神秘果種子多糖的響應(yīng)面優(yōu)化提取及其抗氧化活性研究

馬藝丹,劉　紅,2,*,馬思聰,閆瑞昕,薛炳祥,王　茜

(1.海南師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,海南?？?571127; 2.熱帶特色藥食同源植物研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南海口 571127)

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神秘果種子多糖的響應(yīng)面優(yōu)化提取及其抗氧化活性研究

馬藝丹1,劉紅1,2,*,馬思聰1,閆瑞昕1,薛炳祥1,王茜1

(1.海南師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,海南?？?571127; 2.熱帶特色藥食同源植物研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南?？?571127)

神秘果種子,多糖,抗氧化,提取,響應(yīng)面分析

神秘果(Synsepalumdulcificum)屬山欖科,又稱(chēng)變味果或蜜拉圣果,是一種天然的藥食同源植物,原產(chǎn)于西非熱帶地區(qū),如今在中國(guó)海南、云南、廣西等省份也大面積種植[1]。據(jù)報(bào)道,除了神秘果種子含有的神秘果素能改變?nèi)说奈队X(jué),其種子可以促進(jìn)胰島素分泌[2],是用于治療糖尿病、高血壓的天然藥物[3]。種子里還含有天然固醇和一些微量礦物元素[4],以及大量的多酚類(lèi)物質(zhì)[5]。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)神秘果種子都有研究,但主要集中于在多酚的提取以及生物活性等方面,有關(guān)神秘果種子多糖的提取研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。植物多糖是一類(lèi)具有高活性的物質(zhì),如免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗衰老、降血糖等[6]。因此,受到越來(lái)越多研究者的關(guān)注[7]。

常用于多糖的提取方法有:溶劑提取法、酸堿提取法、酶解法提取法、超聲波提取法、微波提取法等[8]。溶劑提法設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低廉,對(duì)植物組織的穿透性強(qiáng),但耗時(shí)較長(zhǎng)[9]。酸堿提取法雖然提取率有所提高,但酸堿提取法具有特殊性,僅在某些特定的植物多糖提取中有優(yōu)勢(shì)。同時(shí),若酸堿度不當(dāng),酸性條件可能引起多糖的糖苷鍵斷裂,堿性條件會(huì)使部分多糖分解[10]。超聲波提取法簡(jiǎn)單高效,可避免溫度過(guò)高引起不穩(wěn)定成分分解。因此,綜合各因素,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)超聲波輔助以水為提取試劑,采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化神秘果種子多糖的提取工藝,并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。為神秘果種子的深入研究和綜合開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

神秘果種子采自海南省保亭縣,經(jīng)海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院鐘瓊?cè)锝淌阼b定為山欖科植物神秘果(Synsepalumdulcificum)的種子,標(biāo)本現(xiàn)存于熱帶藥用植物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,備用;1,1,-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)美國(guó)Sigma公司;乙醚、95%乙醇、濃硫酸、苯酚、葡萄糖、VC等均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

XO-5200DTS超聲波清洗儀南京先歐儀器制造有限公司;TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限公司;Nicolet 6700智能傅立葉紅外光譜儀美國(guó)Thermo Scientific公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠;LGJ-10冷凍干燥機(jī)北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1神秘果種子多糖提取工藝流程神秘果種子→粉碎(過(guò)60目篩)→乙醚脫脂(索氏提取)→揮干乙醚→除雜(95%乙醇浸泡2 d)→抽濾、干燥→超聲波提取2次→抽濾→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→脫蛋白(Saveg法除蛋白質(zhì)2次)→透析除去雜質(zhì)→乙醇沉淀(加入4倍體積95%乙醇,4 ℃靜置過(guò)夜)→抽濾→脫色(無(wú)水乙醇和丙酮反復(fù)洗滌)→水復(fù)溶→冷凍干燥→神秘果種子粗多糖。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用硫酸-苯酚比色法[11]略加修改。精確稱(chēng)取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖100.00 mg,定容于1000 mL容量瓶中。精確移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL容量瓶,分別加蒸餾水至2 mL,再加入5%苯酚1 mL,迅速加入濃硫酸5 mL,緩慢搖勻。沸水浴20 min后,冷卻至室溫。測(cè)490 nm吸光度。以橫坐標(biāo)為葡萄糖質(zhì)量濃度(mg/mL),縱坐標(biāo)為吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3神秘果種子多糖的提取及含量的測(cè)定精密稱(chēng)取神秘果種子粉末1.0 g,置于100 mL錐形瓶中,以相應(yīng)液料比加入一定體積蒸餾水,封口膜密封后,振蕩10 min,置于超聲波中,按一定的超聲時(shí)間及提取溫度進(jìn)行提取(45 kHz頻率固定)2次。趁熱抽濾,合并提取液。將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,Saveg 法除蛋白質(zhì)2次,透析除去雜質(zhì)。趁熱加4倍體積95%乙醇,4 ℃靜置24 h,析出沉淀多糖,抽濾,用無(wú)水乙醇和丙酮洗滌。用適量蒸餾水復(fù)溶,定容于50 mL容量瓶作為樣品液,取適量按標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法測(cè)樣品中多糖的質(zhì)量濃度。多糖得率按如下式公式計(jì)算:

