基于原位生成的銅納米顆粒修飾的羧基化多壁碳納米管構(gòu)建同時檢測抗壞血酸、多巴胺、尿酸的電化學(xué)傳感器

王思遠(yuǎn)，鐘　霞，柴雅琴，袁　若

（發(fā)光與實時分析化學(xué)教育部重點實驗室，西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400715）

基于原位生成的銅納米顆粒修飾的羧基化多壁碳納米管構(gòu)建同時檢測抗壞血酸、多巴胺、尿酸的電化學(xué)傳感器

王思遠(yuǎn)，鐘霞，柴雅琴*，袁若*

（發(fā)光與實時分析化學(xué)教育部重點實驗室，西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400715）

一些傳統(tǒng)的生化小分子多組分同時檢測電化學(xué)傳感器多是利用貴金屬納米材料在電化學(xué)中的催化活性，但是往往都是合成制備成本較高限制了其實用前景。該工作用比較廉價的銅納米顆粒（CuNPs）修飾酸化的多壁碳納米管（MWCNTs）制備納米復(fù)合物（CuNPs@MWCNTs），代替貴金屬納米顆粒修飾碳材料，用比較低廉的成本構(gòu)建了抗壞血酸 （AA）、多巴胺 （DA）和尿酸 （UA）多組分同時檢測的電化學(xué)傳感器。CuNPs@MWCNTs修飾的電極對AA，DA和UA的氧化有很好的識別區(qū)分性，達(dá)到而且有些性能超過貴金屬材料制備的傳感器。在pH4.0的條件下用差分脈沖伏安法（DPV）傳感器在三組分共存體系中檢測抗壞血酸、多巴胺和尿酸的線性范圍分別為：10 μmol/L～1430 μmol/L，0.3 μmol/L～48.0 μmol/L，0.1 μmol/L～86.7 μmol/L，AA、DA、UA的檢測限依次是3.3 μmol/L，0.1 μmol/L，0.03 μmol/L。因此，CuNPs@MWCNTs構(gòu)建的傳感器提供了一個比貴金屬納米顆粒成本較為低廉的進(jìn)行靈敏快速有選擇性的抗壞血酸、多巴胺和尿酸多組分同時檢測的裝置，在生物科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有很好的應(yīng)用發(fā)展前景。

抗壞血酸；多巴胺；尿酸；銅納米顆粒；同時檢測

0　引言

多巴胺（DA）、抗壞血酸（AA）和尿酸（UA）是很多生理過程中重要的生化分子［1］。其中，多巴胺是一種兒茶酚的衍生物，作為一種神經(jīng)傳遞素，與一些物質(zhì)成癮有很大關(guān)系。它可以影響大腦控制運動、情感的過程，也能讓人感受到愉快和疼痛［2］。抗壞血酸是一種水溶性維生素，是人體必需的營養(yǎng)成分。在生物體內(nèi)，它作為抗氧化物可以保護(hù)身體免受氧化應(yīng)激的攻擊［3］。尿酸是嘌呤代謝主要最終產(chǎn)物，已經(jīng)被證明可以導(dǎo)致高尿酸血癥和痛風(fēng)［4］。通常這些功能性的生物分子共存在生理體液中。因此，在衛(wèi)生保健、臨床診斷、生物分析和病理研究等很多領(lǐng)域，急需發(fā)展一種高效的有選擇性的靈敏的可以對這幾種重要生物分子同時檢測的方法。

