陸地棉低毒Bt基因?qū)γ掴徬x抗性的遺傳效應(yīng)分析

陳旭升,狄佳春,趙 亮

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟作物研究所/農(nóng)業(yè)部 長江下游棉花與油菜重點實驗室,江蘇 南京 210014)

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陸地棉低毒Bt基因?qū)γ掴徬x抗性的遺傳效應(yīng)分析

陳旭升,狄佳春,趙 亮

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟作物研究所/農(nóng)業(yè)部 長江下游棉花與油菜重點實驗室,江蘇 南京 210014)

以Bt低毒表達的陸地棉種質(zhì)系WG-20為試驗材料,與若干Bt高毒表達的抗蟲棉品系配制雜交組合,對其F1的Bt毒蛋白表達量、生物學(xué)抗蟲性進行了分析。結(jié)果顯示: Bt低毒表達性狀對高毒表達性狀表現(xiàn)為顯性,生物學(xué)抗蟲性也是低抗性狀對抗級性狀表現(xiàn)為顯性,即低毒Bt基因?qū)Ω叨綛t基因表現(xiàn)為顯性抑制現(xiàn)象； Bt高毒表達材料之間雜交組合的F1則呈現(xiàn)Bt高毒表達,生物學(xué)抗性表達規(guī)律也是如此，即高毒Bt基因間不存在同源Bt基因表達的沉默現(xiàn)象。

陸地棉;低毒Bt基因;抗蟲性;遺傳效應(yīng)

我國棉花的生產(chǎn)與消費在國計民生中的地位舉足輕重。鱗翅目害蟲一直嚴(yán)重危害棉花生產(chǎn)。從20世紀(jì)80年代末至90年代初,棉鈴蟲在我國主產(chǎn)棉區(qū)持續(xù)性大暴發(fā),給棉花生產(chǎn)造成了災(zāi)難性的損失,僅1997年在長江流域棉區(qū)凈減產(chǎn)就約達10萬t,黃河流域棉區(qū)凈減產(chǎn)則高達152萬t,造成的經(jīng)濟損失近100億元[1]。傳統(tǒng)的作物育種技術(shù)無法從根本上解決抗棉鈴蟲的難題。而自20世紀(jì)90年代以來,轉(zhuǎn)基因技術(shù)通過導(dǎo)入外源抗蟲基因再結(jié)合傳統(tǒng)育種技術(shù),在棉花抗蟲育種方面取得了巨大成功。轉(zhuǎn)基因抗蟲棉除對棉鈴蟲等鱗翅目害蟲具有顯著的抑制與毒殺作用外,還可以降低棉鈴蟲等害蟲的蟲口基數(shù),從而使棉花受棉鈴蟲的危害大大降低。同時,種植抗蟲棉,因大大減少了棉田農(nóng)藥噴施,使高溫季節(jié)棉農(nóng)中毒概率急劇下降,不但保護了棉田生態(tài)環(huán)境,也有效地保障了棉農(nóng)在棉田作業(yè)中的生命安全[2-4]。

相關(guān)研究業(yè)已表明:轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的抗性維系,一方面取決于Bt毒蛋白的表達劑量，另一方面取決于棉花群體的抗蟲性純度[5-6]。Bt基因低毒蛋白的表達易誘導(dǎo)鱗翅目昆蟲產(chǎn)生抗性,從而可能使棉花抗蟲性體系崩塌。因此,我國轉(zhuǎn)基因棉花品種的生產(chǎn)應(yīng)用安全性評價,對抗蟲棉毒蛋白的表達量極為關(guān)注,并作為一個品種能否通過安全性評價的重要依據(jù)。本研究以一個高產(chǎn)但Bt基因低毒表達的陸地棉品系WG-20為試驗材料,將其與Bt高毒表達的抗蟲棉品系進行雜交,分析了雜交后代毒蛋白表達的遺傳效應(yīng)與生物學(xué)抗蟲性,旨在為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的遺傳育種與生產(chǎn)安全應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

本實驗采用5個抗蟲棉種質(zhì)系:WG-20、SM-14、L1138、SM037、K047，其中WG-20為Bt低毒表達親本,其余為Bt高毒表達親本。然后配制5個雜交組合:SM-14×WG-20、WG-20×L1138、SM037×WG-20、SM037×L1138、SM037×K047。