多糖得率(%)=提取多糖的質(zhì)量/預(yù)處理后種子粉末的質(zhì)量×100

1.2.4單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1超聲波功率對(duì)多糖提取率的影響固定超聲波溫度為40 ℃,超聲波時(shí)間為30 min,料液比為1∶30(g/mL)，考察不同超聲波功率(35、40、45、50、55 kHz)對(duì)多糖提取率的影響。

1.2.4.2料液比對(duì)多糖提取率的影響在1.2.4.1的基礎(chǔ)上，固定超聲波溫度為40 ℃,超聲波時(shí)間為30 min,考察不同料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 m∶V)對(duì)多糖提取率的影響。

1.2.4.3超聲波時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響固定超聲波溫度為40 ℃,采用1.2.4.1、1.2.4.2中最佳超聲功率、料液比，考察不同超聲波時(shí)間(20、30、40、50、60 min)對(duì)多糖提取率的影響。

1.2.4.4超聲波溫度對(duì)多糖提取率的影響采用1.2.4.1、1.2.4.2和1.2.4.3中最佳超聲功率、料液比和超聲波時(shí)間，考察不同溫度(30、40、50、60、70 ℃)對(duì)多糖提取率的影響。

1.2.5響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化神秘果種子多糖的提取工藝。根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理,并綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以料液比(A)、超聲波時(shí)間(B)、超聲波溫度(C)為3個(gè)影響因素,以神秘果種子多糖提取率為響應(yīng)值。采用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert 8.0,建立3因素3水平的響應(yīng)面分析法,進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸方程擬合及其優(yōu)化分析。實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1　實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.2.6神秘果種子多糖的抗氧化能力

1.2.6.1對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[12]修改如下:取不同質(zhì)量濃度的樣品液2 mL,和2 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液混合均勻,室溫避光放置30 min,測(cè)定517 nm處吸光值為A1;同法,測(cè)定2 mL乙醇加樣品液的吸光值為A2;測(cè)定2 mL DPPH溶液與2 mL蒸餾水的吸光值為A0。以VC作陽(yáng)性對(duì)照。DPPH清除率計(jì)算公式為:

1.2.6.2對(duì)ABTS+自由基清除能力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[13]略加修改。首先配制ABTS+溶液,用乙醇調(diào)節(jié)pH,使734 nm處的吸光值為0.70±0.20備用。取不同質(zhì)量濃度的樣品液100 μL,加入1.9 mL ABTS+,搖勻,室溫反應(yīng)6 min測(cè)734 nm處的吸光值為Ax。同法,以乙醇代替ABTS測(cè)定吸光值為Ay;以乙醇代替樣品測(cè)定吸光值為Az。以VC作陽(yáng)性對(duì)照。ABTS+清除率計(jì)算公式為:

1.2.6.3對(duì)·OH自由基清除能力的測(cè)定參考Smiroff等采用的水楊酸法[14],并略作修改。取8mmol/L的FeSO4溶液0.5mL,加入6mmol/L水楊酸-乙醇溶液0.8mL和0.5mL蒸餾水,搖勻,37 ℃水浴30min。再加入不同質(zhì)量濃度樣品液1.0mL,水浴30min。測(cè)520nm處吸光值為Aa;同法,用蒸餾水代替水楊酸,測(cè)吸光值為Ab;用蒸餾水代替樣品液,測(cè)吸光值為Ac。以VC作陽(yáng)性對(duì)照。清除率計(jì)算公式為:

新聞傳播學(xué)、戲劇影視學(xué)兩個(gè)學(xué)科都具有中國(guó)傳媒大學(xué)的獨(dú)到優(yōu)勢(shì)和特色。首先體現(xiàn)在“綜合”。新聞傳播學(xué)起步于廣電，隨著中國(guó)整個(gè)媒體行業(yè)的快速發(fā)展，從廣電延伸到電子媒體，再?gòu)碾娮用襟w延伸到視聽(tīng)新媒體、融媒體。戲劇影視學(xué)也大致如此，起步是電視藝術(shù)，電視藝術(shù)后來(lái)延伸到視覺(jué)藝術(shù)，又延伸到影視行業(yè)，最后將戲劇和戲曲也納入其中。第二個(gè)特點(diǎn)就是“交叉”。新聞傳播學(xué)、戲劇與影視學(xué)不僅載體、平臺(tái)有交叉，藝術(shù)、技術(shù)也有交叉。特別是這幾年大數(shù)據(jù)、智能媒體的興起，使它們的覆蓋領(lǐng)域更加寬泛。交叉、融合肯定是未來(lái)方向，需要開(kāi)啟新聞傳播學(xué)、戲劇影視學(xué)的新視野和新維度，促進(jìn)學(xué)科建設(shè)與發(fā)展的良性循環(huán)。

1.3數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel和Design-Expert8.0.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。得到回歸方程y=10.564x+0.0628(R2=0.9993),吸光度與葡萄糖濃度具有良好的線性關(guān)系,因此,可用于神秘果種子多糖含量的測(cè)定。

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of glucose

2.2單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1超聲波功率對(duì)多糖得率的影響超聲波功率對(duì)多糖得率的影響如圖2所示。隨著超聲波功率提高,多糖提取率增加,這可能由于超聲波空化作用加快種子細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的破碎使多糖更容易被提取。在超聲波功率為45 kHz時(shí),多糖提取率達(dá)到最大值,之后超聲波功率再提高,多糖提取率略有降低。說(shuō)明當(dāng)超聲功率達(dá)到一定程度,導(dǎo)致部分多糖結(jié)構(gòu)被破壞。因此,選最佳超聲波功率為45 kHz。

圖2　超聲波功率對(duì)多糖得率的影響Fig.2　Effect of ultrasonic power on the yield of polysaccharide

圖3　料液比對(duì)多糖得率的影響Fig.3　Effect of radio of material to iquid ratio on the yield of polysaccharide

2.2.3超聲波時(shí)間對(duì)多糖得率的影響超聲波時(shí)間對(duì)多糖得率的影響如圖4所示,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),多糖的提取率呈先增大后減小的趨勢(shì)。因?yàn)槌暡稍诙虝r(shí)間內(nèi)使細(xì)胞破裂,加速多糖溶出。當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)40 min,多糖溶液趨于飽和,大量的多糖吸附在顆粒表面,阻礙多糖繼續(xù)溶出。同時(shí)超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能使多糖結(jié)構(gòu)被破壞,雜質(zhì)的溶出也會(huì)相對(duì)增多,從而減緩了多糖的溶出速率,最終導(dǎo)致多糖總量下降。因此,選最佳超聲波時(shí)間為40 min。

圖4　超聲波時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.4　Effect of ultrasonic time on the yield of polysaccharide

2.2.4提取溫度對(duì)多糖得率的影響提取溫度對(duì)多糖得率的影響如圖5所示,在溫度30～40 ℃之間,多糖得率逐漸增大。當(dāng)提取溫度為50 ℃時(shí),多糖得率最高為12.32%。因?yàn)闇囟冗^(guò)低多糖不能充分溶出,升高溫度可加速分子間運(yùn)動(dòng),促使逐漸溶出。當(dāng)溫度大于50 ℃時(shí),隨著溫度升高多糖得率反而降低,因?yàn)檩^高的溫度可能會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)[16],雜質(zhì)的溶出也會(huì)增加,導(dǎo)致多糖含量降低。因此,選最佳提取溫度為50 ℃。

