基于高通量測序?qū)σ速e芽菜中細菌群落結(jié)構(gòu)分析

左　勇,王小龍,葉碧霞,江　鵬,傅　彬,楊小龍

(四川理工學院生物工程學院,四川自貢 643000)

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基于高通量測序?qū)σ速e芽菜中細菌群落結(jié)構(gòu)分析

左勇,王小龍,葉碧霞,江鵬,傅彬,楊小龍

(四川理工學院生物工程學院,四川自貢 643000)

目的:研究宜賓芽菜發(fā)酵過程中細菌微生物多樣性。方法:采用Illumina高通量測序技術(shù)對芽菜樣本中所有細菌的16S V1-V3區(qū)進行測序,應(yīng)用QIIME軟件和Mothur軟件分析和統(tǒng)計樣品序列數(shù)目、OUT數(shù)量,并進行聚類分析。結(jié)果:宜賓芽菜發(fā)酵過程中6個階段的樣本共獲得204997條有效序列,優(yōu)化后有效序列數(shù)為41703條,共9202個OTU分類;主要細菌類群為Firmicutes(厚壁菌門)下的Bacillus(芽孢桿菌屬),Bacteroidetes(擬桿菌門)下的Flavobacteriaceae(黃桿菌屬)和Sphingobacterium(鞘脂桿菌屬),Proteobacteria(變形菌門)下的Sphingomonas(鞘脂單孢菌屬)、Acidovorax(嗜酸菌屬)、Chromohalobacter(色鹽桿菌屬)和Pseudomonas(假單胞菌屬)以及Actinobacteria(放線菌門)下的Arthrobacter(節(jié)桿菌屬)。結(jié)論:宜賓芽菜發(fā)酵過程中細菌菌群處于動態(tài)變化中,隨著發(fā)酵的進行,部分細菌逐漸減少或消失,優(yōu)勢細菌趨于穩(wěn)定。

宜賓芽菜,細菌群落,高通量測序,Miseq

宜賓芽菜是由芥菜的嫩莖劃成條狀,在大量微生物的作用下,經(jīng)過自然發(fā)酵腌制而成,是我國加工食品中非常著名的產(chǎn)品,有川菜“四大名菜”之稱,成為四川家喻戶曉的傳統(tǒng)醬腌菜[1]。芽菜發(fā)酵過程中主要功能菌為細菌,據(jù)研究表明,在芽菜發(fā)酵過程中有大量的乳酸菌類、嗜鹽、嗜酸類細菌[2-3]。它們之間互營共生,生成芽菜主要的風味物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì),因此研究芽菜發(fā)酵過程中細菌的群落結(jié)構(gòu)將對提高宜賓芽菜品質(zhì)有重要作用。

傳統(tǒng)的研究芽菜中微生物的方法是菌種分離,近幾年開始運用分子生物學方法對對芽菜中微生物進行研究,如PCR-DGGE技術(shù)[4]。傳統(tǒng)的菌種分離只能對芽菜中極少數(shù)能分離的菌種進行研究,PCR-DGGE技術(shù)對芽菜的研究無法準確的定量,也不能對樣品中微生物群落進行較為完備的測序研究,同時工作量大、靈敏度不高。相比較這些方法,高通量測序(HTS)技術(shù)(又稱“下一代”測序(NGS)技術(shù))對微生物群落結(jié)構(gòu)的研究有其明顯的先進性和優(yōu)勢,準確定量、讀長較長、實時檢測等。目前,高通量測序技術(shù)已經(jīng)開始運用于各種分子生物學領(lǐng)域[5],在人體微生物、水中生物、土壤、熱泉微生物[6-9]等多個領(lǐng)域都有應(yīng)用。

本研究首次運用高通量Illumina MiSeq 2 x 300 bp測序平臺對宜賓芽菜發(fā)酵過程中的細菌進行研究,建立一套高通量測序技術(shù)分析宜賓芽菜細菌的方法,同時利用QIIME和Mothur軟件相結(jié)合,運用于數(shù)據(jù)分析,能夠更加準確、完整地解析宜賓芽菜中細菌的群落結(jié)構(gòu),為進一步利用和開發(fā)宜賓芽菜中微生物資源提供研究基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

芽菜樣本采自宜賓雙誼富康芽菜廠,分別為同一批次發(fā)酵15 d(編號1)、30 d(編號2)、60 d(編號3)、90 d(編號4)、120 d(編號5)、150 d(編號6),迅速置于冰盒運回,-20 ℃保藏;TaqDNA polymerase、dNTPs、DL2000TM DNA Marker寶生物工程(大連)有限公司;蛋白酶KMerck;溶菌酶 Sigma;瓊脂糖、丙烯酰胺、N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺、去離子甲酰胺 Solarbio;引物由上海英濰捷基生物技術(shù)公司合成。

