及編碼Table 1　Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters tested in Box-Behnken experimental design

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0軟件進行方差顯著性檢驗;采用軟件 Design Expert 8.0 Trial對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析;采用origin7.5軟件作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1黃酮含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可看出,黃酮含量與吸光度呈線性關(guān)系。其回歸方程為y=1.1451x+0.003,相關(guān)性R2=0.9994,結(jié)果表明,黃酮含量在0～0.04 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The rutin standard curve

2.2單因素實驗結(jié)果

2.2.1乙醇濃度對黃酮提取量的影響由圖2可知,隨著乙醇濃度的增加,黃酮類化合物的提取量也隨之增大;乙醇濃度為70%時,提取液中黃酮含量最高,隨著乙醇濃度的繼續(xù)增加,黃酮含量反而隨之減少。其原因可能是當(dāng)乙醇濃度超過70%時,一方面會使提取粗品中雜質(zhì)含量增加,有效成分反而降低,影響提取物的有效含量;另一方面也可能由于乙醇濃度過高導(dǎo)致?lián)]發(fā)過大,同時一些醇溶性雜質(zhì),色素,親脂性強的成分溶出量增加,與黃酮化合物競爭和乙醇結(jié)合,從而導(dǎo)致黃酮類化合物提取率下降。因此,乙醇濃度為70%時,黃酮類化合物的提取效果最佳。

圖2　乙醇濃度對黃酮提取量的影響Fig.2　Effect of the alcohol concentration on the flavonoids extraction quantity

2.2.2料液比對黃酮提取量的影響由圖3可知,隨著料液比的增大,黃酮的提取量逐漸增加,而隨著料液比的繼續(xù)增大,菠蘿蜜果皮中黃酮的提取量變化基本趨于平緩。當(dāng)料液比為1∶25(g/mL)時,菠蘿蜜果皮中黃酮類物質(zhì)提取量相對最大。因為在一定范圍內(nèi),料液比的增大可以增加溶劑和原料的接觸效果,增大濃度差,有利于擴散速度的提高,從而可提高黃酮類化合物的浸出率。但當(dāng)浸提溶劑量過多時,黃酮的提取量未見顯著增多,繼續(xù)增大料液比則不利于節(jié)能環(huán)保,節(jié)約成本。因此,提取的料液比選取1∶25(g/mL)為宜。

圖3　料液比對黃酮提取量的影響Fig.3　Effect of the ratio of solid to liquid on the flavonoids extraction

2.2.3提取溫度對黃酮提取量的影響由圖4可知,菠蘿蜜果皮中黃酮類化合物的提取量隨著溫度的升高呈現(xiàn)先增加后減小的變化趨勢。當(dāng)提取溫度為50～70 ℃時,黃酮含量增加迅速,呈明顯的上升趨勢;當(dāng)溫度達到70 ℃時,黃酮的提取量最大;此后繼續(xù)升高提取溫度,黃酮含量明顯降低,提取溫度為80 ℃比70 ℃時黃酮提取量下降了17.97%。由此說明溫度的適度提高對植物組織的浸潤具有一定的促進作用,有利于有效成分黃酮的浸出,但是提取溫度過高會破壞黃酮的化學(xué)結(jié)構(gòu),并可能增加其他雜質(zhì)的溶出,進而使黃酮的提取率降低。因此,70 ℃是比較理想的提取溫度。

圖4　提取溫度對黃酮提取量的影響Fig.4　Effect of the extract temperature on the flavonoids extraction

2.2.4提取時間對黃酮提取量的影響由圖5可知,提取時間在1～2 h內(nèi),提取得到的黃酮類化合物提取量顯著增加,提取時間為2 h時,黃酮類化合物的提取量最高。當(dāng)提取時間超過2 h時,黃酮提取量卻隨之下降。這可能是因為黃酮類物質(zhì)具有抗氧化性,其本身易被氧化破壞,過長時間暴露在外,尤其是高溫提取時,其化學(xué)結(jié)構(gòu)遭到破壞,最終使得黃酮提取率下降[16]。另外,提取時間越長,能耗等其他經(jīng)濟成本也越大。因此,選定2 h為菠蘿蜜果皮黃酮類化合物的最佳提取時間。

圖5　提取時間對黃酮提取量的影響Fig.5　Effect of the extract time on the flavonoids extraction

2.3響應(yīng)曲面優(yōu)化實驗結(jié)果

2.3.1單因素方差分析利用SPSS 19.0軟件對單因素的乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取溫度(C)、提取時間(D)4個因素進行方差分析(結(jié)果如表2),由表2可知,乙醇濃度差異顯著(p<0.05);提取溫度和料液比,差異極顯著(p<0.01);而提取時間對黃酮提取量影響不顯著(p>0.05),故由單因素實驗結(jié)果方差分析可知,響應(yīng)面法可固定提取時間為2.0 h。

