高速逆流色譜法分離純化艾葉中的異綠原酸A

李　熹,邱細(xì)敏,*,任達(dá)兵,秦燕華

(1.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410000; 2.中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410083)

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高速逆流色譜法分離純化艾葉中的異綠原酸A

李熹1,邱細(xì)敏1,*,任達(dá)兵2,秦燕華2

(1.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410000; 2.中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410083)

應(yīng)用制備型高速逆流色譜法(HSCCC)分離純化艾葉中的異綠原酸A。選用弱極性溶劑體系正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(3∶7∶4∶6,V/V)為兩相溶劑系統(tǒng),上相為固定相,下相為流動(dòng)相,在流速2 mL/min,轉(zhuǎn)速900 r/min,檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm的條件下對(duì)粗提物進(jìn)行制備分離,一次進(jìn)樣25 mg,可得到11 mg樣品。利用高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)樣品的純度為99.01%。將得到的樣品進(jìn)行高效液相-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜(LCMS-IT-TOF)、核磁共振氫譜(1H-NMR)檢測(cè)確定其化學(xué)結(jié)構(gòu),并確定該樣品為異綠原酸A。實(shí)驗(yàn)表明制備型高速逆流色譜可以成功地將艾葉中的異綠原酸A進(jìn)行分離純化,該方法分離效率高,對(duì)異綠原酸A在食品醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。

艾葉,異綠原酸A,高速逆流色譜法,分離純化

Separation and purification of isochlorogenic acid A

2.College of Chemistry and Chemical Engineering,Central South University,Changsha 410083,China)

艾葉(Artemisiaargyifolium)為菊科(Compositae)艾屬(Artemisia)多年生草本植物[1],又名冰臺(tái)、遏草、艾青等,是中醫(yī)臨床常用藥之一,在全國(guó)均有生長(zhǎng)?！吨袊?guó)藥典》記載其具有散寒止痛、溫經(jīng)止血、祛濕止癢之功效[2]。目前對(duì)艾葉化學(xué)成分的研究主要集中在揮發(fā)油及黃酮類化合物上,而對(duì)酚酸類成分的研究報(bào)道甚少。有研究發(fā)現(xiàn),艾葉中的酚酸類成分——異綠原酸A具有多種生物活性,包括抗?jié)僛3]、抗乙肝[4]、抗賈第蟲(chóng)[5]、抗HIV[6]等,其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。目前,對(duì)異綠原酸A的分離純化主要采取硅膠柱層析等方法,但其得率低,分離過(guò)程耗時(shí)復(fù)雜,限制了其進(jìn)一步藥理活性及臨床研究。

圖1　異綠原酸A的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1　Chemical structure of isochlorogenic acid A

高速逆流色譜(high-speed counter-current chromatography,HSCCC)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一種新型液-液分配色譜技術(shù)。與傳統(tǒng)的固液分配色譜技術(shù)相比,它具有制備量大、無(wú)固定相的非特異性吸收、樣品回收率高、分析時(shí)間短、重現(xiàn)性好等顯著優(yōu)點(diǎn)[7],經(jīng)過(guò)三十多年的發(fā)展,已廣泛應(yīng)用于中藥成分分離、天然產(chǎn)物化學(xué)、保健食品等領(lǐng)域。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)測(cè)定待測(cè)組分在不同溶劑體系中的分配系數(shù)K,篩選出最佳溶劑體系,運(yùn)用高速逆流色譜法分離純化艾葉中的異綠原酸A,為全面研究艾葉中的活性成分提供依據(jù),以期建立高效快速制備艾葉中異綠原酸A的方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

艾葉購(gòu)于北京同仁堂,湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院生藥教研室鑒定為菊科植物艾(ArtemisiaargyiLévl,etVant)的干燥葉;正己烷、乙酸乙酯、乙醇、冰乙酸(分析純)上海泰坦科技股份有限公司;乙腈(色譜純)瑞典歐普森公司;水超純水;氘代DMSO(0.03% TMS)瑞士ARMAR公司。

SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵河南鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器江蘇昆山市超聲儀器有限公司;TBE300B型高速逆流色譜儀(HSCCC,配有HX-1050恒溫循環(huán)器、TBP-50A泵、TBD-2000紫外檢測(cè)器、BSZ-100自動(dòng)部分收集器)上海同田生化技術(shù)有限公司;UltiMate3000型高效液相色譜儀(HPLC)賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;Spherigel C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱 天津市泰斯特儀器有限公司;BOC005高效液相-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(LCMS-IT-TOF)島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司;AVANCE Ⅲ 400MHZ型核磁共振波譜儀瑞士布魯克公司

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1艾葉粗樣的提取與純化將烘干的艾葉用粉粹機(jī)粉碎,過(guò)60目篩。精確稱取50 g粉末,加入10倍體積80%的甲醇溶液,用超聲波提取法(超聲功率200 W,40 min,40 ℃)提取2次,合并懸干。用適量水溶解懸干樣,以1∶1的料液比用正己烷萃取兩次脫脂后,同樣以1∶1的料液比用乙酸乙酯萃取2次,將乙酸乙酯層合并,在45 ℃下減壓濃縮懸干得到艾葉粗樣,供高速逆流色譜使用。

