五株嗜熱鏈球菌抗藥性研究

張丹青,李　婉,丁秀云,Shuvan Kumar Sarker,霍貴成

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030)

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五株嗜熱鏈球菌抗藥性研究

張丹青,李婉,丁秀云,Shuvan Kumar Sarker,霍貴成*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030)

采用藥敏紙片法研究了五株高產(chǎn)粘嗜熱鏈球菌(KLDS3.1012、KLDS3.1014、KLDS-SM、KLDS3.0206、KLDS3.0207)對(duì)15種抗生素的敏感性,結(jié)果發(fā)現(xiàn),KLDS3.1014對(duì)兩種抗生素有抗性,KLDS3.1012、KLDS-SM、KLDS3.0206對(duì)3種抗生素有抗性,KLDS3.0207則表現(xiàn)出多重抗藥性。對(duì)五株嗜熱鏈球菌耐四環(huán)素基因(tetM,tetS,tetL)、耐紅霉素基因(ermA,ermB,msrA/B)和耐氯霉素基因(cat)的初步研究表明,四環(huán)素耐受基因、紅霉素耐受基因以及氯霉素耐受基因不位于基因組DNA上,同時(shí),受試菌株均無(wú)質(zhì)粒,因此可以初步判斷受試菌株抗藥性不會(huì)進(jìn)行傳遞。

嗜熱鏈球菌,抗藥性,紙片擴(kuò)散法,抗藥基因,質(zhì)粒

乳酸菌是一大類能利用碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的統(tǒng)稱,它們大多來(lái)源于人或其他動(dòng)物腸道的正常菌群,被認(rèn)為是無(wú)致病可能性的微生物[1]。近年來(lái),很多乳酸菌被檢測(cè)出具備某種或多重抗生素抗性[2-3]。乳酸菌出現(xiàn)抗藥性可以增強(qiáng)乳酸菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性,但是一些抗性基因能在乳酸菌與病原菌之間進(jìn)行傳播,這就對(duì)人類的健康造成了潛在的風(fēng)險(xiǎn),如存在于接合質(zhì)粒pRE25上的氯霉素、紅霉素抗性基因能從糞腸球菌轉(zhuǎn)移到李斯特菌、乳酸菌等多種細(xì)菌中[4]。歐洲食品安全局(EFSA)建議攜帶有可轉(zhuǎn)移抗性基因的菌株不應(yīng)該用于動(dòng)物飼料、可食用性發(fā)酵制品和益生菌制品[5]。

國(guó)外針對(duì)乳酸菌的抗藥性方面進(jìn)行了大量的研究。Devirgiliis等系統(tǒng)地報(bào)道了食源性乳酸菌對(duì)四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類等抗生素的抗性、抗性機(jī)制及抗性有關(guān)的基因,如干酪乳桿菌、乳酸乳球菌的抗四環(huán)素基因(tetM)位于轉(zhuǎn)座子Tn916上,植物乳桿菌抗紅霉素的質(zhì)?；騟rmB,加氏乳球菌抗四環(huán)素基因(tetM)位于轉(zhuǎn)座子Tn6086上[6]。國(guó)內(nèi)對(duì)乳酸菌抗藥性的研究起步較晚,且多局限在表型分析上,缺乏對(duì)抗藥基因的系統(tǒng)研究[7-8]。本研究對(duì)從菌種庫(kù)中篩選的共五株高產(chǎn)粘嗜熱鏈球菌進(jìn)行抗藥性研究,從表型、基因型以及抗性基因的水平轉(zhuǎn)移方面系統(tǒng)了解菌株的抗藥性,為進(jìn)一步深入研究乳酸菌的抗藥性及安全性提供有價(jià)值的參考資料。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

表2　乳酸菌常見(jiàn)抗生素抗性基因引物

菌種嗜熱鏈球菌:KLDS 3.1012,KLDS 3.1014,KLDS-SM,KLDS 3.0206,KLDS 3.0207,瑞士乳桿菌KLDS 1.8701,均來(lái)自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;M17肉湯培養(yǎng)基、M17瓊脂培養(yǎng)基青島海博生物技術(shù)有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒天根試劑有限公司;藥敏紙片杭州濱和微生物試劑有限公司。

PCR擴(kuò)增儀9700ABI公司;VD-1320潔凈工作臺(tái)北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司;凝膠成像系統(tǒng)美國(guó)Upland公司;DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋余姚市東方電工儀器廠;DB-3B型電子天平沈陽(yáng)龍騰電子有限公司;HVE-50型全自動(dòng)高壓滅菌鍋日本日立。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌種活化將從菌種庫(kù)取來(lái)的菌液以1%(體積分?jǐn)?shù))接種量接種至M17液體培養(yǎng)基中,于42 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后用精確度0.02 mm的游標(biāo)卡尺測(cè)量并記錄抑菌圈直徑,每種抗生素均設(shè)3個(gè)重復(fù),結(jié)果取平均值。