通用型恒壓恒流電泳儀北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;My Cycler型PCR儀美國Bio-rad公司;Bio-Best 200E型凝膠成像分析系統(tǒng)美國SIM公司;高速冷凍離心機X1R美國Thermo公司;臺式冷凍離心機Eppendorf;MX-S型可調(diào)式混勻儀美國賽洛捷克;SW-CG-1F型超凈工作臺蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司;微量熒光核酸定量儀Qubit 2.0;Miseq 測序儀Illumina公司。

1.2總DNA的提取及PCR擴增

采用液氮研磨+溶菌酶+SDS高鹽抽提法[10]提取芽菜中微生物總宏基因組,然用核酸蛋白儀檢測DNA的濃度和純度,置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

通用引物選擇序列較長的V1-V3序列F8-R533[11],因其擴增效果好,通用性較高,可以擴增出650 bp左右的片段。PCR反應(yīng)體系為25 μL,體系包括5 μL 5×Buffer,0.6 μL 10 mmol/L dNTP,0.5 U phusion超保真DNA 聚合酶,DNA 模板用量為2 μL,533R內(nèi)側(cè)引物(5 pmol/L)2 μL,8F內(nèi)側(cè)引物10 μmol/L母液稀釋48倍取1 μL,8F外側(cè)引物10 μmol/L母液稀釋1.6倍取1 μL,533R外側(cè)引物10 μmol/L母液稀釋1.6倍取1 μL,補水至25 μL。PCR 反應(yīng)程序為:98 ℃ 30 s;98 ℃10 s,50 ℃ 90 s,72 ℃ 30 s,8個循環(huán);72 ℃ 5 min;98 ℃ 10 s,50 ℃ 90 s,72 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30個循環(huán);72 ℃ 5 min;10 ℃ 10 min。PCR結(jié)束后取3 μL PCR產(chǎn)物于1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

一個星期后，斯通只身潛水進入奧古斯丁聚水坑，去重新完成伊恩和肯尼中斷的探險任務(wù)。中間集結(jié)營地有一支后援隊作好了準備，他就游回到那充滿空氣的石室。為了紀念伊恩·羅蘭，探察隊已將這石室命名為“羅蘭氣鐘”。

1.3PCR產(chǎn)物純化及定量

采用QIAquick Gel Extraction Kit膠回收試劑盒對PCR擴增產(chǎn)物進行切膠回收,取3 μL回收產(chǎn)物進行電泳檢測。

采用Quant-iT PicoGreen 定量試劑盒[12]對膠回收之后的PCR產(chǎn)物進行定量。

1.4高通量測序

將定好量的DNA文庫樣本送至微基生物科技(上海)有限公司進行高通量測序。

1.5QIIME軟件和Mothur軟件進行生物信息學分析

2　結(jié)果與分析

2.1樣本文庫的獲得及定量

提取6個芽菜樣本總DNA,對細菌16S rRNA V1-V3區(qū)基因擴增,PCR擴增結(jié)果進行膠回收,獲得樣本文庫(見圖1、圖2)。由圖1可知,基因組條帶可見,部分DNA樣本濃度低,條帶較弱,均可正常進行后續(xù)實驗;由圖2可見,電泳檢測條帶單一,片段長度與預(yù)期片段大小一致,約為650 bp,且濃度適中,可用于后續(xù)實驗。

圖1　芽菜樣本總DNA的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1　Sprouts samples of total DNA agarose gel electrophoresis注:1～6分別代表芽菜發(fā)酵時間15、30、60、90、120、150 d;M：DL2000TM DNA Marker,圖2同。

圖2　芽菜樣本細菌PCR擴增結(jié)果(A)和膠回收結(jié)果(B)Fig.2　Sprouts sample bacteria PCR amplification (A)and gel recovery results(B)

采用微量熒光核酸定量儀Qubit 2.0對膠回收產(chǎn)物進行定量。從圖3可以看出,標準曲線符合定量標準,以此計算的定量結(jié)果較為準確,表1為由此標準曲線計算出的各樣品PCR產(chǎn)物定量的濃度,定量濃度滿足高通量測序要求。

