薄層色譜法鑒別三黃片中的有效成分

李蒙蒙，田小杏，馬麗娟，蒲曉輝，袁 琦，宗蘭蘭，徐穎峰

1. 河南大學(xué) 藥物研究所，河南 開(kāi)封 475004； 2. 寧夏醫(yī)科大學(xué)總院兒童醫(yī)院 藥劑科，銀川 750004； 3. 河南大學(xué) 納米材料工程研究中心，河南 開(kāi)封 475004； 4. 天津天士力現(xiàn)代中藥資源有限公司，天津 300402

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薄層色譜法鑒別三黃片中的有效成分

1. 河南大學(xué) 藥物研究所，河南 開(kāi)封 475004； 2. 寧夏醫(yī)科大學(xué)總院兒童醫(yī)院 藥劑科，銀川 750004； 3. 河南大學(xué) 納米材料工程研究中心，河南 開(kāi)封 475004； 4. 天津天士力現(xiàn)代中藥資源有限公司，天津 300402

〔目的〕 探索薄層色譜二次展開(kāi)同時(shí)鑒別三黃片中7種有效成分的方法?！卜椒ā?參照薄層色譜法，以硅膠G為吸附劑，先以正己烷、乙酸乙酯、甲酸(30∶10∶0.5)為展開(kāi)劑，分離三黃片中大黃的5種成分(大黃酚、大黃素甲醚、大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素)，再以乙酸乙酯、丁酮、甲酸、水(10∶7∶1∶1)為展開(kāi)劑，進(jìn)行二次展開(kāi)，分離小檗堿和黃芩苷。分別在波長(zhǎng)為365 nm和254 nm的紫外燈下檢視。最后分別對(duì)三個(gè)不同廠家的各三批樣品進(jìn)行了鑒別?！步Y(jié)果〕 在三黃片供試品溶液的色譜圖中可以觀察到，三黃片供試品與對(duì)照品色譜在相同位置上呈相同顏色的斑點(diǎn)?！步Y(jié)論〕 通過(guò)實(shí)驗(yàn)可知，依本實(shí)驗(yàn)方案所得薄層色譜圖，斑點(diǎn)邊緣清晰、重現(xiàn)性好、專(zhuān)屬性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單，可用于三黃片7種有效成分的鑒別。

三黃片；成分鑒定；薄層色譜法

三黃片是一種常用的中成藥，2001年被認(rèn)定為國(guó)家第二批非處方藥。三黃片具有清熱解毒，泄火通便的功能[1]，療效確切、物美價(jià)廉，深受老百姓的喜歡。三黃片收載于《中國(guó)藥典(2015版)》，因由大黃、鹽酸小檗堿、黃芩浸膏三味處方組成，故稱(chēng)“三黃”。通常認(rèn)為，三黃片是從東漢張仲景《金匱要略》瀉心湯方劑得來(lái)，由大黃、黃芩、黃連三味藥組成，1958年由邯鄲制藥廠研制成片劑[2]，名為“三黃片”，后來(lái)又將處方改為大黃、黃芩和鹽酸小檗堿。三黃片是治療由腸胃濕熱引起的赤腫痛、口舌生瘡、大便秘結(jié)、心胸?zé)岬劝Y的理想藥物。通過(guò)臨床實(shí)踐，發(fā)現(xiàn)三黃片還有很多新功用[3]，能治療婦科疾病[4]，外用[5]治療膿包瘡的效果跟紅花膏的療效非常相似[6]，用于治療急慢性菌痢的效果極好。目前，全國(guó)已經(jīng)有十幾家藥廠生產(chǎn)三黃片，產(chǎn)品組方及生產(chǎn)工藝都是相對(duì)比較穩(wěn)定和合理的。因其藥物制備相對(duì)簡(jiǎn)單，通常由各診所自己配制成丸劑、散劑或湯劑，所以如何加強(qiáng)和提高三黃片的質(zhì)量檢測(cè)手段[7]、保證產(chǎn)品質(zhì)量，就顯得更為重要。然而，三黃片的主要成分沒(méi)有發(fā)生根本變化，本實(shí)驗(yàn)對(duì)其中主要有效成分——大黃酚、大黃素甲醚、大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、小檗堿、黃芩苷，用薄層色譜二次展開(kāi)法進(jìn)行了定性鑒別[7]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人滿意，方法亦較為簡(jiǎn)單，為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供了一種較為可靠的依據(jù)。

1　儀器與試藥

1.1實(shí)驗(yàn)儀器

WHF-203B三用紫外分光光度計(jì)(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)，As3120超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)，AB135-s梅特勒-托利多B-S系列天平(瑞士METTLER TOLEDO)。