1.2試驗方法

1.2.1毒蛋白含量的測定在花蕾期,取各親本與雜交組合的頂部小真葉,對每個材料隨機取5片，然后磨樣、稱重。毒蛋白的定量測定采用Bt(Cry1Ab/Ac)ELISA試劑盒,按說明書中的方法進行。每個材料測定3次,取平均值。

1.2.2生物學(xué)抗蟲性的測定棉鈴蟲抗性鑒定在江蘇省農(nóng)科院植保所進行。從棉田采集棉鈴蟲,在恒溫養(yǎng)蟲室內(nèi)用人工飼料飼養(yǎng)形成標(biāo)準(zhǔn)蟲種。養(yǎng)蟲室內(nèi)溫、光條件:每日光照16 h,溫度為26 ℃。試驗開始于7月13日,取羽化后室內(nèi)交配2 d的棉鈴蟲蛾，用于棉田罩籠接蛾鑒定試驗:在每個罩籠中接入棉鈴蟲蛾75對,任其產(chǎn)卵為害；于接蛾后第10天、14天,兩次檢查記載蕾鈴總數(shù)、被害蕾鈴數(shù)、棉鈴蟲活蟲數(shù)與活蟲齡期等,每重復(fù)每品種檢查10株。

抗性評判:將各品種單次表現(xiàn)“高抗”的抗性值賦為4,表現(xiàn)“抗”的賦為3,“低抗”的賦為2,“不抗”的賦為1,累計各項次鑒定的抗性值，取平均數(shù),得到該品種的平均抗性值(PK)。綜合評判的抗性等級根據(jù)PK值的大小來量化,其抗級評判標(biāo)準(zhǔn)為: PK≤1.5，不抗；1.53.5，高抗。

1.2.3雜交育種實踐以WG-20為親本，與高毒Bt抗蟲親本J668雜交,配制組合WG-20×J668。該雜交組合于2012年參加了江蘇省棉花區(qū)域試驗。試驗方法與結(jié)果統(tǒng)計按江蘇省區(qū)試試驗方法進行。該年度參試的雜交組合共計12個,對照為抗蟲雜交棉“泗雜3號”。全省布8個試點(大豐、東臺、東辛、灌云、六合、射陽、太倉、鹽城)。隨機區(qū)組排列,3次重復(fù),小區(qū)面積20 m2。江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保所進行抗棉鈴蟲、抗病性鑒定,農(nóng)業(yè)部棉花品質(zhì)監(jiān)督檢測測試中心檢測纖維品質(zhì)。

2　結(jié)果與分析

2.1親本及其雜交F1的Bt毒蛋白表達量

前人的研究顯示,外源Bt基因在雜交后代呈簡單的顯性質(zhì)量遺傳方式[7-10];但迄今未見低毒Bt基因與高毒Bt基因之間的顯隱性關(guān)系的研究報道。本研究將低毒Bt表達親本與高毒Bt表達親本雜交，以及在高毒Bt表達親本之間進行雜交,測定各親本及其雜交F1的Bt毒蛋白表達量，將測定結(jié)果列于表1。由表1可見:親本W(wǎng)G-20屬于Bt低毒表達,毒蛋白平均值為88.8 ng/g；其余親本SM-14、L1138、SM037和K047為Bt高毒表達,它們的毒蛋白表達量分別為1997.5、520.4、1348.7、1928.4 ng/g。

從表1還可以看出:(1)以低毒Bt表達親本W(wǎng)G-20所配的3個雜交組合SM-14×WG-20、WG-20×L1138、SM037×WG-20,不管WG-20作為父本還是母本,其F1均為Bt低毒表達。其中雜交組合SM-14×WG-20 F1的Bt毒蛋白表達量為245.2 ng/g,只有高毒親本表達量的12.3%、中親值的23.5%。組合WG-20×L1138 F1的Bt毒蛋白表達量為154.1 ng/g,只有高毒親本表達量的29.6%、中親值的50.6%。組合SM037×WG-20 F1的Bt毒蛋白表達量為191.2 ng/g,只有高毒親本表達量的14.2%、中親值的26.6%。以上結(jié)果表明低毒Bt對高毒Bt的表達在遺傳上呈現(xiàn)顯性抑制效應(yīng)；(2)高毒Bt親本間的2個雜交組合,其F1均呈現(xiàn)Bt毒蛋白的高表達，其中組合SM037×K047 F1的Bt毒蛋白表達量為1826.6 ng/g,為高毒親本表達量的94.7%、中親值的111.5%。組合SM037×L1138 F1的Bt毒蛋白表達量為1318.0 ng/g,為高毒親本表達量的97.7%、中親值的141.0%。以上結(jié)果表明高毒Bt基因間的表達在遺傳上并不存在同源Bt基因間的抑制效應(yīng)。