圖5　提取溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.5　Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharide

2.3響應(yīng)曲面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1回歸模型的建立與分析對(duì)4個(gè)單因素變量進(jìn)行顯著性分析,料液比、超聲時(shí)間、提取溫度影響顯著，因此選取3個(gè)因素設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，其中超聲功率固定為45 kHz。

通過(guò)Design Expert軟件,對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合得到以上二次多項(xiàng)回歸模型方程:

Y=12.33+0.24A-0.046B-0.024C+0.072AB-0.013AC+0.11BC-0.43A2-1.26B2-0.30C2

表2　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析

2.3.2響應(yīng)曲面模型的分析通過(guò)響應(yīng)曲面模型可以確定最佳工藝參數(shù)及各因素間相互作用,響應(yīng)面模型和等高線圖見(jiàn)圖6～圖8。從圖6可以看出,料液比(A)和超聲時(shí)間(B)的等高線為橢圓形,說(shuō)明其交互作用顯著;料液比軸向的等高線變化密集,說(shuō)明料液比比提取溫度對(duì)多糖得率的影響大。從圖7可以看出,料液比(A)和提取溫度(C)的等高線趨于圓形,說(shuō)明其交互作用不顯著。從圖8可以看出,超聲時(shí)間(B)和提取溫度(C)的等高線為橢圓形,表明其交互作用顯著;提取時(shí)間軸向的等高線密集,說(shuō)明提取溫度比提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響大。選擇適當(dāng)?shù)牧弦罕?A)、超聲時(shí)間(B)和提取溫度(C),可以達(dá)到較高的多糖得率。三個(gè)因素對(duì)多糖得率的影響從大到小依次為:料液比(A)>超聲時(shí)間(B)>提取溫度(C)。

表3　二次響應(yīng)面回歸模型方差分析

圖6　料液比和超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的響應(yīng)曲面圖Fig.6　Response surface of material to liquid ratio and ultrasonic time on the yield of polysaccharide

圖7　料液比和提取溫度對(duì)多糖得率的響應(yīng)曲面圖Fig.7　Response surface of material to liquid ratio and extraction temperature on the yield of polysaccharide

圖8　超聲時(shí)間和提取溫度對(duì)多糖得率的響應(yīng)曲面圖Fig.8 Response surface of ultrasonic time and extraction temperature on the yield of polysaccharide

注:**表示極顯著(p<0.01);*表示顯著(0.01

優(yōu)化后的神秘果種子多糖最佳提取工藝條件為:料液比1∶42.79(g/mL)、提取溫度49.87 ℃、超聲時(shí)間 39.53 min,在此條件下,神秘果種子多糖得率可達(dá)12.36%。為方便實(shí)際操作,將優(yōu)化參數(shù)修正為:料液比1∶43(g/mL)、提取溫度50 ℃、超聲時(shí)間40 min,平行3次實(shí)驗(yàn)多糖平均得率為12.33%,與預(yù)測(cè)值12.36%接近,說(shuō)明此優(yōu)化模型可靠。

2.5神秘果種子多糖抗氧化能力

2.5.1對(duì)DPPH自由基的清除作用不同質(zhì)量濃度的神秘果種子多糖和VC對(duì)清除DPPH自由基的影響,如圖9所示。在質(zhì)量濃度0～0.5 mg/mL范圍內(nèi),多糖和VC對(duì)DPPH自由基清除率均隨著質(zhì)量濃度增大而升高。當(dāng)多糖濃度達(dá)到0.4 mg/mL時(shí),繼續(xù)增大濃度,清除率隨濃度變化不明顯,此時(shí)的清除率為57.13%,相比VC對(duì)DPPH自由基的清除率低38%,可見(jiàn)神秘果種子多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力明顯低于VC。經(jīng)計(jì)算神秘果種子多糖對(duì)清除DPPH自由基的IC50為0.31 mg/mL。