1.2試劑與樣品

試劑：甲醇(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)，正己烷(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)，丁酮(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，乙酸乙酯(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)，甲酸(分析純，天津市津沽工商實(shí)業(yè)公司)，蒸餾水，硅膠GF254(化學(xué)純，青島海浪硅膠干燥劑廠，批號(hào)140506)，羧甲基纖維素鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20140619)。

供試品：三黃片樣品1-1、1-2、1-3(湖北襄陽(yáng)隆中藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)121107、121224、130211，規(guī)格0.25 g/片)，三黃片樣品2-1、2-2、2-3(邯鄲摩羅丹藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)00613096、00613045、00613058，規(guī)格0.25 g/片)，三黃片樣品3-1、3-2、3-3(新鄉(xiāng)佐今明制藥股份有限公司，批號(hào)130926、130816、140224，規(guī)格0.25 g/片)。

對(duì)照品：大黃對(duì)照藥材(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)120984-201202)，黃芩對(duì)照藥材(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)120955-201309)，鹽酸小檗堿對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)20131219)，黃芩苷對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)ZN114LA13)，蘆薈大黃素對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)20131112)，大黃酸對(duì)照品批號(hào)(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)HS0905KA13)，大黃素對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)20131203)，大黃酚對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)20130320)，大黃素甲醚對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)20130629)。

2　試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱(chēng)定蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚5種對(duì)照品適量，于容量瓶中加甲醇配制成每1 mL含1 mg的對(duì)照品溶液；取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg鹽酸小檗堿的對(duì)照品溶液；取黃芩苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg黃芩苷的對(duì)照品溶液；取大黃對(duì)照藥材0.2 g，加甲醇3 mL，超聲處理10 min，濾過(guò)，取濾液作為大黃對(duì)照藥材溶液；取黃芩對(duì)照藥材0.2 g，加甲醇3 mL，超聲處理10 min，濾過(guò)，取濾液作為黃芩對(duì)照藥材溶液。

2.2供試品溶液的制備

取三個(gè)不同廠家不同批次的三黃片各5片，除去包衣，于研缽中研磨成細(xì)粉，精密稱(chēng)定細(xì)粉約0.25 g，加甲醇5 mL，超聲處理10 min，濾過(guò)，取濾液作為供試品溶液。

2.3藥典方法

參照薄層色譜法(2015年版藥典第四部)實(shí)驗(yàn)，吸取供試品溶液、鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液、黃芩苷對(duì)照品溶液3種溶液各3～5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以乙酸乙酯、丁酮、甲酸、水(10∶7∶1∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，分別在365 nm和254 nm紫外光燈下檢視。供試品色譜中，在與鹽酸小檗堿對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，365 nm紫外光下顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；在與黃芩苷對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，254 nm紫外光下顯相同顏色的斑點(diǎn)。

再以環(huán)己烷、乙酸乙酯、甲酸(12∶3∶0.1)為展開(kāi)劑，對(duì)三黃片中大黃的5種成分進(jìn)行分離，用供試品溶液、5種成分混合溶液、大黃酸對(duì)照品溶液、大黃酚對(duì)照品溶液、大黃素甲醚對(duì)照品溶液、蘆薈大黃素溶液依次點(diǎn)樣，展開(kāi)30 min后，取出，晾干。將薄層板放置在365 nm紫外光燈下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素成分未顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)。結(jié)果(見(jiàn)圖1 )顯示，三黃片三種成分——大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素，未分離出來(lái)。

圖1　供試品在紫外燈下的薄層色譜圖

2.4薄層色譜法實(shí)驗(yàn)條件

在室溫為11 ℃、相對(duì)濕度為40%的條件下，用毛細(xì)管分別吸取對(duì)照品和標(biāo)準(zhǔn)品各3～5 μL點(diǎn)樣。點(diǎn)樣順序?yàn)椋汗┰嚻啡芤海?種成分混合溶液(大黃酚、大黃素甲醚、大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素)，7種成分混合溶液(大黃酚、大黃素甲醚、大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、小檗堿、黃芩苷)，大黃藥材粉末溶液，黃芩藥材粉末溶液，小檗堿對(duì)照品溶液，黃芩對(duì)照品溶液。然后，以正己烷、乙酸乙酯、甲酸(30∶10∶0.5)為展開(kāi)劑，對(duì)三黃片中大黃的5種成分進(jìn)行分離。30 min后，將薄層板取出，測(cè)量其展距約為13 cm。晾干后，再進(jìn)行二次展開(kāi)，以乙酸乙酯、丁酮、甲酸、水(10∶7∶1∶1)為展開(kāi)劑，分離黃芩苷和小檗堿，展至三黃片中大黃最后1種成分蘆薈大黃素之前取出，展距約為5 cm。將薄層板取出，放在通風(fēng)櫥內(nèi)晾干，在波長(zhǎng)為365 nm和254 nm的紫外光燈下檢視。另外，采用不同的檢視方法，將薄層板置氨蒸氣熏后，預(yù)平衡15 min，取出，熱風(fēng)吹干，展開(kāi)劑并至無(wú)氨臭。最后，噴以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%三氯化鐵乙醇溶液。