因為AA，DA和UA都是電活性物質(zhì)，電化學(xué)技術(shù)以其快速的響應(yīng)、良好的選擇性和靈敏度還有易于在有機(jī)體內(nèi)分離等優(yōu)點，引起很多關(guān)注用來對生化小分子同時檢測［5-6］。 然而，AA，DA 和UA因為有很近的氧化電位，所以很難實現(xiàn)在常用的裸電極上用伏安法同時檢測這三種分子［7］。所以為了達(dá)到這個目的，電極必須修飾上帶有分開這些分析物氧化峰的結(jié)構(gòu)。很多修飾電極被用來設(shè)計構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器，尤其基于納米材料的，特別是金屬納米顆粒和碳納米材料（例如碳納米管）［8］。其中貴金屬（金、鉑等）納米顆粒因為其形貌使其具有電催化活性和介導(dǎo)快速電子傳遞到電極表面的能力［8］。但是貴金屬制備的納米復(fù)合物的成本高昂，如果能有成本較為低廉的金屬復(fù)合碳納米材料制備納米復(fù)合物構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器，將會在相關(guān)領(lǐng)域中有很大的應(yīng)用前景。銅，作為一種良好的導(dǎo)電材料，得到研究者的關(guān)注，其不同的納米結(jié)構(gòu)可以使其具有應(yīng)用于電化學(xué)的特性。有報道高密度的銅納米線可以催化二氧化碳的低電位還原［9］。還有將銅和鉑制成多孔的合金可以催化甲醇和乙醇的氧化［10］。在生化小分子檢測方面，已有研究者將銅納米顆粒（CuNPs）固載到雙聯(lián)DNA上用熒光的方法檢測多巴胺［11］。

綜合前面的闡述，設(shè)計用酸化帶有羧基的多壁碳納米管（MWCNTs-COOH）在水相中依靠正負(fù)電荷吸附硫酸銅中的Cu2+，用AA將Cu2+還原成銅納米顆粒（CuNPs），得到CuNPs修飾MWCNTs制備的納米復(fù)合物（CuNPs@MWCNTs）。碳納米管較高的比表面積和良好的電化學(xué)催化性能，還有羧基基團(tuán)提供有選擇性的氫鍵結(jié)合位點來區(qū)別連接AA，DA，UA的提供質(zhì)子的基團(tuán)，有助于區(qū)分AA，DA，UA的氧化峰。此外，CuNPs有助于氧化反應(yīng)中的電子傳遞，也具有電化學(xué)催化活性。因此，該章設(shè)計的CuNPs@MWCNTs納米復(fù)合物構(gòu)建的電化學(xué)傳感器可以對多巴胺、抗壞血酸和尿酸三種生化小分子進(jìn)行多組分電化學(xué)同時檢測，為生化小分子傳感裝置提供了一個選擇性好、成本低廉有應(yīng)用前景的選擇。

1　實驗部分

1.1化學(xué)試劑

多壁碳納米管（MWCNTs，純度95%）從中科院成都有機(jī)化學(xué)品有限公司（中國，成都）購買。硫酸銅（CuSO4·5H2O）采購自天津市瑞金特化學(xué)品有限公司（中國，天津）。多巴胺從Sigma化學(xué)試劑公司 （St.Louis，MO，USA）購買。抗壞血酸（AA）和尿酸（UA，純度99%）購于阿拉丁試劑有限公司（中國，成都）。聚（酰胺-胺）分子（PAMAM，G5.0-NH2）采購于威海晨源分子新材料有限公司（中國，威海）。其他化學(xué)試劑盒溶劑都是分析純級別，該實驗用水為超純水 （電阻率18.2 MΩ· cm）。不同pH的磷酸鹽緩沖溶液（PBS 0.1 mol/L）用0.10 mol/L Na2HPO4和0.10 mol/L NaH2PO4溶液配制，支持電解質(zhì)是0.10 mol/L KCl溶液。

1.2實驗儀器

電化學(xué)的相關(guān)實驗在電化學(xué)分析測試系統(tǒng)（CHI660C，上海辰華儀器公司）上進(jìn)行。實驗用三電極體系包括：玻碳電極（GCE Φ=4 mm）作為工作電極；飽和甘汞電極（SCE）作為參比電極；輔助電極是鉑絲電極。所有的檢測實驗都在室溫下進(jìn)行。