1.2.2抗生素抗性判斷標(biāo)準(zhǔn)受試菌株對(duì)15種抗生素的抗性參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)公布的藥敏試紙最新標(biāo)準(zhǔn)[9](見(jiàn)表1)進(jìn)行判斷,受試菌對(duì)該抗生素敏(susceptible)用S表示,中度敏感(intermediate)用I表示,耐藥(resistant)用R表示。

1.2.3抗藥性的基因型分析使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取五株嗜熱鏈球菌的基因組DNA。利用文獻(xiàn)中乳酸菌中常見(jiàn)抗生素抗性基因特異性引物,耐四環(huán)素基因(tetM,tetS,tetW)、耐紅霉素基因(ermA,ermB,msrA/B)和耐氯霉素基因(cat),對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株的抗藥性進(jìn)行分析。引物序列見(jiàn)表2,引物由北京華大基因公司合成。分別以五株實(shí)驗(yàn)菌株基因組DNA為模板,PCR反應(yīng)條件如下:94 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性1 min,50～56 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35個(gè)循環(huán),72 ℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后取6 μL的PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣于1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳(120 V,30 min),紫外燈下觀察并照相記錄。

表1　15種藥敏紙片含藥量及抗性判斷標(biāo)準(zhǔn)

注:*:青霉素藥物含量單位為“U”。

1.2.4質(zhì)粒DNA的檢測(cè)使用質(zhì)粒提取試劑盒提取五株嗜熱鏈球菌的質(zhì)粒DNA。將0.2 g瓊脂糖溶解于20 mL的1×TAE電泳緩沖液中,冷卻至室溫,并向其中加入0.5 μL溴乙錠,倒入電泳槽中制備電泳所用的膠。將5 μL提取完質(zhì)粒的液體與1 μL的6×Loading Buffer混合,向瓊脂糖凝膠中點(diǎn)樣。電壓為120 V,工作時(shí)間為30 min。電泳液為1×TAE溶液,電泳結(jié)束后,紫外燈下觀察并照相記錄。

2　結(jié)果與討論

2.1嗜熱鏈球菌抗藥性

根據(jù)受試菌株抑菌圈大小并結(jié)合表1的判斷標(biāo)準(zhǔn)得出五株嗜熱鏈球菌對(duì)15種常見(jiàn)抗生素藥敏性結(jié)果,見(jiàn)表3。

表3　實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)15種抗生素的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表3可見(jiàn),五株嗜熱鏈球菌有較為相似的耐藥譜,對(duì)哌拉西林、紅霉素、羅紅霉素、四環(huán)素、萬(wàn)古霉素、氧氟沙星均表現(xiàn)為敏感,對(duì)卡那霉素、慶大霉素均表現(xiàn)為耐藥,對(duì)青霉素G、氨芐青霉素的敏感性有很大的可變性,這與周寧[15]、凡琴[16]等的研究結(jié)果一致。KLDS SM,KLDS 3.0206分別對(duì)3種抗生素耐藥,KLDS 3.0207對(duì)6種抗生素耐藥,表現(xiàn)為多重耐藥性。KLDS 3.1012和KLDS 3.1014對(duì)除環(huán)丙沙星之外的所有抗生素均表現(xiàn)出相同的抗性,耐藥譜高度相似。由以上結(jié)果不難看出,同一屬的不同菌株的抗藥性也是存在差異的。

同一株菌對(duì)同一類抗生素的敏感性不同,KLDS SM、KLDS 3.0206、KLDS 3.0207分別對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素表現(xiàn)出了不同的抗藥性;對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類抗生素,所有受試菌株均表現(xiàn)出相同的抗藥性,即均表現(xiàn)為敏感。

藥敏紙片擴(kuò)散法測(cè)定乳酸菌抗藥性因操作簡(jiǎn)便且人力、時(shí)間和材料消耗少等優(yōu)勢(shì)而被國(guó)內(nèi)外研究工作者廣泛采用,該方法標(biāo)準(zhǔn)中只給出了臨床致病菌的判斷標(biāo)準(zhǔn),具有一定局限性,并且還受微生物的生理狀態(tài)、菌體濃度以及培養(yǎng)基成分等因素影響[17]。因此,嗜熱鏈球菌抗藥性的研究還常常借助于特異性引物的PCR方法。