表2　單因素方差分析Table 2　One-way analysis of variance

注:**表示p<0.01,極顯著;*表示p<0.05,顯著。

2.3.2回歸模型的建立及統(tǒng)計檢驗響應(yīng)曲面優(yōu)化實驗結(jié)果見表3。采用軟件DesignExpert 8.0 Trial對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析,分析結(jié)果見表4。

表3　Box-Behnken實驗設(shè)計結(jié)果Table 3　Experiment result of Box-Behnken

表4　回歸方程系數(shù)顯著性檢驗表Table 4　Test of significance for regression coefficient

注:**表示p<0.01,極顯著;*表示p<0.05,顯著。

由方差分析表4可知,此模型的p<0.01,響應(yīng)面回歸模型達到極顯著水平,因此,這種實驗方法是可靠的;方程的失擬項表現(xiàn)不顯著(p=0.2703>0.05),說明表面模型回歸擬合良好,各因素值和響應(yīng)值之間的關(guān)系可以用此模型來函數(shù)化,此回歸方程來可對實驗結(jié)果進行分析預(yù)測。由表4中模型系數(shù)的顯著性檢驗數(shù)據(jù)可知,提取溫度的一次項對黃酮提取量的影響達到顯著水平(p<0.05),二次項的影響呈極顯著水平(p<0.01);溶劑濃度和料液比的一次項均未達到顯著水平,而溶劑濃度的二次項則達極顯著水平(p<0.01)。各因素的交互項對黃酮提取量的影響均有顯著影響,A與B交互作用顯著,B與C交互作用顯著,A和C交互作用極顯著,表明各影響因素與響應(yīng)值的關(guān)系中,二次項和交互項對響應(yīng)值有很大的關(guān)系。由F值可知,各因素對黃酮提取量的影響依次為:提取溫度(C)>料液比(B)>乙醇濃度(A)。各因素對黃酮提取量的影響不是簡單的線性關(guān)系,利用軟件對表3中實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸分析,得到各因子對黃酮提取量Y(mg/g)影響的二次多項回歸模型:

Y(mg/g)=22.30+0.27A-0.46B-0.65C-0.87AB-2.07AC-0.95BC-1.28A2-0.45B2-2.38C2

式(1)

2.3.3因子交互效應(yīng)分析由響應(yīng)面模型(1)繪制響應(yīng)面分析圖,見圖6至圖8,各圖顯示溶劑濃度、料液比、提取溫度中任意兩個變量取零水平時,其余2個變量對黃酮提取量的影響。

圖6　A和B交互作用曲面圖Fig.6　A and B interaction surface figure

圖7　A和C交互作用曲面圖Fig.7　A and C interaction surface figure

圖8　B和C交互作用曲面圖Fig.8　B and C interaction surface figure

響應(yīng)曲面坡度越陡峭,表明響應(yīng)值對于操作條件的改變越敏感;反之曲面坡度越平緩,操作條件的改變對響應(yīng)值的影響也就越小[10]。圖6～圖8 直觀地反映了各因素交互作用對響應(yīng)值的影響。由圖6可知,當(dāng)乙醇濃度一定時,隨著料液比的增大,黃酮的提取量呈逐漸上升的趨勢;而當(dāng)料液比的增大到一定值時,黃酮提取量變化會趨于平緩。當(dāng)料液比不變時,黃酮提取量隨乙醇濃度的升高呈現(xiàn)先升高后緩慢下降的趨勢。圖7表明,當(dāng)乙醇濃度保持不變時,隨著提取溫度的增加,黃酮的提取量先呈明顯上升的趨勢,在70 ℃以后則緩慢減少,當(dāng)提取溫度一定時,黃酮提取量先隨乙醇濃度的升高而顯著升高,當(dāng)乙醇濃度較高時,呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。圖8結(jié)果顯示,料液比不變時,隨著提取溫度的上升,黃酮提取量隨著溫度的上升而呈先增加后減少的趨勢;當(dāng)提取溫度不變且處于較低水平時,隨著料液比的增加,黃酮提取量變化不大;而當(dāng)提取溫度較高時,黃酮提取量呈緩慢的下降趨勢。