1.3CuNPs@MWCNTs納米材料的合成

此復(fù)合材料按照如下方法制備：稱取3.0 mg羧基化的MWCNTs，超聲0.5 h分散在3 mL超純水中，加入4.6 mmol/L CuSO4溶液300 μL，攪拌4 h。將懸濁液超聲均勻后，滴加11.2 mg的AA溶液（2 mL），80℃下水浴加熱攪拌12 h。待冷卻后，超聲分散均勻，用去離子水離心洗滌2次。最終得到的離心固體，中超聲2 h在1 mL水中分散均勻，在4℃下冷藏儲存待后續(xù)試驗使用。

1.4傳感器的構(gòu)建

玻碳電極 （GCE）分別用粒徑為0.3和0.05 μm的氧化鋁粉末依次打磨拋光，再按照水-乙醇-水的順序依次超聲洗滌。洗好的玻碳電極在室溫下干燥。待電極干燥后，用移液槍滴加7 μL上述CuNPs@MWCNTs復(fù)合納米材料的分散液于電極表面。在室溫下，空氣中干燥靜置8 h，即可得到CuNPs@MWCNTs/GCE的傳感器。

2　結(jié)果與討論

2.1納米復(fù)合物的SEM表征

用掃描投射電鏡（SEM）表征了此部分合成的納米材料的形態(tài)學(xué)和微觀結(jié)構(gòu) （圖1）。通過SEM可以很明顯地看到MWCNTs的管狀線條結(jié)構(gòu)，同時上面的明亮的部分是大量固載銅納米顆粒的位置，這主要是因為銅有良好的導(dǎo)電性，所以大量CuNPs固載到MWCNTs上的一段在掃描電鏡下會顯示出在碳納米管上明亮的一段結(jié)構(gòu)。因此，這說明上述設(shè)計的納米復(fù)合物被成功的合成。

圖1　CuNPs@MWCNTs納米復(fù)合物的SEM圖Fig.1　SEM images of CuNPs@MWCNTs hybrids

2.2檢測條件的pH優(yōu)化

同前兩章一樣，因為檢測的生化小分子電化學(xué)氧化有質(zhì)子的參與，所以選擇的PBS緩存溶液的pH對AA，DA和UA的多組分檢測有很大影響。因此差分脈沖伏安法（DPV）被用來考察了pH對AA （0.2 mmol/L），DA （4 μmol/L）和UA（2 μmol/L）檢測的影響（圖2）。首先抗壞血酸、多巴胺和尿酸的氧化峰電位都伴隨著pH值的增大而向負(fù)電位方向移動，所以在pH6.0和pH7.0的考察電位范圍改到-0.4 V～+0.8 V。在近中性的pH下（pH5.0～pH7.0），抗壞血酸和尿酸的氧化峰電流會逐漸降低，多巴胺的氧化電流會增大，這說明在pH5.0～pH7.0的范圍多巴胺有很好的感應(yīng)信號，而抗壞血酸和尿酸的響應(yīng)沒有很明顯。而在pH4.0，相對于電極的背景電流，AA，DA和UA都會有較好的氧化峰可以被觀察到，并且峰電位的間距也足夠大，克服了三種生化小分子電化學(xué)氧化峰重疊的情況。而在pH3.0條件下，雖然AA 和UA的峰電流要大于在pH4.0的，但是考慮到背景電流和三者的氧化峰電位的因素，DA和AA的氧化峰間距不夠大，使得兩個峰有部分重疊。綜上所述，pH4.0是最理想的在CuNPs@MWCNTs傳感器上抗壞血酸、多巴胺和尿酸多組分同時檢測的條件，后續(xù)的實驗采用 0.1 mol/L PBS （pH4.0）作為緩沖溶液。

圖2　在CuNPs@MWCNTs/GCE上AA（0.2 mmol/L），DA （20 μmol/L）and UA（20 μmol/L）處于不同pH的0.1 mol/L PBS中的DPV曲線Fig.2　DPVs of the CuNPs@MWCNTs modified GCE in 0.1 mol/L PBS containing AA（0.2 mmol/L），DA（20 μmol/L）and UA（20 μmol/L）at different pH value