圖3　膠回收產(chǎn)物定量標準曲線Fig.3　Gel product recycling quantitative standard curve

樣本編號123456濃度(ng/μL)8.027.667.148.206.5112.69

2.2細菌群落的OUT分類

將6個芽菜樣本進行高通量測序,根據(jù)barcode標簽序列篩選出有效序列,并對處理后的有效序列進行數(shù)據(jù)及長度分布統(tǒng)計,細菌共獲得41703條有效序列。根據(jù)97%水平的OTU豐度,使用rarefaction curve對樣本多樣性進行評估,得到樣本稀釋曲線。據(jù)圖4(A)中所示,隨著測序深度的增加,各樣本的曲線斜率逐漸減小,最終趨于平緩。說明測序深度能夠較準確地反映芽菜中細菌的豐富度和多樣性。利用各樣本的測序量在不同測序深度時的細菌多樣性指數(shù)構(gòu)建Shannon-Wiener曲線,以此反映各樣本在不同測序數(shù)量時的微生物多樣性[14]。從圖4(B)中可以看出,各樣本曲線趨向平坦,說明測序數(shù)據(jù)量足夠大,可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物物種信息。

圖4　測序深度曲線Fig.4　Sequencing depth curve注:A：稀釋性曲線，B：Shannon-Wiener曲線。

2.3各樣本在屬水平上的比較

6個樣本的有效細菌基因序列錄入BLAST結(jié)合MEGAN軟件,在屬分類水平上分析,根據(jù)各樣本中的細菌組成繪制柱狀圖(圖5),比較各樣本在屬分類水平上群落結(jié)構(gòu)組成的差異。結(jié)果顯示,發(fā)酵120 d和150 d的優(yōu)勢菌與其他4個時期有較大差別,其中發(fā)酵120 d時有超過90%的序列為Chromohalobacter,發(fā)酵150 d時占優(yōu)勢的細菌為Lactobacillus(44%)、Pseudomonas(15%)Pseudomonas(14%)。其他發(fā)酵時間段的優(yōu)勢細菌分別為:發(fā)酵15 d時占優(yōu)勢的細菌為Kushneria、Unclassified、Buttiauxella、Pseudomonas、Sphingomonas;發(fā)酵30 d的優(yōu)勢細菌為Kushneria、Unclassified、Pseudomonas、Pectobacterium、Methylobacterium、Arthrobacte、Sphingomonas;發(fā)酵60 d的優(yōu)勢細菌為Unclassified、Serratia、Sphingomonas、Rhizobium;發(fā)酵90 d的優(yōu)勢細菌為Unclassified、Buttiauxella、Exiguobacterium、Leuconostoc、Staphylococcus、Arthrobacter、Enterobacter。

圖5　各樣本在屬水平上群落結(jié)構(gòu)組成的差異Fig.5　All the samples in the genus level of community structure

圖6　基于屬水平的PCA圖Fig.6　Based on the genus level of PCA figure

由各樣本OUT組成的差異,通過方差分解,作出PCA圖(圖6)。PC1和PC2的貢獻率分別為74.3%和14.3%,累計貢獻率高達88.6%,是變異的主要來源,可以解釋變量的絕大部分信息。由圖6可知,芽菜發(fā)酵120 d時細菌的多樣性與其他發(fā)酵時期有較大差別,主要是因為Chromohalobacter所占的比例較大,發(fā)酵前期與發(fā)酵后期細菌的組成也有較大差異性,由此可知芽菜發(fā)酵過程中優(yōu)勢細菌的組成是一個動態(tài)變化的過程,隨著發(fā)酵的進行,部分細菌逐漸減少或消失,優(yōu)勢細菌逐漸趨于穩(wěn)定,含量有所差異。

2.4基于UniFrac的聚類的比較分析

分析了宜賓芽菜6個不同發(fā)酵時期樣本中細菌菌群的總體結(jié)構(gòu),對比分析6份芽菜樣本間菌群多樣性的相似度,可以采用2種圖(樹圖和熱點圖)來表示。其中比對得到的樹圖(圖7),圖中顯示所有枝條的結(jié)點表示相鄰兩個細菌多樣性有顯著性差異(p<0.01),特別是5號樣本與其他樣本有明顯菌群的差異,除5號樣本其他樣本都依次按照發(fā)酵時間相鄰。

