多重脅迫對嗜鹽四聯(lián)球菌CGMCC 3792存活率及細(xì)胞成分的影響

何桂強(qiáng),馮　笑,吳重德,黃　鈞,周榮清

(四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院,皮革化學(xué)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川成都 610065)

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多重脅迫對嗜鹽四聯(lián)球菌CGMCC 3792存活率及細(xì)胞成分的影響

何桂強(qiáng),馮笑,吳重德*,黃鈞,周榮清

(四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院,皮革化學(xué)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川成都 610065)

本研究以嗜鹽四聯(lián)球菌(TetragenococcushalophilusCGMCC 3792)為實(shí)驗(yàn)菌株,考察了單因素(酸、熱、鹽)脅迫和交互保護(hù)對其存活的影響。結(jié)果表明,T.halophilusCGMCC 3792在pH4.0和45 ℃預(yù)適應(yīng)處理60 min后細(xì)胞對酸致死脅迫(pH2.5,60 min)的存活率分別提高了10.6倍和8.8倍。此外,還考察了酸脅迫對細(xì)胞膜不飽和脂肪酸和胞內(nèi)氨基酸含量的影響,結(jié)果表明,酸預(yù)適應(yīng)后再經(jīng)酸致死脅迫導(dǎo)致細(xì)胞膜不飽和脂肪酸18∶1n-9和18∶2n-6,9含量增加,分別是直接經(jīng)酸致死脅迫的2.3倍和2.0倍;同時,分析胞內(nèi)氨基酸含量,胞內(nèi)谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸和異亮氨酸濃度分別是直接經(jīng)酸致死脅迫的2.5倍、2.4倍、2.2倍和2.7倍。研究結(jié)果將有助于進(jìn)一步解析嗜鹽四聯(lián)球菌環(huán)境脅迫抗性的生理機(jī)制。

嗜鹽四聯(lián)球菌,環(huán)境脅迫,交互保護(hù),膜脂肪酸,胞內(nèi)氨基酸

嗜鹽四聯(lián)球菌(Tetragenococcushalophilus)的代謝產(chǎn)物乳酸等小分子有機(jī)酸,不僅能通過縮合反應(yīng)與醇類產(chǎn)生酯類組分,賦予產(chǎn)品獨(dú)特的風(fēng)味,而且能使體系的pH降低抑制有害微生物,如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等的生長[1-2]。因此,嗜鹽四聯(lián)球菌已廣泛應(yīng)用于高鹽發(fā)酵調(diào)味品(醬油、魚露、豆醬)[3-5]的生產(chǎn)中。不同類型發(fā)酵調(diào)味品生產(chǎn)中,其鹽分、酸度、溶氧等參數(shù)控制有較大差異,波動范圍也不同。多重因素影響著T.halophilus的正常生理代謝,致使其難以充分發(fā)揮作用。由此可見,提高其對環(huán)境脅迫的抗性,具有重要意義。

目前對于提高微生物對環(huán)境脅迫抗性的策略主要有:一是從脅迫環(huán)境中直接篩選耐受菌株;二是根據(jù)微生物脅迫機(jī)理的研究定向改造微生物菌種,從而提高其耐受性[6]。然而在實(shí)際生產(chǎn)中,微生物所遇到的環(huán)境脅迫是復(fù)雜和交叉的,往往同時出現(xiàn)。因此,通過直接篩選的方法容易漏掉一些有應(yīng)用潛力的耐受菌株,而對脅迫機(jī)理的研究卻逐漸成熟并為篩選耐受菌株提供了新的思路。Zhang等[7]發(fā)現(xiàn)在酸脅迫條件下干酪乳桿菌進(jìn)化菌株比原始菌株積累更多的精氨酸,并通過外源添加精氨酸至L.casei酸脅迫培養(yǎng)基中,L.casei存活率顯著提高。已有的研究表明微生物經(jīng)一種環(huán)境脅迫后對其他多種環(huán)境脅迫的抗性顯著提高,這種現(xiàn)象被稱為“交互保護(hù)”。交互保護(hù)作為細(xì)胞對環(huán)境脅迫中的一種應(yīng)激反應(yīng),在提高微生物對環(huán)境脅迫的耐受性方面具有重要作用。薛峰等[8]研究了不同預(yù)適應(yīng)條件對干酪乳桿菌ATCC393TM存活的影響,其中經(jīng)pH4.0的鹽酸預(yù)適應(yīng)90 min后,干酪乳桿菌ATCC393TM對熱脅迫(70 ℃,90 min)和氧脅迫(10 mol/L H2O2,90 min)的存活率分別提高了305倍和173倍。