2.3對抗壞血酸、多巴胺和尿酸的同時檢測

該文的主要目標(biāo)就是用CuNPs@MWCNTs材料構(gòu)建的電化學(xué)傳感器也能達(dá)到其他貴金屬材料構(gòu)建的傳感器用來對共存的抗壞血酸、多巴胺和尿酸多組分同時檢測的目的。用CuNPs@MWCNTs修飾的電極構(gòu)建傳感器對AA，DA和UA加入不同濃度進(jìn)行了DPV研究（圖3）?？梢钥吹皆?.1mol/L PBS（pH4.0）中，抗壞血酸、多巴胺和尿酸的氧化峰完全分開，并且每種小分子的濃度增加對應(yīng)的氧化電流都在增加。在CuNPs@MWCNTs/ GCE上，抗壞血酸、多巴胺和尿酸的氧化峰電位分別是+0.068 V，+0.316 V和+0.460 V。在0.1 V左右有個材料的背景電流增大現(xiàn)象，不過抗壞血酸加入后會在背景電流基礎(chǔ)上顯示出氧化電流，說明對AA的檢測并無影響。這個實驗結(jié)果說明CuNPs@MWCNTs傳感器可以實現(xiàn)良好的AA，DA和UA多組分的同時檢測。

圖3　在0.1 mol/L PBS（pH4.0）中加入不同的濃度的AA，DA和UA的傳感器DPV曲線，由下到上濃度依次為：［AA］:0.02，0.06，0.16，0.26，0.46，0.66，0.96，1.36，1.05 mmol/L.［DA］:0.5，1.5，2.5，4.5，8.5，13.5，23.5，33.5 and 53.5 μmol/L.［UA］:0.5，1.5，2.5，4.5，8.5，14.5，24.5，44.5 and 74.5 μmol/LFig.3　DPV curves of the sensor in 0.1 mol/L PBS（pH4.0）containing individual concentration of AA，DA and UA mixture.［AA］:0.02，0.06，0.16，0.26，0.46，0.66，0.96，1.36 and 1.05 mmol/L.［DA］:0.5，1.5，2.5，4.5，8.5，13.5，23.5，33.5 and 53.5 μmol/L.［UA］:0.5，1.5，2.5，4.5，8.5，14.5，24.5，44.5 and 74.5 μmol/L

2.4傳感器對抗壞血酸、多巴胺和尿酸的線性考察

此外，為了定量地檢測這三種分子，還做了每種分子在三組分中傳感器DPV線性響應(yīng)。固定兩種物質(zhì)的濃度，改變另一種分析物的濃度用傳感器對其進(jìn)行檢測（圖4）。AA，DA和UA的具體DPV曲線分別一次在圖4a，b，c中。圖4a中說明了在DA（10 μmol/L）和UA（20 μmol/L）存在下不同濃度的AA的DPV相應(yīng)，得到的抗壞血酸線性方程為I（μA）=67.64+0.0489cAA（μmol/L），線性相關(guān)系數(shù)rAA=0.9995，抗壞血酸的線性范圍是10 μmol/L～1430 μmol/L。圖4b中，多巴胺的峰電流隨DA濃度從0.3 μmol/L到48 μmol/L增加而增加，其中AA濃度0.2 mmol/L，UA濃度10 μmol/L。多巴胺的線性方程是 I（μA）=41.97+3.27cDA（μmol/L），相關(guān)系數(shù)rDA=0.9899。圖4c展示的是在0.2 mmol/L抗壞血酸和 10 μmol/L多巴胺存在下，尿酸的DPV隨濃度變化的相應(yīng)。其線性范圍是0.1 μmol/L～86.7 μmol/L，線性方程是I（μA）= 15.57+1.03cUA（μmol/L）與線性相關(guān)系數(shù) rUA= 0.9930。此外，抗壞血酸、多巴胺和尿酸的檢測下線分別是3.3 μmol/L，0.1 μmol/L，0.03 μmol/L （S/N=3）。此結(jié)果說明CuNPs@MWCNTs傳感器可以實現(xiàn)對抗壞血酸、多巴胺和尿酸在共存條件下的定量檢測，并且比一些貴金屬材料構(gòu)建的傳感器有更好的檢測限和靈敏度。其中的原因可能歸因于以下幾點：（1）多壁碳納米管有大的電化學(xué)活性表面積、良好的穩(wěn)定性、良好的催化活性；（2）酸化的多壁碳納米管帶有很多羧基基團(tuán)，這些功能化的基團(tuán)可以提供有選擇性的氫鍵結(jié)合位點來區(qū)別連接AA，DA，UA的提供質(zhì)子的基團(tuán)，從而達(dá)到區(qū)分幾種小分子的氧化電位目的；（3）CuNPs有良好的導(dǎo)電性，有助于氧化反應(yīng)是電子的傳遞過程，提高了傳感器的靈敏度。歸納起來，CuNPs@MWCNTs傳感器在抗壞血酸、多巴胺和尿酸多組分同時檢測方面有很好的靈敏度、選擇性和高的催化活性。