表1　親本與雜交F1葉片樣品的Bt毒蛋白表達量 ng/g

2.2親本及其雜交F1的生物學(xué)抗蟲性表現(xiàn)

由于棉鈴蟲的為害主要在棉花蕾鈴期,因此Bt抗蟲棉在蕾鈴期對棉鈴蟲的抗性顯得尤為重要。蕾鈴期的生物學(xué)抗蟲性鑒定采用田間罩籠接蛾法,將試驗結(jié)果列于表2。由表2可見:以低抗親本W(wǎng)G-20與抗性親本SM-14、L1138、SM037雜交,其雜交F1的生物學(xué)抗蟲性均表現(xiàn)為低抗;而抗性親本SM037與抗性親本L1138、K047雜交,其F1的生物學(xué)抗蟲性則均表現(xiàn)為抗;而常規(guī)棉對照蘇棉9號對棉鈴蟲的抗性為“感”。以上結(jié)果表明: Bt低抗性狀對抗級性狀的表達表現(xiàn)為顯性抑制效應(yīng);而在Bt抗級性狀間則不存在同源Bt基因的抗性沉默效應(yīng),其雜交F1仍表現(xiàn)為抗級。

表2　抗蟲親本及其雜交F1在蕾鈴期的生物學(xué)抗蟲性

注:在綜合抗性級別欄中，HR代表高抗, R代表抗,LR代表低抗,S代表感或不抗。

2.3雜交育種實踐驗證結(jié)果

以大鈴高衣分陸地棉種質(zhì)系WG-20為親本,與高毒Bt抗蟲親本J668配制雜交棉組合:WG-20×J668。該組合參加了2012年的江蘇省雜交棉區(qū)域試驗。

試驗結(jié)果:該雜交棉生育期130 d。株形緊湊,株高113.2 cm,果枝較長、平展,莖稈粗壯,茸毛較少,葉片較大,葉色較深,果枝始節(jié)位6.9節(jié),單株結(jié)鈴數(shù)29.1個,鈴卵圓形,單鈴重6.5 g,衣分40.7%,子指11.4 g,霜前花率88.0%,僵瓣率10.1%。出苗好,長勢較強,吐絮暢。在病圃接種鑒定中表現(xiàn)為耐枯萎病和耐黃萎病(枯萎病病指16.2,黃萎病病指33.1)。在纖維品質(zhì)測試中， HVICC纖維上半部平均長度為30.6 mm,斷裂比強度32.7 cN/tex,馬克隆值5.3,斷裂伸長率5.6%,反射率78.1%,黃色深度7.2,整齊度指數(shù)86.2%,紡紗均勻性指數(shù)154。籽棉和皮棉產(chǎn)量分別為3807.0、1552.5 kg/hm2,分別比對照泗雜3號增產(chǎn)9.1%、4.3%,增產(chǎn)幅度均達極顯著水平,居12個參試組合的第2位。在生物學(xué)抗蟲性鑒定中，該雜交棉平均抗性值PK為2.08,表現(xiàn)為低抗。

試驗結(jié)論:該雜交棉籽棉、皮棉產(chǎn)量高,鈴大、衣分高,纖維品質(zhì)較好;但因其生物學(xué)抗蟲性檢測結(jié)果為低抗棉鈴蟲,基于抗蟲棉生產(chǎn)應(yīng)用安全性的考量，決定將其淘汰,不再進入下一輪區(qū)試。