本文以T.halophilusCGMCC 3792為研究對象,研究其在單因素脅迫和交互脅迫過程中細(xì)胞存活率的變化,并對細(xì)胞膜不飽和脂肪酸和胞內(nèi)氨基酸進(jìn)行了分析,旨在為提高其環(huán)境脅迫抗性以及工業(yè)應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

表1　單因素脅迫種類和脅迫條件Table 1　Types and conditions of stress in single-factor experiment

1　材料與方法

1.1材料與儀器

嗜鹽四聯(lián)球菌(T.halophilusCGMCC 3792),實(shí)驗(yàn)室從醬油醪中分離,經(jīng)形態(tài)、生理生化特性實(shí)驗(yàn)和16S rDNA測序鑒定,保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

M17肉湯購于OXOID公司。種子培養(yǎng)基:M17肉湯,加入6% NaCl,補(bǔ)充終濃度為5 g/L的葡萄糖。脅迫培養(yǎng)基:M17肉湯,補(bǔ)充終濃度為5 g/L的葡萄糖,分別加入不同濃度的NaCl或鹽酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的鹽濃度和pH。其他化學(xué)試劑均為分析純。

可見光分光光度計(Spectrumlab22PC)美國PerkinElmer公司;高速冷凍離心機(jī)(GL-20G-C)上海安亭科學(xué)儀器有限公;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Trace DSQ II)美國Thermo公司;氨基酸分析儀(A300)德國默曼博爾公司。

1.2單因素脅迫實(shí)驗(yàn)

先將種子培養(yǎng)液活化,然后以5%接種量接入M17培養(yǎng)基中,在30 ℃條件下靜置培養(yǎng)至OD600值為2.5時,取1 mL培養(yǎng)物離心(10000×g,4 ℃,5 min),然后用無菌生理鹽水離心洗滌兩次,收集菌體重懸于等體積的脅迫培養(yǎng)基中(表1)。脅迫后的細(xì)胞用無菌生理鹽水離心洗滌后,稀釋成不同梯度,取10 μL稀釋液點(diǎn)種于M17平板中并進(jìn)行菌落計數(shù)。

1.3交互保護(hù)實(shí)驗(yàn)

依據(jù)1.2單因素脅迫實(shí)驗(yàn)收集菌體,將菌體分別重懸在三種脅迫種類的預(yù)適應(yīng)(pH4.0,60 min;45 ℃,60 min和6% NaCl,60 min)培養(yǎng)基中,預(yù)適應(yīng)后的細(xì)胞用無菌生理鹽水離心洗滌兩次,分別得到各預(yù)適應(yīng)條件處理后的細(xì)胞,稀釋成不同梯度后取10 μL重懸液點(diǎn)種于M17培養(yǎng)基平板中并進(jìn)行菌落計數(shù)。依據(jù)上述預(yù)適應(yīng)處理后的菌體細(xì)胞在三種致死脅迫條件(pH2.5,60 min;55 ℃,60 min和36% NaCl,120 min)下進(jìn)行處理,以前述方法點(diǎn)種于M17培養(yǎng)基平板中并計數(shù)。

1.4細(xì)胞存活率的計算

取10 μL菌液以不同稀釋度點(diǎn)種于M17培養(yǎng)基平板上測定單位體積菌落數(shù)(colony forming per unit,CFU/mL)。每個稀釋梯度均設(shè)3個平板為平行,將平板放置在30 ℃下培養(yǎng)36 h,計數(shù)菌落數(shù)。以pH6.8、30 ℃和0% NaCl處理得到的菌落數(shù)為100%的存活率,經(jīng)酸、熱和鹽不同條件脅迫得到的菌落數(shù)分別與pH6.8、30 ℃和0% NaCl處理得到的菌落數(shù)之比即為不同條件脅迫的存活率。

1.5細(xì)胞膜脂肪酸成分的分析

分別取25 mL OD600為2.5的培養(yǎng)液依據(jù)1.2收集菌體,將菌體酸預(yù)適應(yīng)處理(pH4.0,60 min)后,進(jìn)行酸致死脅迫(pH2.5,60 min),測定干重(dry weight,DW)。細(xì)胞膜脂肪酸的提取和檢測參考文獻(xiàn)[9]。C9-C20的脂肪酸可根據(jù)各自的保留時間和質(zhì)譜范圍在圖庫中進(jìn)行查找,每個樣品重復(fù)測定3次。