3　結(jié)論

在此項工作中，將CuSO4原位還原在酸化的MWCNTs上制備納米復(fù)合物來修飾電極，構(gòu)建了一個可以對抗壞血酸、多巴胺和尿酸多組分同時檢測的傳感器。CuNPs@MWCNTs所修飾的電極解決了AA，DA和UA三種生化小分子氧化峰重疊問題，通過DPV的方法把三者的氧化峰良好地區(qū)分開來。CuNPs@MWCNTs傳感器具對抗壞血酸、多巴胺和尿酸具有良好的選擇性和靈敏度。與一些貴金屬材料制備納米材料所構(gòu)建的傳感器相比，CuNPs@MWCNTs納米復(fù)合材料在生化小分子多組分電化學(xué)同時檢測方面提供了一個有前景、成本更低廉、同樣有效的選擇。

圖4　在0.1 mol/L PBS（pH4.0）中，（a）含有10 μmol/L DA，20 μmol/L UA，不同濃度AA的DPV曲線（從低到高依次為）：10，40，80，130，230，430，630，830，1430 μmol/L；（b）含有0.2 mmol/L AA，10 μmol/L UA，不同濃度DA的DPV曲線（從低到高依次為）：0.3，1，2，4，8，12，18，38，48 μmol/L；（c）含有0.2 mmol/L AA，10 μmol/L DA，不同濃度UA的DPV曲線（從低到高依次為）：0.1，0.7，1.7，2.7，4.7，8.7，26.7，46.7，86.7 μmol/L。（插圖分別為AA，DA，UA的線性擬合）Fig.4　DPV curves at the sensor in 0.1 mol/L PBS（pH4.0）（a）containing 10 μmol/L DA，20 μmol/L UA and different concentrations of AA（from inner to outer）:10，40，80，130，230，430，630，830，1430 μmol/L；（b）containing 0.2 mmol/L AA，10 μmol/L UA and different concentrations of DA（from inner to outer）:0.3，1，2，4，8，12，18，38，48 μmol/L；（c）containing 0.2 mmol/L AA，10 μmol/L DA and different concentrations of UA（from inner to outer）:0.1，0.7，1.7，2.7，4.7，8.7，26.7，46.7，86.7 μmol/L，respectively

［1］Zhang X，Ma L X，Zhang Y C.Electrodeposition of platinum nanosheets on C60decorated glassy carbon electrode as a stable electrochemical biosensor for simultaneous detection of ascorbic acid，dopamine and uric acid ［J］.Electrochim.Acta，2015，177:118-127.

［2］Daneshinejad H，Chamjangali M A，Goudarzi N，et al. Application of a thin film of poly（solochrome black T）as a redox mediator for the electro-catalytic simultaneous determination of dopamine and acetaminophen in the pharmaceutical and biological samples［J］.Mater.Sci. Eng.，C，2016，58:532-540.