圖7　全樣本相似性分析樹圖Fig.7　All sample tree graph similarity analysis

將指定種屬水平上的分類信息(本次繪圖是根據(jù)genus水平上OUTsize位于前50的信息進行繪制的)分別按照樣品和分類進行聚類后作出Heatmap圖(圖8),通過顏色的梯度及相似程度來反映數(shù)據(jù)的相似性和差異性,能夠反映出所有樣本在各分類水平上表現(xiàn)的相似性或者差異性。由圖8可知1、2、3號樣本聚為一類,細菌種類的組成基本相同,但某些細菌的含量在逐漸減少,甚至消失;4、5、6號樣本聚為一類,細菌種類趨于穩(wěn)定,含量有所差異,尤其5號樣本色鹽桿菌屬含量與其他樣本有明顯差異。說明在宜賓芽菜發(fā)酵過程中,發(fā)酵前期細菌的種類變化不大,在數(shù)量上有部分變化;發(fā)酵后期細菌的種類已經(jīng)比較穩(wěn)定,在各菌群含量上有所差異。

圖8　全樣本多樣性熱圖Fig.8　All samples diversity heatmap

3　結(jié)論

通過Miseq測序方法全面的分析了宜賓芽菜發(fā)酵過程中細菌的多樣性,結(jié)果顯示6個階段的樣本共獲得204997條有效序列,優(yōu)化后有效序列數(shù)為41703條,共9202個OTU分類。通過芽菜樣本的細菌主成分分析結(jié)果,得出發(fā)酵各時期的優(yōu)勢細菌,通過熱圖反映了各樣本之間的相似性與差異性。Miseq測序16S rDNA V1-V3序列反映了更多的多樣性種類,比以往任何芽菜細菌多樣性的研究得到了更多的分類種類和未知屬種的細菌,證實了宜賓芽菜在發(fā)酵過程中含有豐富的細菌資源。

對芽菜發(fā)酵微生物群落結(jié)構(gòu)的研究與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法及16S rDNA為基礎(chǔ)的分子生物學方法不同,利用高通量測序的方法研究宜賓芽菜發(fā)酵過程中細菌群落結(jié)構(gòu),全面客觀地分析了芽菜中的微生物多樣性,發(fā)現(xiàn)了一些在芽菜中以前未報道的細菌類,如Sphingobacterium(鞘脂桿菌屬)、Chromohalobacter(色鹽桿菌屬)、未培養(yǎng)細菌等,同時本研究分析了各類優(yōu)勢菌的含量,根據(jù)數(shù)據(jù)客觀地反映宜賓芽菜發(fā)酵過程中各時期的細菌群落結(jié)構(gòu)。本實驗中細菌引物設(shè)計在650 bp左右,測序數(shù)據(jù)對不同發(fā)酵時期芽菜中微生物的區(qū)分度將擴大,能夠更好的了解芽菜中微生物的類群,同時建立較為完善的芽菜微生物數(shù)據(jù)庫,為芽菜生產(chǎn)和提高芽菜質(zhì)量提供了較為準確的參考數(shù)據(jù)。

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Based on high-throughput sequencing analysis of bacterial community structure in Yibin sprouts

ZUO Yong,WANG Xiao-long,YE Bi-xia,JIANG Peng,FU Bin,YANG Xiao-long

(Dept. of Bioengineering,Sichuan University of Science and Engineering,Zigong 643000,China)

Objective:The aim of this study was to analyze the yibin sprouts bacteria microbial diversity in the process of fermentation.Methods:Illumina high-throughput sequencing techno-logy were used to sequence 16S V1-V3 hypervariable reqion of all 6 yibin sprouts samples. QIIME and Mothur was used to analyze and calculate the numbers of sequences and operational taxonomic unitl(OTUs)for each sample,and followed by cluster analysis.Results:Yibin sprouts 6 stages in the process of fermentation samples received 204997 valid sequence,the optimized effectively sequence number was 41703,a total of 9202 OTUs.The main groups for bacteria of Yibin sprouts wasBacillusunder theFirmicutes,FlavobacteriaceaeandSphingobacteriumunder theBacteroidetes,Sphingomonas,Acidovorax,ChromohalobacterandPseudomonasunder theProteobacteria,andArthrobacterunder theActinobacteria.Conclusion:Yibin sprouts bacterial flora in the fermentation process of dynamic change,with the fermentation proceeds,some bacteria gradually decreased or disappeared,dominant bacteria stabilized.

Yibin sprouts;bacterial community;high-throughput sequencing;Miseq

2015-08-03

左勇(1972-),男,碩士，教授,主要從事發(fā)酵工程方面的研究,E-mail:sgzuoyong@tom.com。

固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室開放基金項目(2015gtc002);2014四川省科技廳農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項目;2013大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201310622001);四川理工學院培育項目(2013PY09)。

TS264.2

A

1002-0306(2016)10-0242-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.040