3　討論

對于轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉,國內(nèi)外已有很多研究報道;但不同抗蟲棉的Bt基因是否可能存在同源基因表達的抑制現(xiàn)象;不同轉(zhuǎn)基因事件之間的同源Bt基因序列重復(fù)是否會引起基因沉默,這些問題尚存爭議。有研究者認(rèn)為在同一個體中,如果同時存在多個同源的外源基因,不管是轉(zhuǎn)化后再次得到的,還是通過有性雜交獲得的,這些外源基因的表達都會受到抑制[11-12]。也有研究者認(rèn)為情況并非如此,外源基因的表達具有劑量與累加效應(yīng):單拷貝插入的高表達株間相互雜交,其F1代的轉(zhuǎn)基因活性與雙親相當(dāng),在F2代分離群體中,各單株的轉(zhuǎn)基因活性隨拷貝數(shù)多少而呈疊加性效應(yīng)[13-14]。唐燦明等(1997)[7]曾利用3個抗蟲親本配制雜交組合，其雜交F1的抗蟲性與親本類似,表明抗蟲基因在雜合狀態(tài)下無共抑制現(xiàn)象存在。

本研究涉及1個低毒Bt基因,研究顯示W(wǎng)G-20中的低毒Bt基因在F1呈顯性表達,毒蛋白含量低,即低毒Bt基因?qū)Ω叨綛t基因的表達具有顯性抑制效應(yīng)。由此可見,前人有關(guān)同源Bt基因之間沉默效應(yīng)的報道,是否可能是某些低毒表達轉(zhuǎn)化事件對高毒表達轉(zhuǎn)化事件產(chǎn)生的顯性抑制效應(yīng),從而在表型上表現(xiàn)為同源Bt基因的抑制或基因沉默效應(yīng),這個問題值得進一步甄別澄清。也許所謂某些同源Bt基因之間的表觀沉默效應(yīng),可能只是由Bt低毒表達基因?qū)Ω叨颈磉_基因的顯性抑制效應(yīng)所致。這就提示我們:在轉(zhuǎn)基因過程中,對獲得的低劑量表達轉(zhuǎn)化事件要及時予以剔除;否則很容易對后續(xù)的高表達轉(zhuǎn)化事件基因產(chǎn)生顯性抑制作用,在表觀上呈現(xiàn)所謂的基因沉默效應(yīng)。

本研究使用的親本W(wǎng)G-20,雖然Bt毒蛋白為低毒表達,但其綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良,并具有大鈴、高衣分特點(平均單鈴重達6.31 g,衣分高達44.3%),因此常被我們用做雜交育種親本。然而,低毒抗蟲棉的Bt基因由于在雜交后代呈顯性表達,在育種上是一個很不利的性狀。因此當(dāng)利用某些低毒Bt基因的優(yōu)良種質(zhì)系作為雜交親本時,建議在大田不治蟲條件下對其雜交分離群體進行抗蟲性篩選,將不抗蟲或抗蟲性差的材料在大田及時淘汰,這樣可以防止低毒Bt基因的不經(jīng)意擴散,而將抗蟲性強的轉(zhuǎn)基因材料保留下來，從而有效保障創(chuàng)制的抗蟲棉新種質(zhì)具有高效的抗蟲性與育成抗蟲棉的生產(chǎn)應(yīng)用安全。

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(責(zé)任編輯:黃榮華)

Genetic Effect Analysis of Resistance of An Upland Cotton with Low-toxic Bt Gene to Cotton Bollworm

CHEN Xu-sheng, DI Jia-chun, ZHAO Liang

(Institute of Industrial Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Cotton and Rape in Lower Reaches of Yangtze River, Ministry of Agriculture, Nanjing 210014, China)

In this study, the upland cotton germplasm WG-20 with low-toxic Bt gene was used as experimental material. Several hybrid combinations were made by crossing between WG-20 and some high-toxic-Bt insect-resistant cotton strains. The expression level of Bt toxalbumin, and the biological insect-resistance in F1were analyzed. The results showed that the expression character of low-toxic Bt was dominant to that of high-toxic Bt, and the character of low insect-resistance was also dominant to that of high insect-resistance, namely the expression of low-toxic Bt gene dominantly inhibited to the expression of high-toxic Bt gene. The expression of high-toxic Bt gene was found in the F1of hybrid combinations from high-toxic Bt cotton strains, and so was the expression of biological insect-resistance, namely the silent expression of homologous Bt gene did not exist among high-toxic Bt genes.

Upland cotton; Low-toxic Bt gene; Insect resistance; Genetic effect

2016-03-07

高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因棉花新品種培育科技重大專項子課題(2014ZX08005-001);轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項子課題(2016ZX08005-005)。

陳旭升(1965─),男,浙江樂清人,研究員,博士,主要從事棉花抗病蟲遺傳育種工作。

S435.622.9

A

1001-8581(2016)08-0001-04