［3］Wang C，Zou X，Zhao X，et al.Cu-nanoparticles incorporated overoxidized-poly（3-amino-5-mercapto-1，2，4-triazole）film modified electrode for the simultaneous determination of ascorbic acid，dopamine，uric acid and tryptophan［J］.J.Electroanal.Chem.，2015，741:36-41.

［4］Dutt V V S E，Mottola H A.Determination of uric acid at the microgram level by a kinetic procedure based on a pseudo-induction period［J］.Anal.Chem.，1974，46: 1777-1781.

［5］Ronkainen N J，Halsall H B，Heineman W R.Electro-chemical biosensors［J］.Chem.Soc.Rev.，2010，39: 1747-1763.

［6］Kimmel D W，LeBlanc G，Meschievitz M E，et al.Electrochemical sensors and biosensors［J］.Anal.Chem.，2011，84:685-707.

［7］Zen J M，Chen P J.A selective voltammetric method for uric acid and dopamine detection using clay-modified electrodes［J］.Anal.Chem.，1997，69:5087-5093.

［8］Chen A C，Chatterjee S.Nanomaterials based electrochemical sensors for biomedical applications［J］.Chem. Soc.Rev.，2013，42:5425-5438.

［9］Raciti D，Livi K J，Wang C.Highly dense Cu nanowires for low-overpotential CO2Reduction［J］.Nano letters，2015，15:6829-6835.

［10］Fan Y，Liu P F，Zhang Z W，et al.Three-dimensional hierarchical porous platinum-copper alloy networks with enhanced catalytic activity towards methanol and ethanol electro-oxidation［J］.J.Power Sources，2015，296:282-289.

［11］Wang H B，Zhang H D，Chen Y，et al.A label-free and ultrasensitive fluorescent sensor for dopamine detection based on double-stranded DNA templated copper nanoparticles［J］.Sens.Actuators，B:Chem.，2015，220: 146-153.

A eletrochemical sensor based on MWCNTs immobilized Cu nanoparticles for simultaneous determination AA，DA and UA

Wang Si-yuan，Zhong Xia，Chai Ya-qin*，Yuan Ruo*
（Key Laboratory of Luminescent and Real-Time Analytical Chemistry，Ministry of Education（Southwest University），College of Chemistry and Chemical Engineering，Southwest University，Chongqing 400715，China）

Some conventional eletrochemical sensor for simultaneous determination AA，DA and UA often use noble metal material owing to its electrocatalytic activity in eletrochemistry，but the cost of synthesis is too high，which limits its practical prospects.A nanohybrid based on multi-walled carbon nanotubes（MWCNTs）immobilized Cu nanoparticles（CuNPs@MWCNTs）for simultaneous electrochemical determination of ascorbic acid（AA），dopamine （DA）and uric acid（UA）was reported in this work.The CuNPs@MWCNTs-modified electrode showed a high selectivity towards the oxidation of AA，DA，and UA，and resolve their overlapped oxidation peaks into three well-defined peaks.Several important parameters that control the performance of the electrochemical sensor were investigated and optimized.Under pH4.0 phosphate buffered saline（PBS）with differential pulse voltammetry（DPV）method，the linear response ranges for the determination of AA，DA，and UA are 10 μmol/L～1430 μmol/L，0.3 μmol/L～48.0 μmol/L，0.1 μmol/L～86.7 μmol/L in the co-existence systems，respectively，with the corresponding detection limits 3.3 μmol/L，0.1 μmol/L，0.03 μmol/L（S/N=3），respectively.In addition，the proposed sensors provide an efficient and promising for simultaneous determination of AA，DA and UA selectively and sensitively and it cost much lower than those using noble metal nanoparticles，which has a good application development prospects in the biological sciences，clinical medicine and other fields.

ascorbic acid；dopamine；uric acid；Cu nanoparticles；simultaneous determination

*通信聯(lián)系人，E-mail:yqchai@swu.edu.cn，yuanruo@swu.edu.cn