1.2.2高效液相色譜(HPLC)條件HPLC色譜儀:Thermo Fisher Ultimate 3000;色譜柱:Spherigel C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫:25 ℃;流速:1.0 mL/min,進(jìn)樣質(zhì)量:2 mg樣品溶于1 mL甲醇中;進(jìn)樣體積:20 μL;檢測(cè)器:二極管陣列檢測(cè)器(Diode array detector,DAD,200～800 nm);流動(dòng)相:A(乙腈),B(0.4%冰乙酸):0 min,10% A;13 min,25% A;20 min,35% A;23 min,40% A。檢測(cè)波長(zhǎng)為254、280、325、360 nm,以280 nm為輸出波長(zhǎng)。

1.2.3分配系數(shù)(K)的測(cè)定稱取4 mg粗提樣品,分別溶于不同體積比的正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水體系中,取等體積的上下相(2 mL)懸干,用等體積(2 mL)甲醇溶解后按照1.2.2中的HPLC方法進(jìn)行檢測(cè),記錄各樣品的峰面積,按照公式(1)計(jì)算分配系數(shù)[8]。

式(1)

式中,K為分配系數(shù);AU為組分在上相的峰面積(mAU·s);AL為組分在下相的峰面積(mAU·s)。

1.2.4高速逆流色譜(HSCCC)分離純化異綠原酸A根據(jù)高速逆流色譜法分離異綠原酸的相關(guān)報(bào)道[10-11],選擇5種溶劑體系測(cè)定目標(biāo)物的分配系數(shù)K,結(jié)合上機(jī)結(jié)果選出最優(yōu)溶劑體系。按照不同的體積比在分液漏斗中配制1000 mL溶劑,充分振搖后靜置分層,以上相為固定相(有機(jī)相),下相為流動(dòng)相(水相),超聲脫氣30 min,用等體積的上下相(5 mL)溶解懸干后的粗樣。打開(kāi)高速逆流色譜系統(tǒng),當(dāng)恒溫循環(huán)器溫度達(dá)到設(shè)定溫度(25 ℃)時(shí),以20.0 mL/min的流速泵入固定相,等到色譜柱已充滿,接樣尾端流出20 mL左右液體時(shí),開(kāi)啟轉(zhuǎn)速調(diào)至900 r/min,待穩(wěn)定后以2.0 mL/min的流速泵入流動(dòng)相,當(dāng)接樣量筒中出現(xiàn)液體分層,此時(shí)顯示已達(dá)到流體力學(xué)平衡,把樣品注入系統(tǒng),在280 nm下對(duì)流出組分進(jìn)行檢測(cè)并根據(jù)高速逆流色譜圖設(shè)定每管3 min、2 mL/min對(duì)流出液進(jìn)行自動(dòng)接樣。

1.2.5純度檢測(cè)及結(jié)構(gòu)鑒定按照1.2.2的高效液相色譜條件,將HSCCC分離收集得到的流分用HPLC進(jìn)行檢測(cè),對(duì)相同組分進(jìn)行濃縮合并,并根據(jù)面積歸一化法確定化合物的純度[10]。采用高效液相-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜(LCMS-IT-TOF)、核磁共振氫譜(1H-NMR)對(duì)分離得到的樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,核磁共振氫譜以氘代二甲基亞砜(DMSO)為溶劑,以四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo)物。

2　結(jié)果與分析

2.1分配系數(shù)K的測(cè)定及溶劑系統(tǒng)的選擇

研究表明[9],若目標(biāo)化合物在溶劑體系中的K值在0.5～2之間,則能得到較好的分離。本文選取應(yīng)用較為廣泛的四元體系正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水,對(duì)不同配比溶劑體系中目標(biāo)化合物的K值進(jìn)行考察。由表1可知,溶劑體系1和5的K值較小,目標(biāo)成分出峰太快,峰之間的分離度較差;而溶劑體系4的K值過(guò)大,出峰太遲,且峰形易變寬,溶劑體系2和3的K值符合要求。

表1　不同溶劑體系的分配系數(shù)

根據(jù)分配系數(shù)的測(cè)定結(jié)果對(duì)體系2和3進(jìn)行上機(jī)實(shí)驗(yàn),通過(guò)圖2對(duì)比可知,在體積比為5∶5∶4∶6時(shí),目標(biāo)化合物A沒(méi)有與雜質(zhì)分開(kāi),分離度較差,且基線不平穩(wěn);而在體積比為3∶7∶4∶6時(shí),基線平穩(wěn),組分A分離較好,所以選擇正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(3∶7∶4∶6,V/V)作為分離目標(biāo)化合物的溶劑體系。