1.6胞內(nèi)氨基酸含量測定

取10 mL OD600值為2.5的培養(yǎng)液依據(jù)1.2收集菌體,將菌體酸預(yù)適應(yīng)處理(pH4.0,60 min)后,進(jìn)行酸致死脅迫(pH2.5,60 min),然后用無菌生理鹽水離心洗滌兩次,重懸于1 mL的50 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中,置于沸水中煮沸15 min,離心(10000×g,4 ℃,10 min),取上清液。在上清液中加入100 μL 10%的磺基水楊酸,沉淀蛋白,然后經(jīng)0.22 μm過濾器過濾后,用氨基酸分析儀測定,測定條件參考文獻(xiàn)[10]。細(xì)胞中游離氨基酸濃度由標(biāo)準(zhǔn)氨基酸校正計算。

1.7數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析與制圖采用Origin 8.5,顯著性分析則采用SPSS 19.0進(jìn)行。所有結(jié)果均有三次平行實(shí)驗(yàn)。

圖1　酸脅迫(A)、熱脅迫(B)和鹽脅迫(C) 對嗜鹽四聯(lián)球菌CGMCC 3792存活率的影響Fig.1　Effect of acid(A),heat(B),and salt(C)stresses on the survival of T. halophilus CGMCC 3792

2　結(jié)果與討論

2.1單因素脅迫對菌株CGMCC 3792存活率的影響

pH、溫度、鹽濃度對T.halophilusCGMCC 3792存活的影響如圖1所示。pH在3.0～6.8的范圍時,pH降低使細(xì)胞存活率小幅度減少;然而,當(dāng)pH從3.0降低到2.5時,其存活率從67.5%顯著降低到6.17%(圖1A)。溫度在30～40 ℃范圍變化時,對細(xì)胞存活率的影響較小,繼續(xù)提高熱處理溫度時,顯著影響其存活率,55 ℃時,存活率降至3.51%(圖1B)。在0%～36% NaCl濃度范圍內(nèi),隨其濃度增加,細(xì)胞存活率呈現(xiàn)下降的趨勢;但在36%NaCl鹽脅迫處理120 min后,其存活率仍在10%以上(圖1C)。

綜上所述,分別選取pH4.0、45 ℃和6% NaCl濃度處理60 min作為T.halophilusCGMCC 3792的酸、熱和鹽預(yù)適應(yīng)條件;而pH2.5、55 ℃處理60 min和36% NaCl濃度處理120 min分別作為酸、熱和鹽脅迫的致死條件。

2.2交互保護(hù)對菌株CGMCC 3792存活率的影響

分別考察了細(xì)胞經(jīng)預(yù)適應(yīng)處理后再經(jīng)致死脅迫的存活率變化。圖2為細(xì)胞分別經(jīng)pH4.5、45 ℃和6% NaCl預(yù)適應(yīng)處理60 min后,再經(jīng)酸致死(pH2.5,60 min)、熱致死(55 ℃,60 min)和鹽致死(36% NaCl,120 min)脅迫,存活率的增加倍數(shù)。

圖2　預(yù)適應(yīng)處理后嗜鹽四聯(lián)球菌CGMCC 3792 在酸(A)、熱(B)和鹽(C)致死條件下的存活率變化Fig.2　Survival rate of T. halophilus CGMCC 3792 under lethal acid(A),heat(B),and salt(C)stress after pre-adaptation注:圖柱上方星號表示與對照(不預(yù)適應(yīng)) 比較具有顯著性差異(p<0.05)。