圖9　神秘果種子多糖和VC對(duì)DPPH·的清除作用Fig.9　Scavenging effect of polysaccharides from S. dulcificum and VC on DPPH·

2.5.2對(duì)ABTS+自由基的清除作用不同質(zhì)量濃度的神秘果種子多糖和VC對(duì)清除ABTS+自由基的影響,如圖10所示。在質(zhì)量濃度0～0.5 mg/mL范圍內(nèi),多糖和VC對(duì)ABTS+自由基清除率均隨著質(zhì)量濃度增大而明顯升高。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí),對(duì)ABTS+自由基的清除率達(dá)到62.21%。說(shuō)明神秘果種子多糖對(duì)ABTS+自由基的清除率與濃度呈較強(qiáng)的劑量正相關(guān)效應(yīng),但清除率低于VC。經(jīng)計(jì)算神秘果種子多糖對(duì)ABTS+自由基的IC50為0.41 mg/mL。

圖10　神秘果種子多糖和VC對(duì)ABTS+的清除作用Fig.10　Scavenging effect of polysaccharides from S. dulcificum and VCon ABTS+

2.5.3對(duì)·OH的清除作用不同質(zhì)量濃度的神秘果種子多糖和VC對(duì)清除·OH的影響,如圖11所示。在質(zhì)量濃度0～0.2 mg/mL范圍內(nèi),清除率隨多糖濃度增大整體呈上升趨勢(shì)。當(dāng)濃度達(dá)到0.2 mg/mL時(shí),清除率迅速升高,直至濃度達(dá)到0.4 mg/mL時(shí),清除率升高程度減緩。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.5 mg/mL時(shí),清除率達(dá)到85.32%,此時(shí)較同濃度的VC對(duì)·OH的清除率低8.13%。說(shuō)明神秘果種子多糖對(duì)·OH的清除率與濃度呈正相關(guān),當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.5 mg/mL時(shí)與VC相差不大。經(jīng)計(jì)算神秘果種子多糖對(duì)·OH自由基的IC50為0.24 mg/mL。

圖11　神秘果種子多糖和VC對(duì)·OH的清除作用Fig.11　Scavenging effect of polysaccharides from S. dulcificum and VC on ·OH

圖12　神秘果種子多糖和VC對(duì)·的清除作用Fig.12　Scavenging effect of polysaccharides from S.

3　結(jié)論

將響應(yīng)面分析法應(yīng)用于超聲波提取神秘果種子多糖工藝的研究。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)超聲波提取神秘果種子多糖優(yōu)化的工藝參數(shù)為:料液比1∶43(g/mL)、提取溫度50 ℃、超聲時(shí)間40 min,實(shí)測(cè)得率12.33%與預(yù)測(cè)得率12.36%接近,說(shuō)明該模型可用于對(duì)神秘果種子多糖的預(yù)測(cè),具有一定的理論價(jià)值與實(shí)際應(yīng)用前景。

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Study on the optimization of extracting polysaccharides fromSynsepalumdulcificumseed by response surface methodology and evaluation of antioxidant activity

MA Yi-dan1,LIU Hong1,2,*,MA Si-cong1,YAN Rui-xin1,XUE Bing-xiang1,WANG Qian1

(1.College of Chemistry and Chemical Engineering,Hainan Normal University,Haikou 571127,China;2.Key Laboratory of Research and Development on Topical and Special Medicine and Edible Plant,Haikou 571127,China)

Synsepalumdulcificumseed;polysaccharides;antioxidant;extraction;response surface methodology

2015-11-09

馬藝丹(1990-),女,碩士研究生,研究方向:天然產(chǎn)物的提取與分離,E-mail:18789195535@163.com。

劉紅(1967-),女,博士,教授,研究方向:藥食同源植物開(kāi)發(fā)利用與保健食品的研發(fā),E-mail:lhyd123@sohu.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2166009);海南省社會(huì)發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)(2015SF11);?？谑袘?yīng)用技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)項(xiàng)目(2014-90);海南省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(2013116580);海南師范大學(xué)大學(xué)生科研項(xiàng)目(XSKY201512)。

TS272.5

B

1002-0306(2016)10-0289-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.050