圖2　異綠原酸A的高速逆流色譜圖Fig.2　HSCCC chromatograms of crude extract of isochlorogenic acid A注:a:兩相溶劑體系為正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(3∶7∶4∶6,V/V);b:兩相溶劑系統(tǒng)為正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(5∶5∶4∶6,V/V)。

2.2HSCCC分離結(jié)果及純度測(cè)定

根據(jù)方法1.2.4的分離條件,用正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(3∶7∶4∶6,V/V)對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分離純化,固定相保留率為57.7%。進(jìn)樣25 mg得到目標(biāo)組分11 mg,進(jìn)入HPLC中進(jìn)行分析,DAD檢測(cè)器在254、280、325、360 nm下都顯示所分得產(chǎn)物為單一化合物。對(duì)比艾葉粗提物及HSCCC分離得到化合物的HPLC圖,可知大量雜質(zhì)在HSCCC分離過(guò)程中已被除去,得到了高純度的目標(biāo)化合物,根據(jù)面積歸一化法測(cè)得純度為99.01%,目標(biāo)化合物得到了很好的分離。

圖3　艾葉粗提物的HPLC圖譜(280 nm)Fig.3　HPLC chromatogram of the crude extract from Artemisia argyi(280 nm)

2.3結(jié)構(gòu)鑒定

將HSCCC分離得到的組分A收集,經(jīng)冷凍干燥后進(jìn)行LCMS-IT-TOF、1H-NMR檢測(cè),確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。組分A(3,5-di-O-caffeoylquinic acid):MS(Neg)m/z:515.1[M-1]-,353.1,335.1,191.1,173.0。1H-NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:7.56(1H,d,J=16.0Hz,H-7′),7.55(1H,d,J=16.0Hz,H-7″),7.06(2H,d,J=7.5Hz,H-2′,H-2″),7.01(2H,d,J=7.0Hz,H-6′,H-6″),6.78(2H,d,J=7.2Hz,H-5′,H-5″),6.37(1H,d,J=15.6Hz,H-8′),6.26(1H,d,J=15.6Hz,H-8″),5.31(1H,brs,H-3),5.13(1H,m,H-5),3.76(1H,m,H-4),2.10(2H,d,J=13.0Hz,H-6),1.85(1H,m,H-2)。質(zhì)譜與核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10-11]數(shù)據(jù)吻合,故鑒定化合物為異綠原酸A。

圖4　組分A的HPLC色譜圖Fig.4　HPLC chromatogram of peak A

3　結(jié)論

采用高速逆流色譜法,通過(guò)正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(3∶7∶4∶6,V/V)的溶劑體系從艾葉中分離純化得到異綠原酸A,該體系固定相保留率較高,一次進(jìn)樣25 mg可得到異綠原酸A 11 mg,產(chǎn)率為44%,經(jīng)HPLC檢測(cè)其純度為99.01%。本實(shí)驗(yàn)建立了高速逆流色譜法分離純化異綠原酸A的方法,與傳統(tǒng)的大孔吸附樹(shù)脂分離方法相比,具有操作簡(jiǎn)便,重現(xiàn)性高,分離快速,價(jià)格低廉等顯著優(yōu)點(diǎn),可用于異綠原酸A的大量制備。

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fromArtemisiaeargyifoliumby high-speed counter-current chromatography

LI Xi1,QIU Xi-min1,*,REN Da-bing2,QIN Yan-hua2

(1.College of Medicine,Hunan Normal University,Changsha 410000,China;

Isochlorogenic acid A was separated and purified fromArtemisiaeargyifoliumby preparative high-speed counter-current chromatography(HSCCC)using a weak polarity solvent system consisting of n-hexane-ethyl acetate-ethanol-water(3∶7∶4∶6,v/v/v/v),the upper phase acted as stationary phase and the lower phase served as mobile phase. The separation process was performed at a flow rate of 2 mL/min,the rotation rate of the apparatus was set at 900 r/min,and the effluents were detected at 280 nm,a total of 11 mg of target compound was obtained in one step separation from 25 mg of crude extract. The results from HPLC analysis showed that the compound with 99.01% purity and the chemical structure was characterized as Isochlorogenic A by high performance liquid chromatography-mass spectrum(LCMS-IT-TOF)and Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy(1H-NMR). It showed that preparative high-speed counter-current chromatography could separate and purify Isochlorogenic acid A successfully fromArtemisiaeargyifolium. The method was of high separation efficiency,and great importance for isochlorogenic acid A applications in the food and medical fields.

Artemisiaeargyifolium;isochlorogenic acid A;high-speed counter-current chromatography(HSCCC);preparative isolation

2015-11-09

李熹(1990-),女,碩士研究生,研究方向:分析化學(xué),E-mail:sixi4527058@163.com。

邱細(xì)敏(1954-),女,教授,研究方向:分析化學(xué),E-mail:qiuximin@tom.com。

湖南省科技廳科研專項(xiàng)項(xiàng)目(2014sk4040);長(zhǎng)沙市科技管理局項(xiàng)目(K1401010-31)。

TS201.2

B

1002-0306(2016)10-0295-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.051