在酸致死脅迫中,與未經(jīng)預(yù)適應(yīng)的細(xì)胞相比,經(jīng)酸、熱和鹽預(yù)適應(yīng)處理后,細(xì)胞存活率分別提高了10.6倍、8.8倍和1.5倍(圖2A)。酸適應(yīng)性反應(yīng)是乳酸菌中常見的一種應(yīng)激反應(yīng),酸預(yù)適應(yīng)后,能誘導(dǎo)細(xì)胞的酸耐受反應(yīng)機(jī)制,從而提高細(xì)胞在酸脅迫環(huán)境下的存活率。Hartke等[11]報道,乳酸乳球菌乳亞種細(xì)胞在pH5.5酸預(yù)處理30 min后,再經(jīng)pH3.9的致死酸脅迫處理,其存活率比未經(jīng)預(yù)適應(yīng)的細(xì)胞顯著提高。在熱致死脅迫中,經(jīng)熱和鹽預(yù)適應(yīng)后,細(xì)胞存活率分別提高了2.3倍和2.1倍,而經(jīng)酸預(yù)適應(yīng)處理的細(xì)胞存活率與對照相比不增反降(圖2B)。鹽預(yù)適應(yīng)處理后,細(xì)胞存活率提高可能與蛋白表達(dá)有關(guān)。有研究表明,L.lactis在遭遇鹽脅迫時,12種上調(diào)蛋白質(zhì)都屬于熱脅迫應(yīng)激蛋白[12]。此外,考察了預(yù)適應(yīng)后對熱致死脅迫細(xì)胞存活率的變化,結(jié)果表明,經(jīng)酸、熱和鹽預(yù)適應(yīng)處理后,細(xì)胞存活率分別提高了2.2倍、3.0倍和2.3倍(圖2C)。熱預(yù)適應(yīng)后,存活率的提高與熱脅迫應(yīng)激蛋白密切相關(guān)。Broadbent等[13]曾報道了L.helveticusLH212在52 ℃預(yù)適應(yīng)處理20 min后,再經(jīng)歷63 ℃致死脅迫時與未經(jīng)預(yù)適應(yīng)處理的相比,細(xì)胞存活率提高了11倍,通過二維凝膠電泳分析,還檢測到了一些熱脅迫應(yīng)激蛋白DnaK,GroEL,ClpB,GrpE,使細(xì)胞的耐熱性增強(qiáng)。

圖3　酸脅迫對細(xì)胞膜脂肪酸含量的影響Fig.3　Effect of acid stresson membrane fatty acids distribution.(A)saturated fatty acids, (B)unsaturated fatty acids 注:圖柱上方星號表示與對照(脅迫前) 比較具有顯著性差異(p<0.05)，圖4同。

2.3酸脅迫對細(xì)胞膜脂肪酸組分的影響

圖3所示為酸脅迫對細(xì)胞膜脂肪酸組分的影響。由圖可知,酸脅迫后,飽和脂肪酸含量(14∶0,15∶0,16∶0和20∶0)有所降低(圖3A);但是,與脅迫前相比的不飽和脂肪酸含量(18∶1n-9和18∶2n-6,9)在酸預(yù)適應(yīng)后增加,直接經(jīng)酸致死脅迫后進(jìn)一步增加(圖3B)。特別的是,經(jīng)過酸預(yù)適應(yīng)再經(jīng)酸致死脅迫的不飽和脂肪酸含量(18∶1n-9和18∶2n-6,9)顯著增加,分別是直接經(jīng)酸致死脅迫的2.3倍和2.0倍。調(diào)節(jié)細(xì)胞膜脂肪酸分布是細(xì)胞抵御環(huán)境脅迫的重要機(jī)制之一,細(xì)胞可以通過改變脂肪酸的組分來適應(yīng)環(huán)境脅迫[14]。通過考察酸脅迫對細(xì)胞膜脂肪酸含量的變化得知,酸脅迫后引起飽和脂肪酸含量降低,而不飽和脂肪酸含量顯著升高,這與酸脅迫引起干酪乳桿菌細(xì)胞膜飽和脂肪酸(C14∶0,C15∶0,C16∶0)比例降低,而不飽和脂肪酸18∶1n-9和18∶1n-11都有不同程度的增加結(jié)果是一致的[15]。結(jié)果表明,增加不飽和脂肪酸含量是嗜鹽四聯(lián)球菌的一種酸存活機(jī)制。

2.4酸脅迫對胞內(nèi)氨基酸含量的影響

酸脅迫對嗜鹽四聯(lián)球菌胞內(nèi)氨基酸含量的影響,如圖4所示。酸預(yù)適應(yīng)后,谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸和異亮氨酸含量降低幅度小;但是酸脅迫后,含量顯著降低,分別僅為脅迫前的20.8%、21.2%、15.3%和18.3%。特別的是,經(jīng)過酸預(yù)適應(yīng)后再應(yīng)對酸致死脅迫的胞內(nèi)氨基酸含量分別是直接經(jīng)歷酸致死脅迫的2.5倍、2.4倍、2.2倍和2.7倍。