2.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將薄層板放置在365 nm紫外光燈下檢視，可以觀察到供試品溶液色譜中，三黃片中大黃的5種成分和小檗堿在與對(duì)照品溶液以及大黃對(duì)照藥材溶液色譜相對(duì)應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，表明三黃片供試品溶液中大黃的5種成分以及小檗堿都能較好地分離。同樣，將薄層板置254 nm紫外光燈下檢視，能看到供試品溶液色譜中的黃芩苷，在與對(duì)照品溶液以及黃芩對(duì)照藥材溶液相同的位置上顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)，結(jié)果表明，三黃片供試品溶液中，小檗堿和黃芩苷分離得相對(duì)比較好。再分別對(duì)三黃片三個(gè)不同廠家不同批次樣品進(jìn)行鑒別，其結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3、圖4。

圖2　供試品1在紫外燈下的薄層色譜圖

圖3　供試品2 在紫外燈下的薄層色譜圖

圖4　供試品3 在紫外燈下的薄層色譜圖

在供試品色譜圖中，在與大黃對(duì)照品溶液以及對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)的位置上，供試品溶液的5種成分也顯相同顏色的紅色斑點(diǎn)。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%三氯化鐵乙醇溶液對(duì)其進(jìn)行噴灑，可觀察到供試品色譜圖中，在與黃芩對(duì)照藥材溶液以及對(duì)照品溶液色譜圖相對(duì)應(yīng)的位置上，黃芩苷與其顯相同顏色的斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5　供試品3在紫外燈下的薄層色譜圖

3　討論與小結(jié)

3.1實(shí)驗(yàn)討論

先用藥典方法對(duì)大黃的5種成分進(jìn)行單個(gè)分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大黃的3種成分(大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素)未分離出來(lái)。因?yàn)槎握归_(kāi)的方法比藥典方法更為簡(jiǎn)單，更易觀察和比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以重新探索分離大黃的方法很有必要。

試驗(yàn)中，最初選擇的展開(kāi)劑為石油醚(60～90 ℃)、甲酸乙酯、甲酸、水(15∶5∶3∶1)，大黃分離較好，黃芩苷和小檗堿無(wú)分離。原因可能是石油醚比例太大，后使用石油醚(60～90 ℃)、甲酸乙酯、甲酸、水(10∶7∶3∶1)為展開(kāi)劑，大黃和小檗堿被成功分離，但黃芩苷仍無(wú)分離。據(jù)三黃片中有效成分的薄層色譜測(cè)定，進(jìn)行點(diǎn)樣。點(diǎn)樣順序?yàn)槿S片供試品溶液、7種成分混合溶液(大黃酚、大黃素甲醚、大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、小檗堿、黃芩苷)、黃芩苷對(duì)照品溶液。先用二氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸(75∶25∶1.5)展開(kāi)分離大黃，12 min后拿出晾干，分別置365 nm和254 nm紫外光燈下檢視，發(fā)現(xiàn)黃芩苷停在原點(diǎn)。再用氯仿、乙酸乙酯、甲醇、甲酸(7∶3∶1∶1)分離小檗堿和黃芩苷，發(fā)現(xiàn)7種成分混合溶液只有一個(gè)點(diǎn)、黃芩苷仍無(wú)分離。經(jīng)分析認(rèn)為，可能是展開(kāi)劑中二氯甲烷不合適。再以乙酸乙酯、丙酮、甲酸、水(10∶7∶1∶1)為展開(kāi)劑進(jìn)行二次展開(kāi)，分別在365 nm和254 nm紫外光燈下檢視，發(fā)現(xiàn)大黃分離不明顯、黃芩苷有分離。