2.2嗜熱鏈球菌耐藥基因的探討

提取受試菌株基因組DNA后,分別以ermA、ermB、msrA/B,tetM、tetS、tetL,cat為引物,通過(guò)PCR擴(kuò)增檢測(cè)其紅霉素耐藥基因、四環(huán)素耐藥基因和氯霉素耐藥基因,以KLDS3.1012基因組DNA的PCR結(jié)果為例(其他菌株結(jié)果與圖1一致)。由圖1可見(jiàn),均未擴(kuò)增出與表2中報(bào)道的相同大小的產(chǎn)物。初步認(rèn)為,五株受試菌株基因組DNA上不存在抗性基因ermA、ermB、msrA/B,tetM、tetS、tetL,cat。

圖1　KLDS 3.1012基因組DNA的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1　Electrophoresis of PCR products of genomic DNA of the strain KLDS 3.1012注:Lane 1,Maker DL2000;Lane2,16SrDNA,Lane 3～9分別對(duì)應(yīng)ermA、ermB、msrA/B,tetM、tetS、tetL,cat PCR產(chǎn)物。

2.3嗜熱鏈球菌質(zhì)粒檢測(cè)與分析

受試菌株質(zhì)粒提取電泳結(jié)果見(jiàn)圖2,自然條件下,細(xì)菌從外界獲得抗藥因子的主要方式是通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合,而傳遞的三種載體為接合質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子及插入序列因子。乳酸菌中普遍存在著接合質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座因子,接合作用被認(rèn)為是乳酸菌從環(huán)境中獲得抗藥基因的主要方式[18]。由圖2可知,五株實(shí)驗(yàn)菌株均不含質(zhì)粒,與張和平等人[19]關(guān)于乳酸菌基因組學(xué)的研究結(jié)果一致。因此可以排除抗藥基因通過(guò)質(zhì)粒進(jìn)行傳播的可能性。

圖2　質(zhì)粒提取電泳圖Fig.2　Electrophoresis of plasmid注:Lane 1,Maker D15000;Lane2,質(zhì)粒陽(yáng)性菌KLDS1.8701;Lane 3～7分別對(duì)應(yīng)KLDS3.1012,KLDS3.1014,KLDS SM,KLDS3.0206,KLDS3.0207。

3　結(jié)論

通過(guò)對(duì)五株實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)可知,除KLDS3.0207外,受試菌株對(duì)常見(jiàn)抗生素耐藥率較低,敏感率較高,且對(duì)臨床上用于治療耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌感染的萬(wàn)古霉素敏感?；蚪M抗性基因的檢測(cè)表明,與受試菌株紅霉素、青霉素、氯霉素抗性相關(guān)的ermA、ermB、msrA/B、tetM、tetS、tetL、cat基因不在基因組DNA上。在質(zhì)粒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)菌株均不含有質(zhì)粒,切斷了抗藥基因通過(guò)質(zhì)粒傳播的路徑。所以,初步認(rèn)定五株嗜熱鏈球菌不會(huì)做為抗性基因的傳遞者,具有較高的潛在的市場(chǎng)應(yīng)用價(jià)值。

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Study on antibiotic resistance ofStreptococcusthermophilus

ZHANG Dan-qing,LI Wan,DING Xiu-yun,Shuvan Kumar Sarker,HUO Gui-cheng*

(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

The antibiotic sensitivity ofStreptococcusthermophilus(KLDS3.1012,KLDS3.1014,KLDS-SM,KLDS3.0206,KLDS3.0207)to 15 kinds of antibiotics was tested with agar disc diffusion method. The results showed KLDS3.1014 was resistant to 2 kinds of antibiotics,KLDS3.1012、KLDS-SM、KLDS3.0206 were resistant to 3 kinds of antibiotics respectively,and only KLDS3.0207 was resistant to more than 3 kinds of antibiotics. The genes(tetM,tetK,tetLandtetS)related to tetracycline resistance,genes(ermA,ermB,msrA/B)related to erythromycin resistance and gene(cat)related to chloramphenicol resistance were discussed. However,the genes were not found in the genomic DNA of strains above,besides,all the testing strains had no plasmid. It may preliminarily determined that the testing strains have no transferability of common antibiotic resistance genes.

Streptococcusthermophilus;antibiotic resistance;agar disc diffusion method;resistance genes;plasmid

2015-11-24

張丹青(1989-),女,碩士研究生,研究方向:食品科學(xué),E-mail:a10090119@163.com。

霍貴成(1958-),男,博士,教授,研究方向:食品微生物與生物技術(shù),E-mail:gchuo58@126.com。

國(guó)家863項(xiàng)目(2011AA100902)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)10-0154-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.022