2.3.4最優(yōu)工藝參數(shù)及驗證實驗用Design-Expert 8.0軟件對二次多項式回歸方程進行計算求解,可得菠蘿蜜果皮中黃酮提取工藝的優(yōu)化值為:乙醇濃度75.73%,料液比1∶21.51,提取溫度67.83 ℃,提取時間2 h,黃酮提取量為22.642 mg/g。為方便實驗操作,菠蘿蜜果皮中黃酮提取工藝的最佳參數(shù)均取整數(shù),即乙醇濃度76%,料液比1∶22,提取溫度68 ℃,提取時間2 h。在此條件下進行驗證實驗,黃酮提取量為23.512 mg/g,與理論預(yù)測值的相對誤差為3.84%。

2.4DPPH自由基清除能力

DPPH·是一種化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定的以氮為中心的自由基,不易被清除,若受試物能夠清除它,則表示受試物具有較強的自由基清除能力。從圖9可知,菠蘿蜜果皮黃酮對DPPH·自由基具有較強的清除能力,在較低的濃度下即可達到較高的清除率;隨著黃酮含量的增大,清除能力增強,并呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系,其清除能力與0.1 mg/mlVC對照液相比,呈現(xiàn)一致的變化趨勢,且清除能力略低于等濃度的VC。經(jīng)測得提取液的IC50=0.026 mg/ml,略大于VC的IC50=0.024 mg/ml。說明菠蘿蜜果皮黃酮提取液具有較好的體外抗氧化能力。

圖9　菠蘿蜜果皮黃酮對DPPH·清除作用Fig.9　Scavenging effects of Jackfruit peel flavonoid DPPH· radical

3　結(jié)論

本實驗以菠蘿蜜果皮為提取原料,在單因素實驗的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法(RSM)進一步優(yōu)化提取工藝,建立了提取菠蘿蜜果皮黃酮的二次多項數(shù)學(xué)模型,該模型極顯著,且擬合情況良好。各因素對菠蘿蜜果皮中黃酮提取量的影響次序為:提取溫度>料液比>乙醇濃度>提取時間。最佳提取工藝條件為乙醇濃度76%,料液比1∶22(g/mL),提取溫度68 ℃,提取時間2 h。此條件下黃酮提取量為23.512 mg/g。并通過測定其對DPPH自由基的清除能力來評價其體外抗氧化性,結(jié)果表明隨黃酮含量增加,清除能力增強,測得其IC50為0.026 mg/mL,與VC的IC50=0.024 mg/mL對比,可以看出菠蘿蜜果皮中的黃酮與VC有幾乎持平的自由基清除率,說明其具有較好的體外抗氧能力。

菠蘿蜜常用于鮮食,其中非可食部分的果皮占全果的比重大,通過對菠蘿蜜果皮中黃酮物質(zhì)的提取及其功能活性的研究,將為菠蘿蜜的研究提供一個更廣闊的開發(fā)應(yīng)用途徑。隨著科學(xué)技術(shù)和消費理念的進步,果蔬植物中的天然活性物質(zhì)的開發(fā)日漸成為研究熱點,而菠蘿蜜果皮的大量、廉價、易獲取的特點,具有很大的待開發(fā)潛力。

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Optimization of flavonoids extraction from jackfruit peel by response surface methodology

DENG Meng-qin,HE Xia-yi,HE Mu-yi,SONG Xian-liang*,HUANG Wei,LIN Xiao-ying

(College of Food Science,South China Agricultural Unversity,Guangzhou 510642,China)

Flavonoids was extracted from jackfruit peel with the use of ethanol,and the effect of factors on the yield of jackfruit peel flavone was investigated,including liquid ratio,ethanol concentration,extraction time and extraction temperature. The response surface experiment design and multiple quadratic regression analysis were ordered to optimize the extraction technology.The results showed that the optimum conditions was as follows:76% ethanol concentration,solid-liquid ratio and(g/mL),extraction temperature 68 ℃,extracting time 2 h. Flavonoids extraction quantity iof 23.512 mg/g was obtained from verified experiment,and the DPPH free radical scavenging capacity of flavonoids was equal with vitamin C. Nevertheless,the influence order was:extraction temperature>solid-liquid ratio>ethanol concentration>extraction time.Therefore,relatively high flavonoids yield was achieved from jackfruit peel,and the flavonoids had a favourable antioxidant capacity.

Jackfruit;flavonoids;extraction;response surface methodology

2015-08-04

鄧夢琴(1991-)，女，碩士，研究方向：食品加工，E-mail:dmq503592509@163.com。

宋賢良(1969-)，男，博士，副教授，從事食品加工新技術(shù)的研究，E-mail:songx12000@163.com。

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303077)。

TS255.1

B

1002-0306(2016)05-0222-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.035