繼續(xù)探索展開(kāi)劑。以正己烷乙、酸乙酯、甲酸(30∶10∶0.5)為展開(kāi)劑，分離大黃，用供試品溶液、5種成分混合溶液、大黃酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液、大黃酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液、大黃素甲醚標(biāo)準(zhǔn)品溶液、蘆薈大黃素標(biāo)準(zhǔn)品溶液依次點(diǎn)樣，結(jié)果顯示：供試品溶液、5種成分混合溶液、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素分離較好?？梢缘弥?，大黃全成分從上到下順序依次為大黃酚、大黃素甲醚、大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素。另以乙酸乙酯、丙酮、甲酸、水(10∶8∶1∶1)為展開(kāi)劑，用供試品溶液、小檗堿對(duì)照品溶液、黃芩苷對(duì)照品溶液序依次點(diǎn)樣，展開(kāi)，分別在365 nm和254 nm紫外光燈下檢視，結(jié)果顯示：大黃被推至前沿，小檗堿分離較好，黃芩苷沒(méi)有分離出來(lái)。原因可能是丙酮的極性大，所以縮小丙酮的比例，以乙酸乙酯、丙酮、甲酸、水(10∶7∶1∶1)為展開(kāi)劑，分別在365 nm和254 nm紫外光燈下檢視，再用供試品溶液、小檗堿對(duì)照品溶液、黃芩苷對(duì)照品溶液依次點(diǎn)樣，結(jié)果顯示：小檗堿分離較好；黃芩苷剛開(kāi)始有分離，但不明顯，放置一段時(shí)間后斑點(diǎn)近乎消失。再以乙酸乙酯、丙酮、甲酸、水(5∶3∶1∶1)為展開(kāi)劑，用供試品溶液、小檗堿對(duì)照品溶液、黃芩苷對(duì)照品溶

液依次點(diǎn)樣，分別在365 nm和254 nm紫外光燈下檢視，結(jié)果顯示：供試品、小檗堿、黃芩苷有了較好的分離。噴以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%三氯化鐵乙醇溶液,在與黃芩苷對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

3.2實(shí)驗(yàn)小結(jié)

最后確定，先以正己烷、乙酸乙酯、甲酸(30∶10∶0.5)為展開(kāi)劑，再以乙酸乙酯、丁酮、甲酸、水(10∶7∶1∶1)為展開(kāi)濟(jì)，進(jìn)行二次展開(kāi)，并分別對(duì)三個(gè)不同廠家的三批三黃片進(jìn)行了鑒別。結(jié)果顯示，三黃片中7種有效成分分離都較好，在與對(duì)照品色譜以及對(duì)照藥材溶液相應(yīng)的位置上都顯相同顏色的斑點(diǎn)。試驗(yàn)證明，該方法簡(jiǎn)便易行，斑點(diǎn)分離清晰，重現(xiàn)性好，可用于三黃片有效成分的薄層鑒別。

[1] 中藥成方制劑(第12 冊(cè))：WS3-B-2278-97[S]. 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì)，1998.

[2] 王秀，阮正國(guó). 三黃片的研究進(jìn)展[J]. 中成藥，1994,16(2):44.

[3] 潘勇. 三黃片的新用途[J]. 開(kāi)卷有益—求醫(yī)問(wèn)藥，2006,19(4):39.

[4] 葛金玉. 三黃片臨床新用舉隅[J]. 新疆中醫(yī)藥，1997,15(3):55.

[5] 李琦，張文元. 紅黃膏治愈膿皰瘡48 例[J]. 中醫(yī)藥研究，1994(2):41.

[6] 張文元，辛勇，曹志春. 中西醫(yī)結(jié)合治療膿皰瘡102例[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，1996,16(2):106.

[7] 王潔，張一鳴，李進(jìn)冉，等. 市售三黃片中大黃素和大黃酚的含量測(cè)定及相關(guān)分析[J]. 河北理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2009,31(2):93-99.

[責(zé)任編輯段金卯]

The identification of active ingredients three yellow tablets by TLC

1. Institute of Materia Medica, Henan University, Henan Kaifeng 475004, China; 2. Pharmacy Department, The Children Hospital of General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China; 3. Engineering Research Center for Nanomaterials of Henan University, Henan Kaifeng 475004, China; 4. Tianjin Tasly Modern Tcm Resources CO. LTD, Tianjin 300402, China

〔Objective〕To explore the method of secondary separation of the TLC and to identify the seven kinds of effective components in Sanhuang tablets.〔Methods〕To explore the method of secondary separation of the TLC and to identify the seven kinds of effective components in Sanhuang tablets.〔Results〕The testing solution of Sanhuang tablet and the reference substance both showed the same color spots in the same position by TLC.〔Conclusion〕The experiments indicate: According to the image of TLC, the TLC is Spot sharp edges, reliable and specific method with good reproducilility, to be used identification for the seven kinds of effective components in Sanhuang tablets.

Sanhuang tablets; components identification; TLC

1672-7606(2016)02-0081-04

2016-03-17

NSFC-河南人才培養(yǎng)聯(lián)合基金資助項(xiàng)目(U1304826)；河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(152102310077)

李蒙蒙(1992-)，女，河南駐馬店人，碩士，從事中藥新劑型與新技術(shù)工作。

宗蘭蘭(1989-)，女，河南開(kāi)封人，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師，從事納米材料研究工作。

TQ460.72

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