圖4　酸脅迫對胞內(nèi)氨基酸含量的影響Fig.4　Effect of acid stress on intracellular pools of amino acid

在谷氨酸脫羧酶途徑中,脫羧反應(yīng)不僅可以消耗胞內(nèi)的H+,而且生成堿性略強(qiáng)的γ-氨基丁酸,因此,谷氨酸的積累能夠很好地阻止細(xì)胞內(nèi)的pH降低,維持穩(wěn)定的pH范圍[16]。此外,脫羧反應(yīng)與電子傳遞的偶合可產(chǎn)生ATP及質(zhì)子推動力也有利于細(xì)胞的存活。有研究報道,在外源添加天冬氨酸可以使L.casei在酸脅迫條件下(pH4.3)的生長性能和存活率顯著增加[17],表明酸脅迫條件下積累天冬氨酸含量可以提高細(xì)胞的酸耐受性能。亮氨酸和異亮氨酸作為支鏈氨基酸在胞內(nèi)的積累是乳酸菌常見的一種酸應(yīng)激反應(yīng)[17],這是因?yàn)橹ф湴被岬暮铣尚枰谋岷蚇ADH,同時減少甲酸的含量,使胞內(nèi)酸性減弱。因此,支鏈氨基酸的脫氨作用被認(rèn)為是維持胞內(nèi)pH穩(wěn)定的一種機(jī)制[18]。

3　結(jié)論

本研究通過考察了嗜鹽四聯(lián)球菌在單因素脅迫和交互脅迫過程中細(xì)胞存活率的變化,并對酸脅迫處理后的細(xì)胞膜脂肪酸和胞內(nèi)氨基酸進(jìn)行了分析。研究發(fā)現(xiàn),酸預(yù)適應(yīng)處理與未經(jīng)預(yù)適應(yīng)的細(xì)胞相比,其在應(yīng)對酸致死脅迫時存活率提高了10.6倍(圖2)。酸預(yù)適應(yīng)后再經(jīng)歷酸致死脅迫與直接經(jīng)歷酸致死脅迫相比,細(xì)胞膜不飽和脂肪酸(18∶1n-9和18∶2n-6,9)和胞內(nèi)氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸和亮氨酸)含量更高,可以提高其酸耐受性。上述研究結(jié)果有助于進(jìn)一步認(rèn)識嗜鹽四聯(lián)球菌抵抗環(huán)境脅迫的生理機(jī)制。

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Influence of multiple stresses on the survival and cellar constituent ofTetragenococcushalophilusCGMCC 3792

HE Gui-qiang,FENG Xiao,WU Chong-de*,HUANG Jun,ZHOU Rong-qing

(College of Light Industry,Textile & Food Engineering,and Key Laboratory of Leather Chemistry and Engineering,Ministry of Education,Sichuan University,Chengdu 610065,China)

In this study,the influence ofsingle-stress(acid,heat,or salt)and cross-protection on the survival ofTetragenococcushalophilusCGMCC 3792 was investigated. The results indicated that cells were pre-adapted at pH4.0 or 45 ℃ for 60 min,and then acid challenged at pH2.5 for 60 min,and the survival rate increased 10.6-fold and 8.8-fold,respectively. Analysis of membrane fatty acids and intracellular amino acids in acid-adapted cells showed that unsaturated fatty acids18∶1n-9 and 18∶2n-6,9 were 2.3-fold and 2.0-fold higher than that in cells directly subjected to lethal acid stress,respectively. In addition,the intracellular concentrations of glutamate,aspartate,leucine,and isoleucinewere 2.5-fold,2.4-fold,2.2-fold and 2.7-fold higher than those in control cells,respectively. Results presented in this study may contribute to further elucidate the physiological mechanisms employed byT.halophilusduring environmental stresses.

T.halophilus;environmental stresses;cross-protection;membrane fatty acid;intracellular amino acid

2015-08-04

何桂強(qiáng)(1990-)，男，碩士研究生，研究方向：微生物生理學(xué)與生物化學(xué)，E-mail:guiqianghe@163.com。

吳重德(1982-)，男，博士，副教授，研究方向：微生物生理學(xué)與生物化學(xué)，E-mail:wuchongde@163.com。

國家自然科學(xué)基金(31301546);中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(SCU2015D008)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)05-0182-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.027